Biotecnologia Vegetal: Transformação genética

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Para que um gene seja expresso é preciso uma 
construção gênica 
 
 
Métodos para obtenção de plantas transgênicas 
Transferência direta de genes para protoplastos 
Obtenção do protoplasto: 
1. Coletar material das folhas 
2. Dissolver a membrana plasmática 
3. Obtenção do protoplasto 
4. Transfecção com DNA plasmidial 
5. Protoplasto transformado 
Métodos de transfecção para protoplasto: choque 
osmótico ou eletroporação 
Obtenção da planta transgênica: 
1. Regeneração do protoplasto para recuperar a 
membrana 
2. Calo 
3. Calo + Hormônios = Planta 
Métodos de transfecção para células calos e 
explantes: bombeamento de partículas, infecção por 
agrobacterium, ou transformação em planta 
(Arabdopsis thaliana) 
Transformação por eletroporação 
Choque elétrico despolariza momentaneamente a 
membrana e permite a inserção do DNA exógeno 
Ineficiente: depende da recombinação do DNA 
exógeno, e isso acontece em taxas muito baixas 
Sistema Agrobacterium 
Bacteria Agrobacterium é capaz de infectar ao 
inserir seu DNA dentro da célula da planta (T-DNA) 
 
→ O T-DNA induz a produção de auxina e 
citocinina, que permitem que a célula cresça; 
além disso também produz opina para 
alimentar a Agrobacterium 
Etapas 
1. Remoção de discos foliares da planta 
2. Incubação dos discos com agrobacterium 
geneticamente modificada para que o T-DNA 
tenha o gene de interesse 
3. Infecção 
4. Seleção dos recombinantes (antibiótico) 
T-DNA 
• Plasmídeo Ti 
• O tamanho é delimitado pelas bordas 
esquerda e direita que contém repetições 
invertidas 
Agrobacterium desarmada: aquela que foi 
geneticamente modificada removendo os genes que 
codificam as opinas, auxinas e citocininas 
→ Operon vir 
Plasmídeos binários 
Plasmídeos que contém as bordas de um T-DNA a ser 
transferido à planta hospedeira 
Vantagens: de fácil manipulação; contém origens de 
replicação diferentes do plasmídeo Ti; podem ser 
facilmente propagados em E.coli 
Agrobacterium rhizogenes: indução de raízes 
o pRI 
o Auxina 
o Biomassa 
Bombardeamento com micropartículas 
Utilizada para espécies resistentes a Agrobacterium 
Não precisa de plasmídeo, precisa apenas da 
construção gênica (promotor, codificante, 
terminador) 
 
Desvantagem: taxa de integração do gene de 
interesse no genoma é muito baixa 
 
Tecido alvo para a transferência do gene: 
É preciso escolher um tecido capaz de dar origem a 
uma planta inteira 
 Tecidos meristemáticos 
Como obter esses tecidos? 
 
 
 
 
Construções gênicas para a transformação de 
plantas 
Genes marcadores para seleção de células 
transformadas: 
o nptII: resistente a neomicina, gentamicina 
o htp: resistente a higromicina 
o epsps: resistente ao glifosato 
o pat ou bar: resistente a glifositato de amônio 
o ahas: resistente a imidazolinonas 
Genes repórteres para detecção da expressão 
o gusA ou uidA: beta-glicuronidade (azul) 
Desvantagem: precisa matar o tecido (ensaio 
destrutivo) 
o gfp: proteína de fluorescência verde 
o luc: luciferase 
Vantagem: quantificável; menos invasível que 
gfp 
o cat: cloranfenicol aceltiltransferase 
Promotores: 
o 35S CaMV: superexpressão constitutiva; 
fraco em tecidos embrionários e ineficaz para 
monocotiledôneas 
o 5´-nos: T-DNA 
o rbcS: expressão forte em tecidos 
fotossintéticos 
Terminadores: final da expressão 
o 19S e 35S CaMV 
o 3´-nos 
 
 
 
Engenharia genética 
Modificação dos genes de um organismo pela 
introdução de novos genes ou alteração dos genes 
• Deleção 
• Superexpressão 
• Silenciamento (RNAi ou amiRNAs) 
• Transgenia 
• Expressão induzível (tecido-específico): dosar 
quando o gene vai ser expresso 
Ferramentas para edição de genomas 
Geração de mutações sítio dirigidas: inserção de 
genes em pontos específicos do genoma 
Nucleases: ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 
ZNF: proteínas que reconhecem tríplets 
TALEN: fatores de transcrição que reconhecem 
partes específicas do genoma 
o Geração de uma proteína de fusão 
CRISPR/Cas9: sistema que procariotos utilizam para 
se proteger de vírus 
o CRISPR: regiões repetidas no genoma das 
bactérias que se integram ao genoma de 
interesse 
o Cas9: nuclease guia que cliva quando encontra 
seu RNA complementar 
 
 
Embriogênese 
direta: pegar o 
embrião e cultivar 
 
Embriogênese somática: 
folha de uma planta 
adulta