Manual de utilização do Bioedit - Prof. Anderson Alvarenga

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TEORIA	
  E	
  PRÁTICA	
  DA	
  SISTEMÁTICA	
  FILOGENÉTICA	
  –	
  BCA506	
  	
  PROF.	
  ANDERSON	
  ALVARENGA	
  PEREIRA	
  	
  	
  
EDIÇÃO	
  DE	
  SEQUENCIAS	
  UTILIZANDO	
  O	
  BIOEDIT	
  
	
  
	
  
Resumo:	
  
	
  Devido	
  à	
  natureza	
  heurística	
  do	
  alinhamento	
  múltiplo,	
  ou	
  seja,	
  não	
  há	
  garantias	
  de	
  encontrar	
  o	
  melhor	
  alinhamento	
  para	
  um	
  determinado	
  conjunto	
  de	
  dados,	
  há	
  uma	
  necessidade	
  de	
  averiguar	
  o	
  resultado	
  final	
  do	
  alinhamento	
  para	
  verificar	
  se	
  ocorreu	
   algum	
   problema	
   durante	
   a	
   análise.	
   Além	
   disso,	
   como	
   os	
   produtos	
   de	
  sequenciamento	
   geralmente	
   são	
   parciais	
   de	
   um	
   gene	
   ou	
   região	
   sequenciada,	
  muito	
   provavelmente	
   quando	
   alinhamos	
   contra	
   um	
   conjunto	
   de	
   dados	
   de	
  referência,	
  possivelmente	
  as	
  sequências	
  de	
  referência	
  são	
  do	
  gene	
  completo	
  ou	
  da	
  região	
  completa	
  analisada.	
  Para	
  evitar	
  análise	
  de	
  regiões	
  que	
  não	
  foram	
  sequenciadas	
  (quando	
  comparadas	
  com	
  as	
   referências	
   os	
   programas	
  de	
   alinhamento	
   irão	
   inserir	
   gaps	
   nas	
   regiões	
  não	
  sequenciadas,	
  o	
  que	
  significaria	
  uma	
  deleção	
  nos	
  programas	
  de	
  reconstrução	
  filogenética)	
   na	
   edição	
   podemos	
   remover	
   essas	
   regiões	
   com	
   gaps	
   e	
   analisar	
  somente	
  as	
  regiões	
  sequenciadas.	
  Para	
   esta	
   tarefa	
   diversos	
   programas	
   foram	
  desenvolvidos,	
   como	
   o	
   GenDoc	
   e	
   o	
  Bioedit.	
   Para	
   esta	
   prática	
   nós	
   utilizaremos	
   o	
   Bioedit.	
   Para	
   iniciar	
   o	
   programa	
  clique	
  2	
  vezes	
  no	
  ícone:	
  	
  
	
  	
  	
  Para	
  iniciar	
  a	
  edição	
  vá	
  em	
  FILE,	
  depois	
  em	
  OPEN.	
  Uma	
  janela	
  irá	
  se	
  abrir,	
  onde	
  irá	
   navegar	
   até	
   o	
   arquivo	
   com	
   seu	
   alinhamento	
   em	
   formato	
   FASTA.	
   Após	
  carregar	
   o	
   arquivo	
   o	
   programa	
   irá	
   mostrar	
   o	
   alinhamento	
   em	
   sua	
   tela.	
   O	
  programa	
  estará	
  travado	
  para	
  edição.	
  Para	
  permitir	
  a	
  edição	
  vá	
  na	
  seção	
  MODE	
  (onde	
  está	
  a	
  discreta	
  seta	
  vermelha)e	
  coloque	
  a	
  opção	
  EDIT.	
  	
  	
  
	
  	
  Para	
   começar,	
   iremos	
   remover	
   os	
   gaps	
   representando	
   as	
   regiões	
   não	
  amplificadas	
   no	
   PCR	
   e	
   sequenciamento.	
   Para	
   isso	
   vá	
   na	
   parte	
   de	
   cima	
   do	
   seu	
  alinhamento	
   e	
   clique	
   para	
   selecionar	
   a	
   primeira	
   coluna	
   (indicado	
   acima	
   pela	
  discreta	
   seta	
   azul).	
   Após	
   fazer	
   isso,	
   a	
   coluna	
   aparecerá	
   selecionada.	
   Na	
   parte	
  inferior	
   da	
   janela	
   terá	
   uma	
   barra	
   de	
   rolagem	
   para	
   que	
   possamos	
   “caminhar”	
  sobre	
   o	
   alinhamento.	
   Utilizando	
   a	
   barra,	
   vá	
   até	
   o	
   sítio	
   em	
   que	
   começam	
   as	
  sequências.	
   Pressionando	
  a	
   tecla	
   SHIFT	
   clique	
  novamente	
  na	
  parte	
  de	
   cima	
  do	
  alinhamento	
  no	
  ultimo	
  gap	
  antes	
  do	
  inicio	
  das	
  sequências.	
  	
  
	
  	
  	
  Devemos	
  remover	
  a	
  parte	
  das	
  sequência	
  que	
  não	
  nos	
  interessa.	
  Após	
  selecionar,	
  simplesmente	
  clique	
  em	
  delete	
  para	
  apagar	
  essa	
  região	
  selecionada.	
  Com	
   isso	
   garantimos	
   que	
   vamos	
   analisar	
   apenas	
   a	
   região	
   que	
   representa	
   nas	
  referências	
  a	
  região	
  que	
  nós	
  sequenciamos,	
  evitando	
   introdução	
  de	
   informação	
  errada	
  na	
  análise	
  filogenética.	
  
Além	
  dessas	
  análises,	
  o	
  Bioedit	
  permite	
  observar	
  apenas	
  os	
  sítios	
  variáveis.	
  Para	
  isso	
  clique	
  na	
  seção	
  indicada	
  pela	
  discreta	
  seta	
  vermelha:	
  
	
  	
  A	
   visualização	
   apenas	
   dos	
   sítios	
   variáveis(bastante	
   informativo	
   quando	
   é	
  comparado	
  à	
  uma	
  sequência	
  de	
  referência)	
  permite	
  a	
   identificação	
  de	
  perfis	
  de	
  subtipos	
  e	
  mutações	
  fixadas.	
  O	
   BioEdit	
   também	
   permite	
   a	
   visualização	
   da	
   proteína	
   que	
   essa	
   região	
   irá	
  produzir	
   (caso	
   seja	
   uma	
   região	
   codificante).	
   Ele	
   realiza	
   a	
   tradução	
   conceitual	
  baseado	
  no	
  primeiro	
  quadro	
  aberto	
  de	
  leitura.	
  Para	
  realizar	
  a	
  tradução	
  de	
  todas	
  as	
  sequências	
  basta	
  clicar	
  Ctrl+A	
  e	
  em	
  seguida	
  Ctrl+G.	
  O	
  programa	
   irá	
   traduzir	
  todas	
  as	
  sequências.	
  Para	
  voltar	
  na	
  sequência	
  de	
  nucleotídeos	
  basta	
  clicar	
  Ctrl+G	
  novamente.	
  	
  
	
  	
  O	
   programa	
   é	
   bastante	
   popular	
   devido	
   à	
   sua	
   diversidade	
   em	
   ferramentas.	
  Explore	
  o	
  programa	
  e	
   identifique	
  as	
  diversas	
   ferramentas	
   como	
  o	
  DotPlot	
  e	
  os	
  alinhamentos	
  par	
  a	
  par,	
  que	
  são	
  úteis	
  para	
  desenho	
  e	
  mapeamento	
  de	
  primers.	
  
Uma	
  das	
  funções	
  amplamente	
  utilizadas	
  é	
  a	
  geração	
  de	
  mapas	
  de	
  restrição.	
  Nele	
  é	
   possível	
   fazer	
   um	
   mapa	
   de	
   enzimas	
   de	
   restrições.	
   Basta	
   clicar	
   em	
   uma	
  sequência	
  e	
  depois	
  ir	
  em	
  SEQUENCE,	
  seguindo	
  para	
  NUCLEIC	
  ACID	
  e	
  depois	
  em	
  RESTRICTION	
   MAP.	
   Uma	
   janela	
   irá	
   abrir,	
   onde	
   é	
   possível	
   modificar	
   os	
  parâmetros	
  e	
  depois	
  vá	
  em	
  GENERATE	
  MAP.	
  O	
  programa	
  irá	
  mostrar	
  as	
  diversas	
  enzimas	
  que	
  cortam	
  essa	
  sequência	
  e	
  as	
  posições	
  dos	
  sítios.	
  	
  
	
  	
  Explore	
   o	
   programa	
   e	
   identifique	
   aplicações	
   que	
   auxiliam	
   no	
   dia	
   a	
   dia	
  laboratorial.