TOMATE TRANSGENICO

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Transgenic tomato plants expressing the antigen
gene PfCP‑2.9 of Plasmodium falciparum
PLANTAS TRANSGÊNICAS DE TOMATE EXPRESSANDO O GENE
DO ANTÍGENO PfCP‑2.9 DE Plasmodium falciparum
Pesq. agropec. bras., 2013
Kantur et al.
Ana Kelly | Anny Jasmine | Raul Lucena | Suzana Marjorie
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS ANIMAIS
DISCIPLINA: BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS
1
INTRODUÇÃO
16/05/2016
2
Malária
Plasmodium
Áreas endêmicas
Vacinas
 Preço – Fermentação e purificação, adjuvantes, armazenamento frio, transporte e entrega estéril
Pan et al. (2009): PfCP‑2.9 → AMA-1 e MSP1-19 
2
INTRODUÇÃO
16/05/2016
3
Peng et al. (2010)
Yersenia pestis
F1-V – Tomate transgênico
Tomate → HBsAg, HIV gag e proteínas do capsídeo da raiva
3
INTRODUÇÃO
16/05/2016
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Turpen et al. (1995)
Tabaco
Alface, semente de Arabidopsis thaliana e alga verde
Antígenos: AMA1, MSP1 e MSP142
Vacinas comestíveis
Efetivo, seguro e barato 
4
OBJETIVO
16/05/2016
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OBTENÇÃO DE TOMATEIROS TRANSGÊNICOS EXPRESSANDO A PROTEÍNA PFCP-2.9 (UMA QUIMERA DOS ANTÍGENOS E MSP1 DE AMA1 DO Plasmodium falciparum).
5
MATERIAL
&
MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
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Variedade de tomate Summers 
Gene (PfCP‑2.9) – clonado em plasmídeo 
Introduzido – Agrobacterium tumefaciens
Eletroporação
Duas colônias obtidas
PCR – Somente uma apresentou o gene de interesse
Imagem meramente ilustrativa
7
MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
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Cotilédones – 7 dias
Transformados – via Agrobacterium tumefaciens 
Secos e transferidos para meio sólido
Incubados – 23ºC – 72 hs
Transferidos p/ meio com antibióticos – 4 semanas
Troca de meio – 8 semanas
Imagem meramente ilustrativa
8
MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
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Três plantas transformadas c/ o gene de interesse
Atingiram a maturidade – produção de frutos 
Amostra T0
Sementes colhidas – germinadas
DNA isolado
Amostra T1
 Testadas para a presença do gene
PCR – Gel de Agarose
Imagem meramente ilustrativa
9
MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
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Identificação da presença do gene 
Demonstrar que o gene de interesse foi integrado no genoma da planta 
PCR de transcriptase reversa (RT - PCR )
 Sementes da plantas 1, 2 e 3 da geração T0 foram germinadas
RNA extraído das folhas de cada planta
Imagem meramente ilustrativa
10
MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
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Imagem meramente ilustrativa
kit de isolamento RNA foi utilizado
Síntese de cDNA
Programa de amplificação por PCR
Mesmo que o utilizado para a amplificação de DNA
Método de Bradford e o kit de extração de proteína vegetal utilizados
Quantificar a proteína extraída das plantas T1
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MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
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Imagem meramente ilustrativa
Diluições de BSA usadas ​​para desenvolver a curva padrão
Proteína determinadas por comparação com a curva padrão
Leitor ELISA
Dados interpretados com o software
Proteínas extraídas de frutos foram mais baixa do que as obtidas a partir de folhas
Proteína de folhas: Western blot
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MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
13
Imagem meramente ilustrativa
Teste de proteínas totais solúveis
Ac contra o PfCP -2.9
Ac contra AMA1
Amostras de folhas de T1 transformadas com o gene PfCP -2.9 
Analisadas em duplicata e submetidas a migração em dois géis de acrilamida 
Identificação de proteínas
Utilização no ensaio de transferência de Western
 Membrana de Difluoreto de polivinilideno (PVDF)
Anticorpos primários diluídos em TTBS
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MATERIAL E MÉTODOS
16/05/2016
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Diluição do Ac secundário de cabra anti-coelho 
Membranas lavadas com TTBS após a remoção da solução de anticorpo
Método de eletroforese: transferir proteínas do gel sobre a membrana de PVDF
Presença da proteína de interesse: gravadas
14
&
DISCUSSÃO
RESULTADOS
RESULTADOS E DISCUSSÃO
16/05/2016
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336 explantes (0,89% de taxa de regeneração); 
3 plantas de tomate transgênicas – maturidade, produção de frutos e sementes.
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17
RESULTADO
S
E
DISCUSSÃO
16/05/2016
18
RESULTADO
S
E
DISCUSSÃO
RESULTADOS E DISCUSSÃO
16/05/2016
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3 plantas transformadas → positivas;
1036 pb;
Ø controle negativo;
PfCP – 2.9:
DNA e RNA → integração e expressão do gene alvo.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
3 plantas transformadas → síntese de RNA;
Variedade Summers (transformadas com o PfCP – 2.9):
PST – 17,5 μg mL-1
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20
20
RESULTADOS
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21
21
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RESULTADO
S
E
DISCUSSÃO
CONCLUSÃO
16/05/2016
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Tomateiros transformados com o gene pfcp‑2.9 expressa o gene antígeno da malária no tomate;
O gene pfcp‑2.9 é transferido para a próxima geração de tomates.
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Transgenic tomato plants expressing the antigen
gene PfCP‑2.9 of Plasmodium falciparum
PLANTAS TRANSGÊNICAS DE TOMATE EXPRESSANDO O GENE
DO ANTÍGENO PFCP‑2.9 DE Plasmodium falciparum
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