Meios de cultura controle de qualidade

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05/04/16	
  
1	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  e	
  	
  
controle	
  de	
  qualidade	
  
Profª	
  M.Sc.	
  Iukary	
  Takenami	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
•  Mime;zar	
  as	
  condições	
  encontradas	
  in	
  vivo;	
  
•  Suprir	
  as	
  necessidades	
  do	
  embrião	
  para	
  o	
  seu	
  bom	
  
funcionamento.	
  
Estabelecer	
  condições	
  que	
  
favoreçam	
  o	
  desenvolvimento	
  
de	
  embriões	
  até	
  o	
  estágio	
  de	
  
blastocisto	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
•  Inicialmente	
  u;lizava-­‐se	
  o	
  mesmo	
  meio	
  para	
  cul;vo	
  de	
  
células	
  somá;cas	
  
–  Earle’s	
  balanced	
  salt	
  solu;on	
  (EBSS)	
  
–  Ham’s	
  F10	
  (mais	
  completo)	
  
	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
Água,	
  fonte	
  energé;ca,	
  fatores	
  de	
  crescimento,	
  
componentes	
  inorgânicos,	
  an;bió;co	
  
•  Gametas	
  e	
  embriões	
  necessitam	
  de	
  condições	
  diferentes	
  
•  Novas	
  formulações	
  foram	
  desenvolvidas,	
  duas	
  
necessidades:	
  
–  Entender	
  quais	
  os	
  metabólicos	
  envolvidos	
  nos	
  primeiros	
  estágios	
  
dos	
  embriões	
  humanos;	
  
–  Determinar	
  o	
  papel	
  específico	
  dos	
  componentes.	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
•  Gadner	
  e	
  cols	
  (1996)	
  
–  Diversas	
  coletas	
  e	
  análises	
  dos	
  componentes	
  do	
  fluído	
  
da	
  tuba	
  uterina	
  –	
  piruvato,	
  lactato	
  e	
  glicose	
  
•  Piruvato	
  à	
  constante	
  durante	
  todo	
  o	
  ciclo	
  
•  Lactato	
  à	
  é	
  período	
  de	
  ovulação	
  e	
  ê	
  na	
  fase	
  lútea	
  
•  Glicose	
  à	
  é fase	
  folicular	
  e	
  lútea,	
  ê	
  no	
  período	
  
de	
  ovulação	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
Embrião:	
  alta	
  concentração	
  de	
  lactato	
  e	
  baixa	
  
concentração	
  de	
  glicose	
  
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2	
  
•  Simples	
  
–  Suportam	
  o	
  desenvolvimento	
  embrionário	
  até	
  o	
  3º	
  dia	
  
•  Meios	
  universais	
  (complexos)	
  
–  Permitem	
  o	
  desenvolvimento	
  in	
  vitro	
  até	
  o	
  5º	
  dia	
  
•  Sequenciais	
  
–  Des;nados	
  a	
  cul;vos	
  prolongados	
  
	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
MONOFÁSICO	
  
BIFÁSICO	
  
Melhora	
  no	
  desenvolvimento	
  embrionário	
  que	
  
reflete	
  no	
  aumento	
  das	
  taxas	
  de	
  gestação	
  e	
  
implantação	
  
•  Componentes	
  do	
  meio	
  de	
  culHvo:	
  
–  Água	
  	
  
–  Fatores	
  de	
  crescimento:	
  AA	
  e	
  vitaminas	
  
–  Fonte	
  energé;ca:	
  Glicose	
  	
  
–  Componentes	
  inorgânicos	
  
–  An;bió;co	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
ÁGUA	
  
–  Excelente	
  solvente	
  
–  Fornece	
  meio	
  para	
  as	
  reações	
  químicas	
  e	
  biológicas	
  
–  Qualidade	
  da	
  água	
  é	
  um	
  fator	
  limitante	
  para	
  o	
  
crescimento	
  embrionário	
  
	
  
	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
FATORES	
  DE	
  CRESCIMENTO:	
  AA,	
  vitaminas	
  
AA	
  
–  Substrato	
  para	
  a	
  síntese	
  protéica	
  
–  Glutaminas,	
  dipepkdeo	
  alanil-­‐glutamina,	
  piruvato	
  
	
  
	
  
	
  
Vitaminas	
  
–  Vitamina	
  E	
  protege	
  a	
  célula	
  do	
  estresse	
  oxida;vo	
  
–  Vitamina	
  B5	
  transforma	
  carboidratos	
  em	
  energia	
  
	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
Ausência	
  de	
  piruvato	
  84%	
  dos	
  embriões	
  retardam	
  o	
  
desenvolvimento	
  
FONTE	
  ENERGÉTICA:	
  GLICOSE	
  
•  Espermatozóide	
  u;liza	
  glicose	
  como	
  fonte	
  de	
  ATP	
  
COMPONENTES	
  INORGÂNICOS	
  
•  Contribuem	
  para	
  a	
  manutenção	
  da	
  osmolaridade	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
Após	
  fecundação	
  altas	
  concentrações	
  de	
  glicose	
  
podem	
  bloquear	
  o	
  desenvolvimento	
  embrionário	
  
ANTIBIÓTICO	
  
–  Minimizar	
  o	
  risco	
  de	
  contaminação	
  
–  Gentaminica	
  e	
  estreptomicina	
  à	
  síntese	
  protéica	
  
–  Penicilia	
  à	
  parede	
  celular	
  
	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
Embriões	
  cul;vados	
  sem	
  an;bió;cos	
  apresentam	
  
maior	
  taxa	
  de	
  divisão	
  celular	
  
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3	
  
•  Variações	
  no	
  sistema	
  de	
  cul;vo	
  
–  Meio	
  para	
  manipulação	
  
–  pH	
  
–  Óleo	
  mineral	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
pH	
  7,4	
  
–  Processos	
  altamente	
  sensíveis	
  
•  Síntese	
  de	
  proteínas	
  
•  Metabolismo	
  
•  Funções	
  mitocondriais	
  
•  Regulação	
  de	
  citoesqueleto	
  
–  Desenvolvimento	
  embrionário	
  se	
  adapta	
  a	
  diferentes	
  pH	
  
•  Tuba	
  uterina:	
  alcalino	
  
•  Útero:	
  ácido	
  
Entretanto	
  as	
  variações	
  in	
  vitro	
  podem	
  prejudicar	
  o	
  
desenvolvimento	
  embrionário	
  	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
	
  
SISTEMA ABERTO vs SISTEMA FECHADO 
	
  
	
  
	
  
	
  
Óleo	
  mineral	
  
•  Previne	
  a	
  rápida	
  evaporação	
  do	
  meio	
  de	
  cul;vo;	
  
•  Previne	
  mudanças	
  no	
  pH;	
  
•  Protege	
  contra	
  contaminação	
  microbiana;	
  
•  Facilita	
  análise	
  dos	
  embriões	
  durante	
  a	
  cultura.	
  
Meios	
  de	
  cultura	
  
Embriões	
  cul1vados	
  
apenas	
  com	
  meio	
  
Microgotas	
  de	
  meio	
  
cobertas	
  com	
  óleo	
  mineral	
  
•  Normas	
  vigentes	
  da	
  ANVISA	
  (RDC	
  33,	
  RDC	
  50,	
  RDC	
  23)	
  	
  
–  Requisitos	
  mínimos	
  para	
  funcionamento	
  das	
  clínicas	
  
•  Papel	
  do	
  Lab	
  Embriologia	
  à	
  manter	
  a	
  viabilidade	
  
dos	
  gametas	
  e	
  embriões	
  em	
  um	
  ambiente	
  fora	
  do	
  
aparelho	
  reprodutor	
  feminino/masculino	
  
	
  
	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
•  SETORES:	
  
1.  Escritório	
  
2.  Recepção	
  
3.  Consultório	
  
4.  Estoque/Almoxarifado	
  
5.  Área	
  de	
  lavagem	
  e	
  esterilização	
  de	
  materiais	
  
6.  Laboratórios	
  de	
  preparo	
  dos	
  meios	
  de	
  cultura	
  
7.  Coleta	
  e	
  processamento	
  seminal	
  
8.  Coleta	
  e	
  manipulação	
  dos	
  oócitos	
  
9.  Salas	
  de	
  transferência	
  de	
  embriões	
  	
  
10.  Sala	
  de	
  criopreservação	
  	
  
11.  Nicho	
  externo	
  para	
  o	
  armazenamento	
  dos	
  cilindros	
  de	
  CO2	
  	
  
12.  Gerador	
  de	
  emergência	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
•  Mudanças	
  no	
  ambiente:	
  
–  Viabilidade;	
  
–  Desenvolvimento	
  embrionário.	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
Como	
  um	
  laboratório	
  de	
  Fer;lização	
  é	
  avaliado?	
  
Descuidos	
  ou	
  falta	
  de	
  atenção	
  podem	
  provocar	
  danos	
  
ao	
  desenvolvimento	
  embrionário	
  à	
  prejudicar	
  a	
  
qualidade	
  dos	
  resultados	
  ob;dos	
  pelo	
  laboratório	
  
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•  Implementação	
  de	
  um	
  Programa	
  de	
  controle	
  de	
  qualidade	
  	
  
–  Conjunto	
  de	
  normas	
  que	
  devem	
  ser	
  seguidas	
  em	
  um	
  
ins;tuto,	
  permi;ndo	
  a	
  padronização	
  e	
  a	
  o;mização	
  dos	
  
procedimentos	
  realizados	
  
	
  
•  ObjeHvo?	
  	
  
–  Assegurar	
  o	
  melhor	
  desenvolvimento	
  e	
  precisão	
  das	
  
condutas	
  e	
  técnicas	
  u;lizadas,	
  almejando	
  a	
  o;mização	
  dos	
  
resultados	
  com	
  maior	
  segurança	
  e	
  fidelidade	
  
Controle	
  deQualidade	
  
•  Equipe	
  
•  Procedimentos	
  
•  Ambiente	
  laboratorial	
  à	
  infraestrutura	
  
•  Exposição	
  dos	
  embriões	
  a	
  luz	
  
•  Incubadoras	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
•  Equipe	
  
–  Treinamento	
  específico;	
  
–  Cursos	
  de	
  atualização;	
  
–  Organização:	
  
•  Minimização	
  de	
  erros;	
  
•  Contaminação	
  dos	
  procedimentos	
  realizados.	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
•  Procedimentos	
  
–  Todo	
  o	
  material,	
  durante	
  o	
  processamento,	
  
apresentar	
  iden;ficação	
  do	
  casal	
  
–  Iden;ficação	
  do	
  profissional	
  que	
  realizou	
  o	
  
procedimento	
  à	
  data	
  e	
  hora	
  devem	
  ser	
  registradas	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
Todos	
  os	
  passos	
  do	
  tratamento	
  devem	
  ser	
  documentados	
  
•  Ambiente	
  laboratorial	
  
–  Disposição	
  dos	
  equipamentos	
  
•  Facilitação	
  da	
  sua	
  u;lização	
  
•  Movimentação	
  dos	
  profissionais	
  durante	
  os	
  procedimentos	
  
•  Exposição	
  dos	
  embriões	
  a	
  luz	
  
–  Fator	
  de	
  estresse	
  aos	
  embriões	
  
•  Instalação	
  de	
  filtros	
  no	
  microscópio	
  
•  Luz	
  ambiente	
  reduzida	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
•  Incubadoras	
  
–  Mime;zar	
  as	
  condições	
  encontradas	
  na	
  tuba	
  uterina	
  
e	
  no	
  útero	
  
Controle	
  de	
  Qualidade	
  
Sabe-se que quanto mais preciso este controle, e mais 
próximo ao ambiente in vivo são os parâmetros 
 
 
Melhor a qualidade dos óvulos e embriões 
 
 
Melhor a taxa de sucesso de gravidez no tratamento 
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Controle	
  de	
  Qualidade