MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MICRORGANISNOS INDICADORES

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Saúde & Ambiente em Revista, Duque de Caxias, v.1, n.1, p.09-13, jan-jun 2006 
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MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MICRORGANISNOS INDICADORES
Autor: Michele Almeida da Cunha
Orientador: Marilene Rodrigues e Silva 
Resumo
A contaminação de alimentos por microrganismos, a sua proliferação em termos de saúde publica e a preocupação em desenvolver métodos 
de controles em empresas alimentícias vem a muito tempo crescendo no mundo todo. O alimento por si próprio é um meio de cultura exce-
lente para a proliferação de microorganismos. E é através destes microrganismos que podemos avaliar o grau e a procedência da contami-
nação, bem como o período previsto para o consumo do alimento antes da sua deterioração. Tem-se, portanto, tornado normal a prática de 
analisar nos alimentos a existência de bactérias produtoras de toxinfecções alimentares. Estas bactérias são denominadas microrganismos 
indicadores e são geralmente consideradas como sendo de grande significância quando da avaliação da segurança e qualidade microbioló-
gicas de alimentos. Tal identificação só é possível através de alguns métodos de análises, onde destacamos a importância da amostragem 
e da preparação da amostragem para um diagnóstico preciso e confiável perante aos padrões exigidos pelos órgãos oficiais. 
Palavras-chave: Microrganismos indicadores; contaminação e segurança alimentar.
Abstract
The food contamination by microorganisms, its proliferation in terms of public health and the preoccupation of development controls 
methods in food companies are growing in the all world a long time. The food is an excellent culture ambience for microorganisms proli-
feration. We can evaluate the degree and the contamination origin through these microorganisms, as well a period foreseen for the food 
contamination before its deterioration. 
However, it has become normal practice to analyze in food an existence of bacterium that produces alimentary toxinfections. The bacterium 
is called indicative microorganism and it is generally considered as being of great importance when evaluates of the microbiological security 
and quality food. Such identification is possible only through some analyze methods, where we detach the importance of the sampling and 
of the sampling preparation for a precise and trustful diagnostic by standards demanded by official organs.
Keywords: Indicating microorganism; contamination and security alimentary.
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1- Introdução
 Os microrganismos estão intimamente associados com 
a disponibilidade, a abundância e a qualidade do alimento para 
consumo humano. Alimentos são facilmente contaminados com 
microrganismos na natureza, durante manipulação e processa-
mento. Após ter sido contaminado, o alimento serve como meio 
para o crescimento de microrganismos, podendo até mesmo mu-
dar as características físicas, químicas e organolépticas do ali-
mento levando o mesmo a deterioração. (Chan, Krieg & Pelczar, 
1996). 
 Embora as estatísticas brasileiras sejam precárias, acre-
dita-se que a incidência de doenças microbianas de origem ali-
mentar em nosso país seja bastante elevada. Mesmo em países 
desenvolvidos, nos quais o abastecimento de gêneros alimentí-
cios é considerado seguro do ponto de vista de higiene e saúde 
pública, a ocorrência de doenças desta natureza é significante e 
vem aumentando, apesar dos avanços tecnológicos nas áreas de 
produção e controle de alimentos. (Franco, 2003).
 Nos Estados Unidos até a década de 50, a indústria de 
alimentos contava apenas com a análise laboratorial dos lotes 
produzidos para fins de controle de segurança e qualidade. As-
sim, um lote era preparado e, caso a análise demonstrasse que 
apresentava as condições desejadas, era liberado; se não, era re-
tido. Tentando melhorar, a indústria de alimentos adaptou a Boas 
Práticas (BP) da indústria farmacêutica, dando um grande passo 
para melhorar e dinamizar a produção de alimentos seguros e de 
qualidade. Com as Boas Práticas de Fabricação (BPF), começou-
se a controlar, segundo normas estabelecidas, a água, as conta-
minações cruzadas, as pragas, a higiene e o comportamento do 
manipulador, a higienização das superfícies, o fluxo do processo e 
outros itens. (SENAI, 2005).
 Com o tempo foi sendo verificado que a BPF e a análise 
do produto final não garantia 100% de segurança dos alimen-
tos. Este dado foi comprovado com estudos feitos pela NASA ao 
observar que durante os vôos tripulados o principal veículo de 
patógenos para os astronautas eram os alimentos. Assim, a NASA 
junto com o Pilrsbury Co desenvolveu o sistema “Hazard Analysis 
and Critical Control Point” (HACCP), traduzido no Brasil como Sis-
tema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC). 
Este sistema permite levantar os perigos biológicos, químicos e 
físicos significativos que podem ocorrer na produção de um deter-
minado alimento em uma determinada linha de processamento, 
e controlá-los nos Pontos Críticos de Controle (PCC), durante a 
produção (SENAI, 2005).
 Os perigos de natureza biológica incluem bactérias toxi-
gênicas e infecciosas dentre outros. Os perigos de natureza quí-
mica incluem pesticidas, produtos de limpezas enquanto que os 
perigos de natureza física incluem fragmentos de metais pesados, 
vidro, farpas de madeira, pedras, etc. (Franco,2003).
 No Brasil, entre a década de 60 e 70 as BP já eram exi-
gidas, pelo Decreto-lei nº 986, de 21 de outubro de 1969 que 
instituiu normas básicas sobre alimentos. Porém o APPCC só 
foi introduzido no final da década 90 pela portaria do governo 
nº326/SVS/MS de 30 de julho de 1997 que aprova o regulamen-
to técnico; “Condições Higiênico-Sanitárias e de Boas Práticas de 
Fabricação para estabelecimento produtos/ industrializadores de 
alimentos”. Em 2 de janeiro de 2001 a ANVISA (Agência Nacio-
nal de Vigilância Sanitária) aprovou a resolução RDC Nº12, que 
estabelece os Padrões Microbiológicos para alimentos e determi-
na os critérios para a conclusão e interpretações de resultados das 
análises microbiológicas dos alimentos destinados ao consumo 
humano. (ANVISA, 2005).
 O alimento é quem determina qual o microrganismo é 
capaz ou incapaz de se desenvolver. Conhecendo-se as caracterís-
ticas do alimento, podemos, predizer a flora microbiana que nele 
poderá se multiplicar. (SILVA, 2000). Daí se dá a importância da 
análise microbiológica, pois inúmeros métodos laboratoriais po-
dem ser utilizados para investigar a ausência ou presença destes 
microrganismos. (Franco, 2003).
 Cuidados especiais devem ser tomados na colheita de 
amostra para análise microbiológica de alimentos. Desta primeira 
fase de análise, depende, em muito, a validade de interpretação 
dos resultados laboratoriais. (Siqueira, R. S., 1995). Os seguintes 
tópicos são importantes no estudo dos métodos de análise micro-
biológica de alimentos: amostragem, preparação da amostra para 
análise, métodos de contagem de microrganismos e isolamento e 
identificação de patógenos. (Franco, 2003).
2- Microrganismos Indicadores
 Os números e tipos de microrganismos presentes dentro 
ou sobre os alimentos produzidos podem ser usados para avaliar 
com segurança a qualidade microbiológica dos mesmos. A segu-
rança é determinada pela ausência ou presença de microrganis-
mos patogênicos ou suas toxinas, a quantidade do inóculo, e o 
tempo de controle ou destruição desses agentes. Testes para orga-
nismos indicadores podem ser usados para avaliar também a qua-
lidade microbiológica ou segurança quando há uma relação entre 
a ocorrência de um organismo indicador e a provável presença 
de um patógeno ou toxina for estabelecida. (Doyle, Beuchat, & 
Montiville, 1997).
 Alguns critérios devem ser considerados na definição 
de um microrganismo ou grupo de microrganismos indicadores: 
(I) deve ser de rápida e fácil detecção; (II)deve ser facilmente 
distinguível de outros microrganismos da microbiota do alimen-
to; (III) não deve estar presente como contaminante natural do 
alimento, pois assim sua detecção não indicará, necessariamente, 
a presença de matéria fecal ou dos patógenos; (IV) deve estar 
sempre presente quando o patógeno associado estiver; (V) seu 
número deve correlacionar -se com o do patógeno; (VI) deve apre-
sentar necessidades de crescimento e velocidade de crescimento 
semelhantes as do patógeno; (VII) deve ter velocidade de morte 
que seja ao menos semelhante à do patógeno e, se possível, so-
brevivência levemente superior à do patógeno; (VIII) deve estar 
ausente nos alimentos que estão livres do patógeno, ou estar pre-
sente em quantidades mínimas .(XI) ter como hábitat exclusivo o 
trato intestinal do homem e outros animais; (X) deveria ocorrer 
em número muito alto nas fezes; (XI) deveria apresentar alta re-
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sistência ao ambiente extra-enteral; (XII) deveria haver técnicas 
rápidas, simples e precisas para a sua detecção e/ou contagem. 
(Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997).
 Segundo a ICMSF (International Commission on Mi-
crobiological Specifications for Foods) microrganismos indi-
cadores podem ser agrupados em: (I) Microrganismos que não 
oferecem um riscos direto a saúde: contagem padrão de mesófila, 
contagem de psicrotróficos e termófilos, contagem de bolo-
res e leveduras. (II) Microrganismos que oferecem um risco baixo 
ou indireto à saúde: coliformes totais, coliformes fecais, Entero-
coccus, Enterobactériaceae totais e Escherichia coli . (SILVA, 
2002). 
 O uso de Escherichia coli como um indicador de conta-
minação de origem fecal presente em água foi proposto em 1892 
por Teobaldo Smith, uma vez que esse microrganismo é encontra-
do no conteúdo intestinal do homem e animais homeotérmicos. 
(Franco, 2003). 
2.1- Coliformes totais
 Este grupo é composto por bactérias da família Ente-
robacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção 
de gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. São bacilos 
gram-negativos e não formadores de esporos. (Franco, 2003). 
Fazem partes desse grupo predominantemente bactérias perten-
centes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e 
Klebsiella. Destes, apenas a Escherichia coli tem como hábitat 
primário o trato intestinal do homem e animais homeotérmicos. 
Os demais - Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella -, além de 
serem encontrados nas fezes, também estão presentes em ou-
tros ambientes como na vegetação e no solo, onde persistem por 
tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal 
como Samonella e Shigella. Conseqüentemente, a presença de 
coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, conta-
minação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos. (Franco, 
2003).
 
2.2- Coliformes fecais e Escherichia coli
 As bactérias pertencentes a este grupo correspondem 
aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar 
fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas a 
temperaturas de 44-45ºC. (Franco, 2003). Os critérios microbioló-
gicos que envolvem E.coli são úteis quando é desejável determi-
nar se houve contaminação fecal. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 
1997). 
 Atualmente, ao invés de enumerar os coliformes fecais e 
E.coli alguns laboratórios estão preferindo enumerar as bactérias 
pertencentes à família Enterobacteriaceae como um todo, isto 
é, as fermentadoras e não fermentadoras de lactose, pois números 
falsos seriam obtidos ao se verificar apenas a presença de micror-
ganismos fermentadores de lactose, quando a população fosse 
constituída, na sua maioria, por microrganismos não fermentado-
res, incluindo-se aqui as salmonelas lactose-negativas ou outros 
fermentadores tardios desses açúcares. (Franco, 2003)
2.3- Enterococcus
 Essas bactérias, antes um subgrupo do gênero Strep-
tococcus, a partir de 1984 passaram a pertencer ao gênero En-
terococcus, com 19 espécies reconhecidas atualmente. Antes de 
1984, os Estreptococcus fecais eram chamados genericamente 
de enterococos, e consistiam de duas espécies: Streptococcus 
faecalis e Streptococcus faecium. São atualmente denomina-
dos Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. (Franco, 
2003). São relativamente resistentes ao calor e podem sobreviver 
as pasteurizações do leite. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). 
 Algumas restrições quanto a utilização dos Enterococ-
cus como indicadores de contaminação fecal dos alimentos são 
feitas, uma delas seria de encontrarmos em outros ambientes 
além do trato intestinal e apresentarem uma sobrevivência maior 
em relação aos enteropatógenos encontrados no solo, nos vege-
tais e em alimentos, principalmente naqueles submetidos 
à desidratação, ação de desinfetantes e a flutuações de tempera-
tura por serem mais resistentes. (Franco, 2003).
 Apesar das limitações do uso desses microrganismos 
como indicadores de contaminação fecal, sua presença em núme-
ros elevados em alimentos indica práticas sanitárias inadequadas 
ou exposição do alimento a condições que permitiram a multipli-
cação de microrganismos indesejáveis.(Franco, 2003).
3- Métodos de Análise
 Atualmente os métodos de análise são comumente divi-
didos em métodos “convencionais” e métodos “rápidos”. (Franco, 
2003).
 Os métodos convencionais são chamados assim pois fo-
ram desenvolvidos há muitos anos e desde então são utilizados 
como métodos oficiais na maioria dos laboratórios brasileiros e 
também em outros países. (Franco, 2003).
 Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 
70, como conseqüência da necessidade de se abreviar o tempo 
necessário para a obtenção de resultados analíticos e melhorar 
a produtividade laboratorial. Além desses objetivos, esses méto-
dos visam também a simplificação do trabalho e a redução de 
custos. Para alguns métodos, a essas vantagens, aliam-se ou-
tras como maior sensibilidade e especificidade que os métodos 
convencionais.(Franco, 2003).
 Os métodos rápidos aprovados pelos órgãos oficiais, 
podem ser utilizados somente para controle, sendo que resulta-
dos negativos são considerados como definitivos, mas resultados 
positivos considerados como presuntivos devem ser confirmados 
por métodos padrões. (Tese USP, 2002).
 No estudo dos métodos de análise microbiológica de ali-
mentos, a obtenção correta das amostras, seu transporte para la-
boratório e sua preparação para análise são etapas fundamentais 
para o sucesso da análise. Dá execução correta dessas três etapas 
depende a exatidão dos resultados obtidos. (Franco, 2003). 
 A 1º etapa é a da amostragem onde no momento da 
obtenção de uma amostra para
análise, todas as precauções devem ser tomadas para que a 
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amostra obtida seja representativa do produto como um todo. 
Como regra geral, toda amostra deve ser analisada até 36 horas 
após sua obtenção. (Franco, 2003).
 A 2º etapa é a preparação da Amostragem, onde Técni-
cas corretas de preparação de 
uma amostra para análise são indispensáveis. Técnicas assépticas 
devem ser utilizadas em todas as etapas. Uma vez que a distribui-
ção dos microrganismos nos alimentos não é uniforme, uma ho-
mogeneização prévia de toda a amostra é indispensável. A esco-
lha do diluente para homogeneização depende do tipo de produto 
e dos microrganismos a serem pesquisados. (Franco, 2003).
3.1- Contagem de microrganismo psicrófilos e termófilos
 Essas contagens avaliam o grau de deterioração de ali-
mentos refrigerados ou daqueles submetidos a tratamento térmi-
co. (Franco, 2003). 
3.2- Contagem total de microrganismo mesófilos aeróbios
 Está contagem detecta, em um alimento, o número de 
bactérias aeróbias e/ou facultativa e mesófilas (35 - 37° C), pre-sentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada. (Tese USP, 
2002).
 Segundo a ICMSF (International Commission on Mi-
crobiological Specifications for Foods) o número de micror-
ganismo aeróbios e mesófilos (contagem em placa) encontrado 
em um alimento tem sido um dos indicadores microbiológicos da 
qualidade dos alimentos mais comumente utilizados, indicando 
se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante 
o processo de tratamento industrial, transporte e armazenamento 
foram realizados de forma adequada. Esta determinação permite 
também obter informação referente a alteração incipiente dos ali-
mentos, sua provável vida útil, e a falta de controle no desconge-
lamento dos alimentos ou desvios na temperatura de refrigeração 
estabelecida. (Teses USP, 2002). 
Contagem de Bolores e Leveduras
 O crescimento de bolores e leveduras é mais lento do 
que observado em bactéria nos alimentos de baixa acidez e alta 
atividade de água. Portanto dificilmente serão responsáveis pela 
deterioração desses alimentos. Em alimentos ácidos e de baixa 
atividade de água, no entanto, o crescimento de fungos é maior, 
provocando deterioração com grande prejuízo econômico em fru-
tas frescas, vegetais e cereais. (Franco, 2003). 
3.3- Contagem em placas
 O método de contagem de microrganismos em placas é 
um método geral, que pode ser utilizado para contagem de gran-
des grupos microbianos, como aeróbios, mesófilos, aeróbios psi-
crófilos, termófilos, bolores e leveduras, variando o tipo de meio, a 
temperatura e o tempo de incubação. (Tese USP, 2002).
 Por este método, amostras de alimentos são homogenei-
zada, diluídas em séries, em diluente apropriado, plaqueadas com 
ou sobre um meio de ágar apropriado e incubadas, após o que to-
das as colônias visíveis são contadas o procedimento se baseia na 
premissa de que cada célula presente em uma amostra irá formar 
uma colônia separada e visível, quando fixada com meio que lhe 
permita crescer. (Tese USP, 2002).
3.4- Técnica do Número Mais Provável
 A técnica do Número Mais Provável , também chamada 
de técnica dos tubos múltiplos, é outra maneira bastante utilizada 
pelos laboratórios de microbiologia de alimentos para estimar a 
contagem de alguns tipos de microrganismos, como coliformes 
fecais, coliformes totais, E.coli e Staphylococcus aureus.(Teses 
USP, 2002).
 Na técnica do Número Mais Provável, o produto a ser 
analisado, após homogeneização, é submetido a pelo menos três 
diluições decimais seriadas. De cada uma dessas diluições, alíquo-
tas iguais são transferidas para três ou para cinco tubos contendo 
o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gás (tubo de 
Durhan). Todos os tubos são incubados, e em seguida, os positivos 
são identificados. Pelo número de tubos positivos em cada uma 
das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável 
por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de 
Hoskins para três ou para cinco tubos. (Franco, 2003). 
 O NMP é estimado de respostas onde resultados são 
relatados como positivos e negativo em uma ou mais diluições 
decimais da amostra. Por esta técnica pode-se obter informações 
sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), so-
bre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a 
população de coliformes de origem fecal (coliformes fecais). (Te-
ses USP, 2002).
4- Considerações Finais
 A preocupação com a qualidade e segurança dos ali-
mentos é uma questão mundial de saúde pública, pelo fato de po-
dermos ingerir algum tipo de alimento contaminado por micror-
ganismos patogênico. Essa preocupação se amenizou pela criação 
do HACCP que é uma grande ferramenta no controle de qualidade 
dos alimentos produzidos em grande escala pelas industrias.
 O conhecimento dos microrganismos indicadores tor-
nou-se uma ferramenta muito importante pelo fato de identificar 
á fonte da contaminação.
 Os métodos de análise se comprovaram como uma fer-
ramenta eficiente e rápida, pois com a velocidade de produção 
das indústrias estes métodos são grandes aliados para o diag-
nóstico de comprovação de um patógeno e quando dentro dos 
parâmetros estabelecidos são aceitos pelos órgãos oficiais e pela 
comunidade cientifica. 
 
 
5- Agradecimentos
 A Deus, pois sem ele nada é possível. Aos meus pais 
grandes incentivadores desta minha longa caminhada acadêmica. 
Aos professores pela dedicação e paciência, aos meus amigos da 
faculdade com quem compartilho minhas experiências, dúvidas 
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e esperança nesta nova profissão que estou abraçando. A minha 
orientadora professora Marilene Rodrigues e Silva exemplo de 
profissional dedicada, que me orientou brilhantemente neste tra-
balho. 
 
6- Referência Bibliográfica
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