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aula microscopia - http://cpma.comunidades.net

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MICROSCOPIA
Prof. Antônio Francisco do Carmo.
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Conceitos fundamentais da microscopia
O olho humano tem poder de resolução de aproximadamente 0,1 mm (100 m) 
Se olharmos dois pontos separados por uma distância menor que 100 m, esses pontos aparecerão como um ponto único 
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Dimensões de estruturas vivas
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Tipos de Microscópios
Microscópios Óticos 
 	Usam feixe de luz e lentes ópticas de cristal para produzir a imagem
Microscópios Eletrônicos
 Usam feixe de elétrons e lentes eletromagnéticas para produzir a imagem
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Microscópio simples ou lente de aumento usada por Anton von Leeuwenhoek 	1675 
Microscópios Óticos Simples 
Primeiras descrições de protozoários, bactérias, e de espermatozóides – chamados por ele de “animáculos”. 
Aumento de 200 x
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Microscópios Óticos compostos
Final do século XIX
Microscópio monocular inventado pelo britânico Robert Hooke por volta de 1690
Microscópio binocular
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ALTERAÇÕES DA IMAGEM: ABERRAÇÕES
ABERRAÇÃO CROMÁTICA: 
Alteração da imagem devida à decomposição da luz – refração -dando anéis com cores diferentes no campo microscópico observado
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ABERRAÇÃO ESFÉRICA
As imagens são focadas no centro e desfocadas na periferia do campo
A aberração esférica ocorre porque os raios de luz incidentes próximos da borda das lentes são muito mais refratados do que os raios que incidem próximos ao eixo óptico. Em vez de se refratar no ponto focal, os raios se refratarão na frente ou atrás dele, formando, ao redor do ponto focal, um halo luminoso concêntrico que altera a qualidade da imagem.
 
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Microscópio Ótico Composto Atual
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A imagem da amostra é obtida quando os raios de luz de um iluminador ( fonte de luz) passam através de um condensador, que possuem lentes que dirigem os raios de luz através da amostra. Em seguida os raios de luz passam para as lentes objetivas. A imagem da amostra é novamente ampliada pela lente ocular, junto aos olhos
Microscópio ótico composto
Formação da Imagem
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Esquema da Formação da Imagem
AMPLIAÇÃO TOTAL = Aumento da Objetiva X Aumento da Ocular
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É a Capacidade do sistema em distinguir objetos que estão muito próximos. Ou seja a capacidade de “resolver” os detalhes dessa imagem
PODER DE RESOLUÇÃO 
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O Limite de resolução depende do comprimento de onda (λ) da radiação utilizada e da abertura numérica (AN) das lentes utilizadas.
 
Limite de Resolução =___________________________
 AN objetiva + AN condensador
Limite de Resolução 
O limite de resolução (LR) pode ser definido como a distância mínima entre dois pontos de modo que as respectivas imagens, fornecidas pelo sistema óptico, sejam distintas.
O limite de resolução é inverso do poder resolvente, isto é, quanto menor o limite de resolução de uma lente objetiva, maior é o seu poder de resolução.
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 Comprimento de onda no espectro de luz ()
LUZ VISÍVEL LUZ ULTRAVIOLETA
0,4 m <  < 0,7 m 0,18 m <  < 0,4 m
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO UNIDADES
 Feixe de elétrons < 0.05 Ao 	 1m = 10-3mm		 1Ao = 10-4 m
			 1nm = 10-3m
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ABERTURA NUMÉRICA
 AN= n. sen 
 
ONDE :
 n = índice de refração do meio entre a lente frontal e o objeto 
 = semi-ângulo formado pelo eixo óptico.
n = 1  quando o meio é o ar, se emprega objetivas a seco
n =1,52  quando o meio é o óleo de imersão e se emprega objetiva de imersão
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Valores de Abertura Numérica
Com objetivas a seco
O valor de α não excede na prática 72º (sen 72 = 0,95), o valor máximo da abertura numérica com uma objetiva a seco é 0,95, já que para o ar n = 1,0. 
Com objetiva de Imersão
Esta objetiva é usada com o óleo de imersão interposto entre a lâmina de vidro e a objetiva. É a objetiva que exige maiores cuidados na sua utilização, pois foca muito próximo do material a observar
 
O valor do índice de refração é assim especialmente importante na determinação da abertura numérica. A vantagem de utilizar o óleo de imersão é que este possui um índice de refração de 1,52 o qual é semelhante ao do vidro 
 Por isso evita a dispersão dos raios luminosos quando atravessam o conjunto lâmina-óleo, permitindo a entrada de um grande cone de luz na objetiva . A abertura numérica com essa objetiva pode ser maior que 1. (1,2 a 1,4)
Como foi referido conseguem-se valores de LR próximos de 0,2 μm. 
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Objetiva a seco
Objetiva de Imersão
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 Para o olho humano, o limite de resolução é de, sensivelmente, 0,1 mm. Isto significa que a olho nu apenas conseguimos distinguir objetos distanciados entre si até 0,1 mm.
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Microscopia ótica - sistema de lentes para direcionar o caminho que o feixe de luz percorre entre o objeto a ser estudado e o olho. Os principais tipos são: Microscopia luminosa, de campo escuro, de ultravioleta, de fluorescência e de contraste de fase 
Microscopia eletrônica - Feixe de elétrons controlado por um sistema de campo magnético. Os principais tipos são: Microscopia eletrônica de transmissão (TEM); Microscopia eletrônica de varredura (SEM) 
TIPOS DE MICROSCOPIA
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MICROSCOPIA ÓTICA
a) Microscopia de campo claro
A área observada aparece brilhantemente iluminada (clara) e os objetos estudados mais escuros contra
 
 
 
 
APLICAÇÃO 
Na determinação de elementos morfológicos grosseiros de microrganismos
No estudo de motilidade e reprodução em microrganismos maiores (protozoários)
 
Bactérias coradas pelo 
método de Gram
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A luz dispersada entra na objetiva e o objeto aparece iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Isso se consegue pela utilização de um tipo especial de condensador que ilumina o objeto obliquamente. 
Torna possível a visualização de partículas ou objetos muito pequenos, que não podem ser visualizados por microscopia de campo claro.
Mostra com maior clareza o contorno de objetos maiores que são difíceis de se observar porque o índice de refração é próximo ao do meio em que estão suspensos 
É um tipo de microscopia utilizada na observação de microorganismos não corados, suspensos em líquidos – preparações a fresco e em gota pendente. 
b) Microscopia de Campo Escuro
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Aplicação
Na determinação de certas bactérias, por exemplo as espiroquetas 
Requerimentos: condensadores especiais, óleo de imersão 
 
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Grande parte dos detalhes de células vivas não são detectados no microscópio de campo luminoso devido ao fato de as estruturas celulares serem transparentes e incolores, não apresentando contraste suficiente. 
O microscópio de contraste de fase tem um sistema óptico especial que torna possível a distinção de materiais biológicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus índices de refração. 
A luz que passa através de materiais com densidades ligeiramente diferentes é refratada ou desviada do seu trajeto original. 
Variações mínimas de fase, devidas às diferenças de índice de refração dentro do objeto, são ampliadas e transformadas em mudanças de amplitude (intensidade) as quais são visualizadas como diferenças de contraste na imagem. 
 
c) Microscópia de contraste de fase 
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Aplicação
aplicado na visualização de características estruturais com diferenças muito sutis no seu índice de refração
células únicas contidas em espécimes muito finos (< 5 µm) e não coloridos, que são muito pobres em contraste
Requerimentos: objetivas especiais, condensadores especiais. 
 
 
 
 Corte transversal de um osso
Espécime de fase fina 
 
 
 Neurônios
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 d) Microscopia de Ultravioleta
Utiliza luz ultravioleta 0,18 m <  < 0,4 m 
Permite melhorar o limite de resolução comparativamente ao microscópio de campo luminoso.
A óptica é constituída por lentes de quartzo já que o vidro não transmite este tipo de radiação. 
 
A imagem é registrada numa câmara fotográfica pelo uso de um conversor de imagem ou pela projeção numa tela de televisão
Aplicação
 Diferenciação de componentes celulares que absorvem a luz ultravioleta
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e) Microscópia de fluorescência 
Fluorescência ===> propriedade de algumas substâncias que após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda (ultravioleta), emitirem radiação de maior comprimento de onda. 
Quando microrganismos com um fluorocromos (corantes fluorescentes) são examinados com microscópio de fluorescência, com uma fonte de luz ultravioleta, parecem luminosos, brilhantes contra um fundo escuro.
 
 
Requerimento: microscópio ótico, luz ultravioleta, filtro adequados 
 Pode usar substâncias química fluorescentes (fluorocromos)
 
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Proteínas fluorescentes
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MICROSCOPIA ELETRÔNICA 
O primeiro microscópio foi construído em 1931, na Universidade Técnica de Berlim, por Max Knoll e Ernst Ruska. 
 Ao invés de utilizar lentes de vidro o ME utiliza lentes eletromagnéticas
 
 Emprega um feixe de elétrons em vez de lentes óticas
 Os Elétrons acelerados por diferença de potencial de 50 000 a 100 000 volts têm um comprimento de onda cerca de 100. 000 vezes menor que o da luz visível. 
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 Com o valor de λ reduzido o poder de resolução é muito maior que do m.o. 
 O limite de resolução do microscópio eletrônico de transmissão atinge 
 0,4 a 0,5 nm (excepcionalmente 0,2 nm) 100 vezes maior microscópio óptico
Tipos de Microscopia Eletrônica:
Microscopia eletrônica de Transmissão (TEM)
Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
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Imagem no Microscópio Eletrônico
 a) Microscópio de transmissão b) Microscópio de varredura 
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Microscópio eletrônico de transmissão (TEM) 
A parte essencial do microscópio eletrônico de transmissão é uma coluna vertical a qual é percorrida por um feixe de elétrons. 
Na parte superior da coluna existe uma fonte de elétrons, o canhão eletrônico. No canhão eletrônico existe um gerador de elétrons que é frequentemente um filamento de tungstênio.
 A voltagem aplicada entre o filamento e o ânodo situa-se entre 40 000 e 100 000 V e provoca a aceleração dos elétrons 
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Microscópio eletrônico de transmissão (TEM) 
Além do canhão eletrônico, a coluna é constituída por uma ou mais lentes condensadoras, uma lente objetiva, uma ou mais lentes intermediárias, uma lente projetora, um porta objetos em platina móvel, uma câmara fotográfica entre outros.
 
As lentes do microscópio eletrônico são de natureza eletromagnética, sendo constituídas por uma bobine, formada por milhares de voltas de fio, através da qual passa uma corrente elétrica.
 Enquanto que no microscópio óptico a focagem da objetiva faz-se pelo deslocamento mecânico da lente ou do objeto, no microscópio eletrônico a focagem é feita por variação da corrente que passa na bobine, a qual afeta a distância focal da objetiva. A variação da ampliação é feita por variação da distância focal das lentes intermédias. 
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Microscopia eletrônica de varredura ou de exploração (MEV ou SEM) 
No MEV pode ser ampliado de 10 a 100 000x 
Apresentar uma grande profundidade de focagem o que permite estudar a topografia da superfície de objetos sólidos e obter imagens tridimensionais 
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