Aula Pratica 10 Exames coproparasitologicos (1)

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Aula Prática – Exames copro-parasitológicos
1. Colheita das fezes 
Seguem abaixo algumas recomendações importantes para a colheita de fezes destinadas a exames copro-parasitológicos:
As fezes devem ser, de preferência, recentes. Recomenda-se que não tenham entrado em contato com o solo devido à grande possibilidade de contaminação do material por nematóides de vida livre.
1.1. Ruminantes e eqüinos
Para retirar as fezes diretamente do reto, utiliza-se uma luva de procedimento descartável ou um saco plástico massageando-se as paredes retais. A luva ou saco plástico são invertidos, amarrados e, após a retirada do ar, usados como recipientes de transporte. Caso não seja possível a colheita diretamente do reto, colher imediatamente após a defecação a porção do material fecal que não tenha entrado em contato com o solo.
Amostragem. Deve representar o rebanho quantitativa e qualitativamente. Amostrar diversos animais do plantel, considerando-se sua idade, estado nutricional e possíveis diferenças de manejo.
Quantidade da amostra: 30 a 50 gramas de fezes.
Identificação. Todos os dados sobre o animal (espécie, nome ou no, data, propriedade, etc.) deverão ser anotados no recipiente. Estas informações poderão também ser descritas em folha separada, anotando-se apenas o nome ou no do animal correspondente no saco plástico com caneta de retroprojetor.
1.2. Cães e gatos
As fezes deverão de preferência ser coletadas a partir de um superfície limpa (jornal, azulejo) sobre a qual o animal tenha defecado. Alternativamente, colher as fezes da porção mais superior que não tenha entrado em contato com o solo. Utilizar saco plástico ou coletor universal.
Quantidade: 5 a 10 gramas
Identificação: colocar etiqueta no coletor e anotar a espécie, raça, nome, sexo e idade do animal.
2. Conservação das fezes
2.1. Conservação a frio
Armazenar os sacos plásticos com as amostras de fezes num recipiente de isopor com gelo em escamas ou contendo gelo reciclável, alternando-se o material em camadas. As fezes poderão ser conservadas por 24 a 48 horas. Amostras de cães e gatos também podem ser conservadas no refrigerador por um período máximo de 48 horas.
2.2. Conservação química
Conservantes químicos são utilizados quando o tempo decorrente entre a colheita do material e seu envio ao laboratório for maior que 48 horas, ou quando inexistirem condições de conservação a frio. Alternativas:
Para a conservação de ovos e larvas de helmintos pode-se utilizar formol a 10% ou formol-glicerina 5% (na proporção de 1:1). 
Fezes para a pesquisa de oocistos de coccídias devem ser conservadas em bicromato de potássio a 2% ( na proporção de 1:1)
Fezes para a pesquisa de formas trofozoítas e cistos de protozoários devem ser conservadas utilizando-se como líquido conservador o MIF ou líquido de Schaudin (na proporção de 1 parte de fezes para 3 partes do conservante).
Solução MIF
Thimerosal 1:1000.................................. 200ml
Água destilada........................................ 200ml
Formol ................................................... 25ml
Glicerina ................................................ 5ml
3. Métodos para diagnóstico copro-parasitológico
O processamento de material fecal para exames parasitológicos visa dois principais objetivos:
Clarificar o material a ser examinado para permitir uma fácil diferenciação entre os parasitas e os debris;
Concentrar as formas dos parasitas (cistos, oocistos de coccídias, ovos e larvas de helmintos) para aumentar a sensibilidade e reduzir o número de campos microscópicos necessários para o exame.
A escolha do método coprológico a ser utilizado depende, entre outros fatores, da espécie animal, aspecto qualitativo ou quantitativo e principalmente da suspeita clínica. Nas aulas práticas anteriores abordamos os métodos de exame direto, flutuação em sal (Willis) e contagem de ovos em câmara de MacMaster. Nesta aula serão abordados os seguintes métodos:
Método de concentração por sedimentação espontânea (método de Hoffmann)
Método de Baermann modificado 
Coprocultura - Técnica de Roberts e O’ Sullivan 
�3.1. Método de concentração por sedimentação espontânea – Método de Hoffmann
Objetivo 
Identificação genérica de ovos e larvas de nematóides e trematóides gastrintestinais. 
Princípio 
A técnica de sedimentação é um teste qualitativo para a detecção de ovos e larvas de helmintos. É uma técnica útil para ensaios preliminares visando identificar que grupos de parasitas estão presentes em uma amostra. Apresenta a vantagem de recuperar ovos e larvas das fezes, sobretudo ovos pesados de trematóides e de espirurídeos, os quais se sedimentam mesmo quando se emprega a técnica de flutuação em sal. 
Por serem pesados, ovos e larvas são sedimentados espontaneamente, lavados e concentrados e em seguida examinados. 
Material
2 a 3g de fezes
Copo de plástico 
Cálice cônico 
Peneira ou coador 
Gaze
Bastão de vidro ou palito de sorvete
Pipetas Pasteur com pêra de borracha 
1 litro de água 
Técnica
Misture no copo plástico uma pequena quantidade de fezes (2 a 3 gramas) com 20 a 30 ml de água e homogenize bem com um bastão de vidro ou palito.
Transfira a suspensão para o cálice cônico filtrando-a com o auxilio de uma peneira de chá recoberta com gaze. 
Despreze o material presente no coador em seguida adicione água no cálice cônico onde ocorrerá a sedimentação espontânea dos ovos e larvas. 
Após 30 minutos recolha o sedimento com uma pipeta Pasteur, coloca-se o líquido entre lâmina e lamínula. 
Observe a lâmina ao microscópio com uma objetiva de 10x e, posteriormente, mude para a objetiva de 40X. 
A inspeção da lâmina deverá ser feita escolhendo-se um canto e então movendo-se a lâmina para ao canto oposto, em um movimento de ida e volta, procurando sobrepor parcialmente os campos microscópicos. 
Alternativamente, se o sobrenadante estiver muito sujo, este pode ser desprezado com cuidado, para não perder o sedimento. Em seguida, adiciona-se água novamente aguardando-se mais 30 minutos. Este processo de lavagem facilita o exame microscópico e pode ser repetido de 30 em 30 minutos ou mais. 
�3.2. Método de Baermann, modificado
Objetivo
Detecção e identificação de larvas de nematóides nas fezes.
Princípio
Baseia-se no termotropismo, hidrotropismo e geotropismo das larvas.
Material
Fezes: 3 - 5g
Gaze cortada e dobrada
Prendedor
Palito de sorvete ou bastão de vidro
Tubo cônico
Técnica
Colocar as fezes no centro da gaze e envolver o material, formando um saquinho.
Prender o saquinho na parede do tubo cônico com o auxílio do prendedor. 
Adicionar água a 45º C pelas paredes do cálice, até encobrir completamente o saquinho com as fezes.
Deixar, de preferência, de um dia para o outro (“overnight”), ou esperar no mínimo 2 a 3 horas. Durante a aula prática esperaremos de 30 minutos a 1 hora. 
Coletar o material do sedimento do tubo cônico com uma pipeta Pasteur, colocar entre lâmina e lamínula, e examinar ao microscópio com objetiva de 10x.
3.3. Coprocultura – Técnica de Roberts e O’ Sullivan
Objetivo
Identificação genérica de nematóides gastrintestinais através da morfologia das larvas 
Princípio
Incubação de ovos de helmintos presentes nas fezes até sua eclosão e liberação das larvas dos nematóides
Material
20-30g de fezes
serragem de madeira de pinho esterilizada ou vermiculita
recipiente de vidro (250-300ml)
bastão de vidro
borrifador
placas de Petri
pipetas de Pasteur com pêra de borracha ou conta-gotas
tampas com furos ou papel alumínio perfurado ou gaze
vidro de relógio
Técnica:
Preparo da coprocultura
Em um recipiente de vidro, misturar as fezes com a vermiculita ou serragem, na proporção de cerca de duas partes de vermiculita para uma de fezes. A mistura deve ficarhomogênea e solta. 
Borrifar a cultura com água, se necessário.
Identificar o frasco com a número do animal e a data.
Cobrir o frasco com gaze, ou papel alumínio perfurado, ou com a própria tampa do frasco com furos, para entrada de ar.
Incubar em estufa, à temperatura de 25º a 27º C, durante 7 dias ou deixar no ambiente por 10 dias.
Verificar diariamente o grau de umidade da cultura e borrifar água, se necessário.
Colheita das larvas 
Transcorrido o período de 7 dias na estufa ou 10 dias no meio ambiente, faz-se a colheita das larvas, da seguinte maneira:
Encher o frasco de cultivo com água à temperatura de 45º C até a borda.
Tampar o frasco com placa de Petri, invertendo-se bruscamente, para evitar que a água derrame.
Colocar água (também a 45º C) até a metade da placa de Petri
Após 12 horas, retirar com pipeta Pasteur o conteúdo da Placa de Petri, transferindo-o para um vidro de relógio e observar em lupa. 
Transferir um ou duas gotas do líquido em uma lâmina, adicionar lugol para matar e corar as larvas, acrescentar uma lamínula e proceder à identificação microscópica das larvas.
Identificação das larvas infestantes dos nematódeos gastrintestinais: 
Elementos que geralmente são levados em consideração para a identificação das larvas: 
Tamanho da larva 
Presença ou não de bainha
Tipo caudal 
Espaço entre a ponta da cauda da larva e a ponta da cauda da bainha 
Número e tipo de células intestinais (difícil visualização) 
Para a tipificação imediata das larvas infestantes devemos inicialmente agrupá-las de acordo com o comprimento da cauda e da bainha: 
Larvas de cauda curta: Trichostrongylus e Ostertagia 
Larvas de cauda média: Bunostomum, Haemonchus e Cooperia 
Larvas de cauda longa: Oesophagostomum, Nematodirus e Chabertia
Oesophagostomum
Cooperia
Haemonchus
Bunostomum
Ostertagia
Trichostrongylus