Revisão Anual de Patologia de Plantas -capitulo1 (metodo de isolamento e sequenciamento de bacterias)

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Métodos de isolamento e seqüenciamento de genes de bactérias – 1 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
MÉTODOS DE ISOLAMENTO E 
SEQÜENCIAMENTO DE GENES DE 
BACTÉRIAS 
 
Nelson A. Wulff e Elaine C. Martins 
Fundo de Defesa da Citricultura-Fundecitrus, Av. Dr. Adhemar P. de Barros, 
201, Caixa Postal 391, 14807-040 Araraquara, SP 
nelsonwulff@fundecitrus.com.br 
 
 
RESUMO 
 
As bactérias compreendem um grupo de fitopatógenos com ampla 
variabilidade, seja genética, bioquímica ou hospedeira. Ao longo do 
desenvolvimento da fitobacteriologia, diferentes abordagens foram 
empregadas em seu estudo e nos últimos anos a área que entrou em evidência 
foi a genômica, com o sequenciamento de genomas bacterianos. Antes de ser 
uma técnica recente, o seqüenciamento sofreu o advento da automação e uso 
em larga escala. A clonagem e posterior sequenciamento foi empregado ao 
longo dos anos visando caracterizar a patogenicidade das bactérias e exemplos 
serão aqui empregados para ilustrar estas técnicas. Como isolar, clonar e 
determinar a seqüência de nucleotídeos do DNA bacteriano será abordado 
neste capítulo. As técnicas de clonagem são clássicas e foram desenvolvidas 
ao longo das últimas três décadas. Avanços marcantes foram o emprego das 
enzimas de restrição na construção de moléculas de DNA e a reação em 
cadeia da polimerase, uma técnica útil na clonagem e atualmente essencial no 
sequenciamento. 
 
SUMMARY 
 
METHODS FOR THE ISOLATION AND SEQUENCING OF 
BACTERIAL GENES 
Plant pathogenic bacteria are pathogens with high genetic and 
biochemical variability, as well as broad host range. Toward the development 
of this field, different approaches were employed. On the last few years, 
genomics became a field of great impact on bacteriology, with several 
genomes of plant pathogenic bacteria being unraveled. Sequencing is not a 
new technique, but it is a highly automated field and of high-throughput data. 
Cloning with subsequent sequencing was used for a long time with the aim to 
characterize bacterial pathogenicity, and examples will be used here to 
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illustrate such advances. How to isolate, clone and sequence DNA nucleotides 
will be described below. Cloning techniques are classical ones and were 
developed during the last three decades. Important remarks were the finding 
of restriction enzymes to the development of genetic engineering and 
polymerase chain reaction, a remarkable approach to the cloning and 
sequencing of DNA. 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Atualmente podemos considerar a genômica uma disciplina de 
grande impacto na fitopatologia. Através dos projetos de seqüenciamento 
completo do genoma de bactérias fitopatogênicas, as próprias técnicas de 
clonagem e seqüenciamento tornaram-se corriqueiras e acessíveis. 
Historicamente, avanços importantes na ciência foram possíveis devido às 
técnicas desenvolvidas em genética e bioquímica bacterianas. Assim surgiram 
os primórdios da engenharia genética, com a manipulação de segmentos de 
DNA com enzimas de restrição, transformação bacteriana, emprego de 
amplificação em cadeia da polimerase (PCR) e aplicações derivadas da 
transferência gênica entre procariotos e eucariotos por Agrobacterium. 
A „decodificação‟ do DNA em pequenos trechos, assim como a 
caracterização dos produtos gênicos e da função destes genes, foi que permitiu 
a interpretação deste enorme volume de informação atualmente disponível nos 
genomas seqüenciados. Em outras palavras, o trabalho lento e gradual de 
caracterização genética efetuado durante décadas, forneceu a matéria-prima 
para a comparação dos genes encontrados nestes genomas completos. Cabe 
aqui ressaltar que esta revisão almeja fornecer subsídios para que o leitor 
compreenda como são realizadas as técnicas de clonagem e seqüenciamento 
de genes bacterianos. Longe de ser uma revisão extensiva e exaustiva do 
assunto, tem como objetivo aproximar aspectos técnicos e teóricos da 
percepção que temos das bactérias fitopatogênicas. 
 
 
ISOLAMENTO E CLONAGEM DE GENES 
BACTERIANOS 
 
Um gene, um segmento de DNA que apresenta um início e um fim, 
contém sequências regulatórias que não estão contidas neste trecho, mas são 
partes integrantes de toda maquinaria regulatória da expressão gênica. O 
promotor ou região promotora é o sítio de ligação da RNA-polimerase. 
Muitos genes aglomeram-se em operons, que são unidades de expressão 
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genética coordenada. Um operon consiste nas regiões controladoras (operador 
e promotor) e nos genes estruturais. As bactérias regulam a quantidade de 
proteínas sintetizadas em uma variedade de modos. A expressão da maioria 
dos genes é regulada primariamente na transcrição e não pela tradução. 
A seqüência de DNA que compõem um gene em questão é formada 
por nucleosídeos fosfatados contendo as bases purínicas adenina (A), guanina 
(G) e pirimidínicas timina (T) e citosina (C), originando os quatro 
nucleotídeos (base, 2-desoxiribose e fosfato) que compõem o código genético. 
Determinar a seqüência destes nucleotídeos no genoma é o objetivo 
dos projetos de seqüenciamento, seja este objetivo sequenciar um plasmídio, 
um segmento de DNA clonado em um plasmídio ou o genoma completo de 
uma bactéria (tabela 1). 
Rudolf Hausmann em seu excelente livro “História da Biologia 
Molecular” relata de forma vívida fatos marcantes desta história e abaixo 
serão transcritos os principais avanços obtidos na clonagem gênica 
(Hausmann, 1997). 
Na década de 70 sabia-se a respeito da estrutura e composição do 
DNA, mas como obter um gene a ser clonado? A síntese química de um gene 
foi realizada por Itakura et al. (1977), mas esta técnica estava limitada à 
pequena extensão deste DNA sintético (a proteína produzida por este DNA 
sintético possuía 14 aminoácidos) e ao conhecimento da seqüência da 
proteína. Empregando a transcriptase reversa, descoberta no início da década 
de 70, foi possível após a separação do RNA mensageiro, sintetizar “in vitro” 
a cópia em molde de DNA deste transcrito (DNAc). Esta técnica possibilitou 
a síntese em grande escala de diversos genes (figura 1). 
O emprego de enzimas de restrição, enzimas que cortam 
especificamente o DNA em determinada seqüência, abriu os horizontes para a 
clonagem de genes em plasmídios bacterianos e sua propagação em diferentes 
bactérias, como E. coli (figura 1). Plasmídios são moléculas de DNA 
extracromosômico, autonomamente replicativas, encontradas em praticamente 
todas espécies bacterianas. Em torno de 1970, iniciou-se a obtenção de 
vetores para propagação e manipulação de seqüências específicas de DNA. 
Estes vetores foram construídos com fragmentos de plasmídios de ocorrência 
natural, principalmente plasmídios de E. coli. Todos vetores plasmidiais 
contém três características em comum: uma origem de replicação; um 
marcador seletivo e um sítio de clonagem. 
Vetores cosmidiais, plasmídios contendo o sítio fágico cos lambda, 
foram desenvolvidos para facilitar a clonagem de fragmentos grandes de 
DNA. Cosmídeos podem ser empregados para a transformação de células 
bacterianas, assim como os plasmídios. Uma vez nas células, replicam 
empregando seu sítio ori. Vetores cosmidiais são freqüentemente empregados 
para a construção de bibliotecas genômicas. Outro tipo de vetor plasmidial 
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Desfosforilação do vetor
(fosfatase alcalina)
Modificação das extremidades CG
(transferases terminais)
Ligação dos adaptadores
(T4 DNA ligase)Preenchimento de extremidades coesivas
(T4 DNA polimerase ou Klenow)
Digestão de extremidades coesivas
(Nuclease S1)
Anelamento direto do DNA
e do vetor linearizado
Degradação do grupamento OH 3`
(Exonuclease III)
Ligação do DNA e do vetor
(Ligase do DNA T4)
Vetor de clonagem
Linearização com enzimas
de restrição
Modificação da extremidade
do DNA
 5´ 3´
 3´ 5´
DNA genômico digerido com
enzimas de restrição
Modificação da extremidade
do DNA
 5´ 3´
 3´ 5´
Preparo do cDNA
Síntese do cDNA
(transcriptase reversa)
Síntese da segunda fita
(DNA polimerase I)
 5´ 3´
 3´ 5´
Fragmento sintético de DNA
Mutagênese sítio específica
DNA recombinante
 
 
Figura 1. A técnica de clonagem. O DNA do plasmídio e o DNA estranho a 
ser clonado são cortados com enzimas de restrição e modificados, 
permitindo o pareamento das extremidades. Através da ação da 
ligase os dois fragmentos de DNA são covalentemente ligados. 
Este DNA recombinante pode ser introduzido em células 
bacterianas e propagado. Muitas etapas são opcionais e dependem 
da estratégia a ser empregada. Modificado de Hausmann (1997). 
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para clonagem, denominado BAC (Bacterial Artificial Cromosome), foi 
desenvolvido empregando o fator replicador F para a propagação de grandes 
pedaços de DNA (100 a 500 kb). 
Os cientistas Stanley Cohen e Herbert Boyer foram os primeiros a 
juntar um pedaço de DNA, um fragmento de restrição, com o DNA de um 
pequeno plasmídio cortado com a mesma enzima de restrição, na presença de 
ligase do DNA, e com este material transformaram células de E. coli (figura 
1). 
A clonagem de fragmentos de DNA pode apresentar variados graus 
de complexidade. Embora possa ser efetuada com um mínimo de reagentes e 
condições laboratoriais, conhecimento teórico é necessário para poder analisar 
corretamente os resultados e planejar as próximas etapas. Para o iniciante em 
biologia molecular um bom livro é a melhor ferramenta. Para o pesquisador 
que já trilhou os caminhos iniciais a criatividade é o limite, visto que são 
inúmeras as formas de se atingir o objetivo. Quando se sequencia um gene, 
um dos objetivos é auxiliar na determinação de sua função, fornecendo dados 
e informações que possam alicerçar sua importância no organismo. Outra 
utilidade do seqüenciamento de genes é na identificação de microrganismos, 
onde linhagens bacterianas podem ser identificadas através de genes 
específicos, como o gene RNAr 16S. 
Dois eventos foram de especial importância para o sucesso das 
técnicas de clonagem gênica. A descoberta das enzimas de restrição, que são 
enzimas que cortam o DNA em uma seqüência específica, foi essencial para 
alavancar a engenharia genética, ou seja, a construção de moléculas de DNA 
com características definidas e inexistentes. Enzimas de restrição são 
mecanismos de defesa das bactérias frente à introdução de DNA exógeno, 
como o DNA fágico (ou viral). A purificação e caracterização de uma enorme 
variedade destas enzimas, permitiu uma ampla possibilidade de clonagem, 
subclonagem e recombinação de fragmentos de DNA 
(rebase.neb.com/rebase/rebase.html). Atualmente as próprias enzimas de 
restrição tiveram seus genes isolados, clonados e as enzimas vendidas 
comercialmente são muitas vezes recombinantes. 
O segundo fato marcante na tecnologia genética foi o 
desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain 
Reaction – PCR) (Saiki et al., 1985). A técnica da reação em cadeia da 
polimerase, assim como a conhecemos hoje, deve-se ao lance de gênio de 
associar uma polimerase resistente a alta temperatura, permitindo a automação 
do processo (Mullis & Faloona, 1987). Em seus primórdios, a cada ciclo da 
PCR, era necessário adicionar mais polimerase à reação, pois a etapa de 
desnaturação do DNA desnaturava também a polimerase de E. coli. A 
introdução da polimerase do organismo termofílico Thermus aquaticus 
eliminou a necessidade de adição de nova polimerase a cada ciclo de 
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desnaturação, anelamento e extensão. Kary B. Mullis foi laureado com o 
Nobel de Química de 1993 por esta descoberta (www.nobel.se). 
A existência de informações precisas a respeito das seqüências de 
inúmeros genes permite que estes sejam isolados através de PCR. Sintetizam-
se primers de DNA (oligonucleotídeos) com seqüências similares aos genes 
descritos em outros organismos, ou primers degenerados e através da 
amplificação do DNA do organismo alvo por PCR pode-se obter um 
fragmento de DNA contendo o gene a ser estudado. Nesta etapa é importante 
o emprego de uma polimerase com capacidade de correção, isto é, uma 
“proofreading polymerase” ou polimerase com atividade 3‟5‟exonuclease. 
A Taq polimerase, enzima rotineiramente empregada na PCR, não apresenta 
esta capacidade e portanto pode, em baixa taxa, incorporar erroneamente 
nucleotídeos na fita de DNA nascente. As seqüências dos genes de interesse 
podem ser facilmente encontradas em base de dados como nos sítios a seguir: 
www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html e http://us.expasy.org/. 
A identificação da função de genes bacterianos, através de sua 
clonagem e seu posterior seqüenciamento, tem a potencialidade de elucidar 
aspectos da interação planta-patógeno e de revelar novas facetas desta 
interação. A seguir serão discutidos alguns casos que exemplificam os 
avanços obtidos em fitobacteriologia através da identificação de genes 
bacterianos e seu envolvimento com a virulência. Entretanto, devemos 
lembrar que estudos funcionais são necessários para comprovar a identidade 
de um gene, hipotetizada a partir da homologia de seqüência. 
A produção de polissacarídeos extracelulares (PSE) é 
positivamente regulada em Erwinia amylovora e um dos genes que exerce 
este efeito (rcsB) foi clonado através de PCR com amplificação a partir de 
primers consenso, sintetizados a partir da seqüência gênica do gene rcsB de E. 
coli (Bereswill & Geider, 1997). 
O gene da palatinose, enzima que utiliza a sacarose como substrato, 
convertendo-a em compostos de reserva, foi clonado empregando-se a 
seqüência de um gene descrito na literatura e usando-o como sonda para 
avaliar uma biblioteca genômica de Erwinia rhapontici (Börnke et al., 2001). 
Posteriormente o gene foi seqüenciado e expresso em E. coli para 
caracterização de sua atividade enzimática. Outra possibilidade é o emprego 
de primers degenerados, os quais podem conter múltiplas opções de 
pareamento, e assim permitir uma maior flexibilidade para o anelamento e 
posterior amplificação. Primers degenerados também podem ser empregados 
como sondas na seleção de clones em bibliotecas genômicas. Ojanen-Reuhs et 
al. (1997) avaliaram uma biblioteca genômica de X. campestris pv. 
vesicatoria empregando um oligonucleotídeo degenerado construído a partir 
da seqüência N-terminal da proteína FimA da mesma bactéria. Empregando 
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uma combinação de seleção direta de clones com o inserto de interesse, 
seleção de biblioteca de plasmídios e cosmídeos e seqüenciamentodos clones 
positivos, foi possível obter a seqüência integral do gene fimA de X. 
campestris pv. vesicatoria. 
A descrição do gene fimA permitiu a análise da expressão do gene 
(detecção do RNAm de fimA em Northern blot) ou da proteína (Western blot) 
e também foi possível produzir mutantes específicos no gene fimA. FimA é 
uma proteína presente em fímbrias bacterianas e a disponibilidade da 
seqüência deste gene, permitiu a identificação de genes semelhantes nos 
genomas bacterianos seqüenciados, onde foram encontrados homólogos de 
seqüência a fimA em Xylella fastidiosa (Simpson et al., 2000; Van Sluys et 
al., 2003), X. axonopodis pv. citri (Silva et al., 2002) entre outras. Isto 
exemplifica que o trabalho de seqüenciamento requer a comparação com 
genes previamente caracterizados, possibilitando a identificação putativa de 
sua função. 
 
 
CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS GENÔMICAS 
 
Uma alternativa amplamente empregada no isolamento de genes é a 
construção de uma biblioteca genômica. Neste processo o DNA do organismo 
alvo é extraído, purificado e quebrado em fragmentos, através da ação de 
enzimas de restrição ou através de métodos físicos, como a nebulização. Em 
ambos casos, o DNA pode ser fracionado em tamanho apropriado, através de 
eletroforese em gel de agarose, os tamanhos de DNA escolhidos são 
recuperados do gel e então clonados em um vetor apropriado. Através da 
resistência ao antibiótico, clones de E. coli portadores do DNA clonado são 
selecionados. Assim, obtendo-se um elevado número de clones, espera-se 
cobrir a quase totalidade de genes do organismo doador de DNA. No caso de 
um gene em especial, espera-se que uma certa porcentagem dos clones 
contenha o gene de interesse (no mínimo um clone). 
A próxima etapa é selecionar o clone que possui o gene de interesse 
para caracterizá-lo. Dentre as possibilidades viáveis incluem-se: a) seleção da 
biblioteca com sondas heterológas ou b) seleção para atividade do produto 
gênico. Na primeira possibilidade, uma grande população bacteriana pode ser 
avaliada quanto à presença do gene se as células forem crescidas em meio de 
cultura, transferidas para uma membrana de nylon, lisadas e então a 
membrana é hibridizada com uma sonda para identificar os clones portadores 
do gene de interesse. Através de métodos de detecção é possível identificar o 
clone portador do gene, ou parte do gene de interesse. Ressalta-se que esta 
sonda pode ser produzida a partir de um gene similar ou a partir da 
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informação da seqüência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene de 
interesse. Podemos também avaliar os clones obtidos quanto à produção do 
produto protéico do gene de interesse. Caso anticorpos estejam disponíveis 
contra a proteína produzida pelo gene, estes podem ser empregados como 
método de detecção do clone portador do gene de interesse. Outra alternativa 
é o uso de qualquer outro ligante que se lige ao produto gênico ou à própria 
atividade biológica da proteína. 
No caso de enzimas, a atividade enzimática pode ser empregada 
como um marcador para selecionar o clone que contém o gene de interesse. 
Diversas enzimas bacterianas que degradam a parede celular vegetal tiveram 
seu genes clonados e seqüenciados desta maneira. Keen et al. (1984) clonaram 
uma liase do pectato de E. chrysanthemi através da seleção de uma biblioteca 
genômica em E. coli em meio de cultura com pectato. Collmer et al., (1985) 
também clonaram liases do pectato de E. chrysanthemi da mesma maneira. 
He & Collmer (1990) clonaram uma poligalacturonase a partir de uma 
biblioteca genômica de E. chrysanthemi. A identificação do clone de E. coli 
portador do gene de interesse foi feita através de reação contra um anticorpo 
que reconhece uma exopoligalacturonase. Uma característica destas enzimas é 
a presença de múltiplas formas enzimáticas (isoenzimas) o que corresponde a 
diferentes genes. Lojkowska et al. (1995) clonaram uma nova liase do pectato 
de E. chrysanthemi, a partir de uma biblioteca genômica construída com o 
DNA de uma linhagem mutagenizada, e que não apresentava as cinco liases 
do pectato previamente caracterizadas. Park et al. (2000) empregaram a 
análise de uma biblioteca genômica de E. chrysanthemi em E. coli para 
clonar e seqüenciar uma celulase, identificando o clone portador do gene em 
ensaio em meio de cultura contendo celulose (CMC). 
A partir do ponto em que há indicação de que um clone ou diversos 
clones possuem o gene de interesse é possível transferi-lo para outros vetores, 
como os vetores de expressão, bem como determinar sua seqüência, um 
aspecto que será abordado em seguida. 
A clonagem através de bibliotecas genômicas ou o seqüenciamento 
completo de genomas, pode estimular a busca da função dos genes. Neste 
sentido, a produção de organismos mutagenizados ou mutantes em 
determinado gene é o caminho a ser percorrido quando visamos determinar a 
função de um gene, caso este gene seja desconhecido ou sua proteína não 
tenha atividade ou função detectada. 
Diversos são os mecanismos de virulência empregados pelas 
bactérias fitopatogênicas. A funcionalidade destes mecanismos requer que os 
mesmos estejam em contato com o hospedeiro. Hettwer et al., (1998), 
clonaram e seqüenciaram o gene da levansacarase (lsc) de Pseudomonas 
syringae, empregando seleção de biblioteca genômica em meio contendo 
sacarose. Clones contendo o gene lsc apresentam aspecto mucóide em meio 
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de cultura com sacarose, devido a produção do PSE levan. Os clones positivos 
apresentaram um fragmento de restrição enzimática (PstI) comum, sendo 
então subclonados e os clones resultantes avaliados da mesma forma. A partir 
destes clones positivos na segunda rodada de seleção, foi efetuado o 
seqüenciamento do inserto de DNA, sendo que através de algoritmos 
computacionais observou-se a presença de um quadro aberto de leitura - ORF 
(open reading frame) com alta similaridade a outras levansacarases. No 
mesmo trabalho, o gene lsc foi usado como sonda para observar a presença do 
gene em diferentes linhagens bacterianas, sendo que este somente foi 
observado em linhagens produtoras do polissacarídeo levan. 
Da mesma maneira, a produção de mutantes, por exemplo mutantes 
gerados através da inserção de transposons, podem ter fenótipos que elucidem 
processos biológicos de interesse. De posse deste mutante, podemos isolar e 
seqüenciar a região onde o DNA exógeno inseriu-se e então determinar o gene 
responsável pela alteração fenotípica observada. Qimron et al., empregando 
mutagênese por transposon, efetuaram o seqüenciamento direto do DNA de 
clones mutantes, revelando qual o gene mutagenizado e permitindo a rápida 
caracterização de mutantes de Salmonella sp. (Qimron et al., 2003). 
Entretanto, a mesma metodologia pode ser aplicada a bactérias 
fitopatogênicas. Por exemplo, Brumbley et al. (2004) empregaram técnica 
semelhante para caracterizar inserções por transposon em Leifsoni xyli subsp. 
xyli. Esta metodologia é uma alternativa ao processo clássico de clivar o DNA 
do mutante, cloná-lo em vetores e então determinar qual o gene afetado pela 
mutação (inserção por transposon). Os mutantes gerados nestes casos podem 
servir de ponto de partida para a caracterização de novos genes bacterianos. 
Estes genes podem ser identificados em bibliotecas genômicas através de 
sondas, sendo então sequenciados e caracterizados molecularmente. 
A ampla disponibilidade de vetores, banco de dados e enzimas que 
modificam o DNA (figura 1) permite uma ampla variação nas técnicasde 
clonagem. Maior detalhamento da função das enzimas que modificam ou 
cortam o DNA podem ser encontradas em Alberts et al., 1994; Ausubel et al., 
1994; Sambrook et al., 1989. Desta forma, o DNA clonado ou amplificado via 
PCR serve como molde para efetuar o seqüenciamento destes fragmentos de 
DNA. Nos próximos itens serão abordados as formas de obter-se as 
informações das seqüências de DNA destes fragmentos. 
 
 
SEQÜENCIAMENTO DO DNA 
 
Atualmente, o seqüenciamento de trechos de DNA tornou-se tarefa 
corriqueira e de execução relativamente fácil (figura 2). Entretanto, esta 
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Fragmento de DNA amplificado
(PCR / termociclador)
RNAm 
DNA 
(plasmidial ou genômico)
Síntese do DNAc
Construção de uma biblioteca 
de DNAc
Extração de plasmídios
Reação de sequenciamento
(PCR / termociclador)
Separação dos fragmentos e 
detecção do sinal
(sequenciador)
Limpeza e precipitação do DNA
(sintetizado e marcado 
com fluoróforos)
Fragmentação
(enzimática ou mecânica)
Seqüenciamento direto
Clonagem Clonagem
Análise da qualidade da 
seqüência
Interpretação do resultados
 
 
Figura 2. Etapas para o seqüenciamento. Partindo de um DNA alvo, seja um 
fragmento de DNA amplificado em PCR, um DNAc ou um 
fragmento genômico, as etapas básicas até obter o seqüenciamento 
deste fragmento são semelhantes. No caso de um fragmento 
amplificado pode-se efetuar a clonagem ou sequenciá-lo 
diretamente. A escolha recairá pelo tamanho do fragmento, 
disponibilidade de primer e objetivo do seqüenciamento. Quando 
efetuada a clonagem (vide figura 1), selecionam-se as colônias 
bacterianas, é efetuada a extração do plasmídio, quantificação do 
DNA plasmidial, amplificação, seqüenciamento e análise do 
resultado. 
 
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percepção não pode deixar de levar em consideração os custos desta tarefa, 
laborial e financeiro, a necessidade de computadores e programas apropriados 
para efetuar a análise e interpretação dos resultados do seqüenciamento, bem 
como as dificuldades intrínsecas em se seqüenciar determinados trechos de 
DNA. Para o iniciante, consultar a literatura pertinente é um bom ponto de 
partida para entender este universo de letras. Por exemplo, Patnaik & 
Blumenfeld (2001) é um bom texto que orienta a escolha dos tipos de 
ferramentas para análise e comparação de seqüências. Seqüências estas 
geralmente em grande número e em que é necessário o menor tempo possível 
para análise (www.biosupplynet.com/cfdocs/btk/aboutbtk.cfm). Algoritmos 
computacionais como o Blast (Altschul et al., 1990) e Phred + Phrap (Gordon 
et al., 1998) oferecem tutoriais que contém detalhadas informações a respeito 
do funcionamento e da utilidade destas ferramentas. 
Nesta seção será abordado o seqüenciamento em seus princípios e 
técnicas. Assume-se que para tanto, o DNA a ser sequenciado foi obtido 
através de um método ordinário e está pronto para ter sua seqüência 
nucleotídica revelada (figura 2). 
As técnicas de seqüenciamento de DNA são baseadas 
principalmente em eletroforese usando géis de poliacrilamida desnaturantes 
de alta resolução ou eletroforese capilar. Os géis de seqüenciamento são 
capazes de resolver oligonucleotídeos fita simples que diferem de tamanho 
por um simples desoxinucleotídeo. A chave para determinar a seqüência dos 
nucleotídeos é gerar, em reações químicas ou enzimáticas, todos 
oligonucleotídeos que terminam nas variáveis A, T, G, ou C. Os produtos das 
reações são resolvidos em um gel de seqüenciamento ou em eletroforese 
capilar contendo uma resina apropriada. Métodos de detecção da terminação 
do oligonucleotídeo revelam a composição neste nucleotídeo e base após base 
obtêm-se a seqüência do fragmento de DNA. 
Dois métodos são largamente usados para determinar seqüências de 
DNA: o método dideoxi-enzimático e o método químico, que diferem 
principalmente na técnica utilizada para gerar o padrão de nucleotídeos. 
 
 
MÉTODO DIDEOXI OU ENZIMÁTICO 
 
Este método foi originalmente desenvolvido por Sanger e 
colaboradores (Sanger et al., 1977, 1980), utilizando a DNA polimerase para 
sintetizar uma cópia complementar de um DNA molde fita simples. A síntese 
da cadeia de DNA pela polimerase do DNA requer uma fita dupla com uma 
extremidade 3‟ livre. “In vitro” a elongação da cadeia ocorre na terminação 3‟ 
de um DNA primer sintético, que está anelado ao DNA molde. A polimerase 
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catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo hidroxila na 
terminação 3‟ do primer e o grupo fosfato na posição 5‟ do desoxinucleotídeo 
adicionado à reação. Assim, o crescimento da cadeia ocorre na direção 5‟ 
3‟. O seqüenciamento dideoxi ocorre devido a habilidade da DNA polimerase 
usar 2‟,3‟-dideoxinucleosídeo trifosfatados (ddNTPs) como substrato. Quando 
um dideoxinucleosídeo trifosfatado é incorporado à extremidade 3‟ da fita 
crescente, a elongação da cadeia é terminada devido a ausência do grupo 
hidroxila na posição 3‟. Para gerar os quatro padrões de seqüenciamento 
somente um dos quatro possíveis ddNTPs é incluído em cada uma das quatro 
reações (A, T, C ou G). O método dideoxi original de Sanger foi desenvolvido 
usando uma DNA polimerase de E. coli conhecida como Klenow fragment: 
um oligonucleotídeo sintético é adicionado ao DNA molde, essa mistura é 
dividida em quatro tubos e em cada tubo é adicionado a polimerase e os 
dNTPs, sendo um deles marcado radioativamente (um dos quatro ddNTPs). 
Sob essas condições, o primer é extendido e marcado até a incorporação de 
um ddNTP específico que causa a sua terminação. 
Como o seqüenciamento dideoxi requer uma fita simples (molde) 
no qual o primer possa se anelar, estes moldes podem ser gerados usando 
vetores especializados derivados do M13, um fago filamentoso de E. coli que 
contém uma molécula de DNA fita simples circular (Messing, 1983, 1988). O 
seqüenciamento dideoxi também pode ser realizado usando um DNA fita 
dupla, com ciclo de seqüenciamento envolvendo desnaturação do DNA em 
cada ciclo da reação. O seqüenciamento de fita dupla geralmente é usado 
como método rápido para verificar a construção de um plasmídio em 
particular. Para projetos de seqüenciamento em larga escala, o uso de um 
sistema de vetor fita simples, como a série M13mp é usada devido à alta 
qualidade na geração das seqüências. Entretanto, os plasmídios oferecem a 
vantagem da obtenção de seqüências das extremidades 5‟ e 3‟; esta 
característica é muito valiosa para o seqüenciamento genômico usando 
fragmentos de DNA produzidos randomicamente (método shotgun, onde 
ocorre fragmentação aleatória do DNA por processos físicos - nebulização, ou 
químicos - restrição enzimática) de 500 a 800 pares de bases. Os fragmentos 
subclonados em plasmídios são seqüenciados nas duas direções utilizando 
primers complementares ao plasmídio. Os produtos da PCR também podem 
ser seqüenciados pelo método dideoxi (Figura 2). 
Um avanço que permitiu seu uso em larga escala foi a aplicação do 
ciclo térmico, onde um pequeno número de moléculas de DNA são 
repetitivamente utilizados para gerar um padrão de seqüenciamento. A 
mistura de reação de seqüenciamento dideoxi (DNA molde, primer, ddNTPs, 
dNTPs e DNA polimerase termoestável) são submetidos a repetidos ciclos de 
desnaturação, anelamento e síntese similares ao PCR. Desta maneira, ocorre a 
Métodos de isolamento e seqüenciamento de genes de bactérias – 13 
 
RAPP – Volume 12, 2004amplificação linear dos produtos de seqüenciamento, usando menos DNA 
molde que requeridos usualmente. O ciclo térmico elimina as exigências para 
uma reação de anelamento que precedem a reação de seqüenciamento em si e 
desnaturação de DNA fita dupla. 
Além disso, estão disponíveis comercialmente seqüenciadores 
automáticos que foram elaborados para reações de seqüenciamento 
enzimático, automatizando a eletroforese em gel ou eletroforese capilar, 
detecção do padrão de bandas de DNA e análises dessas bandas. As fitas de 
DNA marcadas com os fluoróforos são aplicadas manualmente ou de forma 
automatizada, enquanto a eletroforese e a análise são controladas através de 
programas computacionais. A detecção ocorre no final do gel, de duas 
maneiras possíveis: em um método, o DNA é marcado com substâncias 
fluorescentes (fluoróforos de diferentes comprimentos de ondas como FAM - 
525 nm, JOE - 555 nm, TAM - 580 nm e ROX - 605 nm) ou radioativas, estes 
se movem através do gel e seus sinais são captados por um detector que 
guarda as informações. No segundo método, o padrão de bandas do DNA 
marcado com substâncias fluorescentes é detectado usando uma câmara de 
imagem. Todos seqüenciadores automatizados possuem sistemas de 
armazenamento de dados, programas de análises ou mecanismos que 
possibilitam a análise dos dados. 
A marcação fluorescente pode ser incorporada nos produtos de 
seqüenciamento através do primer ou dos ddNTPs. Num sistema mais 
simples, um único primer marcado fluorescentemente é usado e as quatro 
reações são corridas em linhas separadas no gel (Ansorge et al., 1987; 
Brumbaugh et al., 1988; Fujita et al., 1990; Kambara et al., 1988; Middendorf 
et al., 1988; Rosenthal et al., 1990; Sears et al., 1992). Outros sistemas usam 
os mesmos primers marcados com quatro diferentes fluorocromos (Dye 
primers) (Connel et al., 1987; Johnston-Dow et al., 1987; Mardis & Roe, 
1989; Smith et al., 1985; Wilson et al., 1988) ou um conjunto diferente de 
fluorocromo específico para cada ddNTP (Prober et al., 1987; Zagursky & 
MacCormick, 1990). Nesses dois últimos sistemas, como os fluorocromos dos 
primers ou dos ddNTPs possuem comprimentos de ondas diferentes, todas as 
quatro reações são corridas numa única linha do gel e os fragmentos 
terminados nas quatro diferentes bases (A, T, C, G) são identificados pelas 
quatro emissões de cores sob a excitação do laser. 
Entre os métodos de detecção por fluorescência, este método de 
quatro cores baseado no método dideoxi-enzimático de Sanger é escolhido 
como técnica para seqüenciamento de projetos em grande-escala, como no 
seqüenciamento de genomas bacterianos de Xylella fastidiosa, Xanthomonas 
axonopodis pv. citri, Xanthomonas campestris pv. campestris entre outras 
(rede ONSA). 
Os sistemas de automação foram um grande avanço na elaboração 
14 – Nelson A. Wulff e Elaine C. Martins 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
destes projetos genomas, e para seu seqüenciamento completo são necessárias 
várias etapas: 
1- Construção de biblioteca genômica: consiste no isolamento do 
DNA do organismo em grande escala, fragmentação deste DNA pelo método 
Shotgun e clonagem dos fragmentos em vetores específicos, podendo ser 
usados plasmídios, cosmídeos e plasmídios BAC. Os tamanhos dos 
fragmentos clonados é parte da estratégia de seqüenciamento, até 2000 pares 
de bases para plasmídios e até 40 kb para cosmídeos; 
2- Fase de seqüenciamento: É o sequencimento propriamente dito, 
com análise das seqüências através de programas computacionais e 
algoritmos. A análise do alinhamento e a montagem de uma seqüência 
consenso ou contig para as leituras (reads) de um mesmo plasmídio, podem 
ser efetuadas no conjunto de programas Phred + Phrap + Consed (Gordon et 
al., 1998). O algoritmo Phred analisa a qualidade do cromatograma, ou seja, 
da seqüência obtida a partir do seqüenciador. A seguir, o algoritmo Phrap faz 
a montagem das seqüências, criando os contigs pelo alinhamento das regiões 
sobrepostas nas diferentes seqüências. A visualização dos dados gerados pelo 
Phrap é efetuada pelo algoritmo Consed, onde pode-se verificar a qualidade 
de cada base e a visualização de todo o “contig”, das seqüências que o 
compõem e da seqüência consenso. Neste mesmo aplicativo pode-se 
visualizar as possíveis ORFs em todos os quadros de leitura possíveis. 
Valores de Phred + Phrap de 20 correspondem a seqüências com 99% de 
precisão. Geralmente são seqüenciados 15000 leituras por Mb do genoma, 
ademais, o número de seqüências deve cobrir 8 a 10 vezes o tamanho do 
genoma; 
3- Etapa de fechamento: Inclui a montagem das seqüências, 
fechamento de regiões não seqüenciadas e a edição. Atualmente são utilizados 
computadores de alta capacidade de processamento e algoritmos como o Blast 
(Altschul et al., 1990, 1997) e programas de livre acesso que usam sistemas 
operacionais para auxiliar nas montagens dos genomas, e elucidar regiões que 
por ventura possam estar em repetições. 
4- Anotação: São utilizados programas que identificam % GC, 
número de ORFS encontradas, número de operons de RNAr, número de genes 
de RNAt e análise de conjuntos de proteínas potencialmente codificadas pelo 
organismo classificadas de acordo com categorias como proteínas similares a 
outras já conhecidas; similares a outras porém com função desconhecida; 
proteínas similares a proteínas hipotéticas conservadas e proteínas 
potencialmente hipotéticas. Um programa amplamente empregado é o 
Glimmer (Salzberg et al., 1998; Delcher et al., 1999); 
5- Seqüência completa do genoma, disponibilização em bancos de 
dados para consulta (tabela 1). 
Uma grande inovação nos seqüenciadores automatizados foi a 
Métodos de isolamento e seqüenciamento de genes de bactérias – 15 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
produção de um seqüenciador que utiliza a eletroforese por capilaridade (10 a 
100 μm de diâmetro interno) contendo um polímero e detecção de 
fluorescência induzida por laser. A separação dos fragmentos é rápida e com 
alta resolução, sem produzir artefatos devido ao aquecimento (gel de 
seqüenciamento). O uso de múltiplos capilares acoplados com fluorescência 
laser induzida foi reportada pela primeira vez em 1992 por Huang e 
colaboradores (Huang et al., 1992). Os seqüenciadores automáticos por 
capilaridade (MegaBACE 1000, MegaBACE 4000, ABI 3100 e ABI 3730) 
permitem a análise de 96 amostras simultaneamente. A matriz de separação é 
um polímero de alta resolução que permite o seqüenciamento de trechos de 
DNA relativamente maiores que os obtidos em géis, podendo obter leituras de 
até 1000 bases em tempo menor. Essa magnitude aumenta se compararmos a 
velocidade ao tradicional seqüenciamento ou seqüenciamento semi-
automático, onde são mantidas as etapas de preparação do gel de 
poliacrilamida, aplicação das amostras manualmente, eletroforese de 7 a 10 
horas e o alinhamento das seqüências após a formação da imagem do gel pelo 
programa para análise de sua qualidade. 
Outras tecnologias também são utilizadas para sequeciamento de 
DNA, muitos utilizam o método dideoxi com marcadores radioativos ([α-
35S]dATP, [α-32P]dATP, [α-33P]dATP, [γ-35S]dATP ou [γ-32P]dATP). Apesar 
de rápido, o seqüenciamento dideoxi oferece excelente resolução de bandas 
quando nucleotídeos radioativos são empregados. Entretanto, estruturas 
secundárias e a composição do DNA molde podem algumas vezes causar 
terminação prematura pela DNA polimerase. Ademais, o fragmento Klenow é 
mais propenso a esse problema do que a T7 DNA polimerase ou outras 
polimerases. 
Uma alternativa ao sequenciamento radioativo seria utilizar a 
quimioluminescência, um método de detecção comparável em sensibilidade 
ao método de marcaçãoradioativa. A detecção dos produtos de 
seqüenciamento ocorre pela reação de quimioluminescência que pode ser 
monitorada por autoradiografia. Um primer biotinilado é usado nas reações de 
seqüenciamento dideoxi. Depois da eletroforese dos produtos de 
seqüenciamento em gel, estes são transferidos e ligados numa membrana de 
nylon. Os produtos de seqüenciamento são detectados usando estreptavidina, 
fosfatase alcalina biotinilada e um substrato para fosfatase alcalina que emite 
luz, sendo detectada por radiografia (Beck et al., 1989; Evans, 1991; Martin et 
al., 1991). Alternativamente, as reações de seqüenciamento dideoxi podem ser 
feitas com primer não biotinilado e sem radioatividade. Após eletroforese e 
transferência para a membrana de nylon, os produtos de seqüenciamento são 
hibridizados com sonda biotinilada complementar ao primer. 
 
 
16 – Nelson A. Wulff e Elaine C. Martins 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
MÉTODO QUÍMICO 
 
O método químico de sequenciamento, desenvolvido por Maxam e 
Gilbert (Maxam & Gilbert 1977, 1980; Rubin & Schmid, 1980; Ambrose & 
Pless, 1987), é uma técnica que utiliza DNA ou RNA marcado nas 
terminações 3‟ ou 5‟, geralmente com 32P. O DNA é dividido em quatro 
tubos, sendo cada um submetido a um tratamento com um reagente químico 
base-específico que cliva randomicamente o DNA ou RNA, como resultado 
cada tubo contém fragmentos de ácidos nucléicos que possuem a mesma base 
na sua terminação, mas em diferentes pontos da molécula onde a base ocorre. 
O conteúdo de cada tubo é aplicado separadamente em gel de poliacrilamida e 
a seqüência pode ser determinada através da autoradiografia. 
Maxam e Gilbert descreveram seis procedimentos de clivagem 
parcial de acordo com a especificidade do tratamento químico (G>A); (A>G); 
(A>C); (C+T) e C, seguidos da adição de piperidina para catalisar a quebra da 
fita nesses nucleotídeos, porém vários tratamentos alternativos base-
específicos tem sido descritos. 
O método de Maxam e Gilbert é baseado na capacidade da 
hidrazina, do dimetilsulfato (DMS) ou do ácido fórmico em modificar bases 
especificamente dentro da molécula de DNA. Em seguida, é adicionado 
piperidina para catalisar a quebra da fita nesses nucleotídeos modificados. A 
especificidade reside na primeira reação com hidrazina, DMS ou ácido 
fórmico os quais reagem em pequena porcentagem das bases. A segunda 
reação, quebra da fita com piperidina, deve ser quantitativa. 
As reações de seqüenciamento químico podem ser feitas com DNA 
fita simples ou dupla. Vetores especializados foram desenvolvidos para 
permitir a marcação única de apenas uma fita do DNA alvo, clonado com 
enzimas de restrição que tem sítios de reconhecimento assimétrico adjacente 
ao DNA clonado. 
A maior vantagem deste método é que problemas associados com a 
síntese do DNA pelas polimerases são eliminados, permitindo o 
seqüenciamento de regiões do DNA que não podem ser seqüenciadas pelo 
método enzimático. Em adição, obter a seqüência de pequenas regiões de 
DNA usando o método químico não requer subclonagem em vetores 
apropriados, como são requeridos para o método dideoxi. Finalmente, a 
clivagem química é um excelente método de seqüenciamento disponível para 
pequenos oligonucleotídeos. 
Atualmente, os modernos espectrômetros de massas, associados a 
formas compatíveis de ionização podem ser empregados na caracterização de 
pequenas seqüências de DNA (~ 100 pb) e avanços nestas técnicas podem 
torná-la factível em maior escala, a despeito de sua altíssima resolução 
Métodos de isolamento e seqüenciamento de genes de bactérias – 17 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
(Fitzgerald & Smith, 1995). 
Embora diga-se que o seqüenciamento é automatizado, inúmeras 
situações exigem o desenvolvimento de técnicas específicas para permitir o 
seqüenciamento de determinadas regiões (regiões repetitivas e genes 
ribosomais), bem como analisar o ordenamento destas seqüências. Estas 
etapas dependem muito mais da criatividade e inovação dos pesquisadores do 
que da automação do processo de seqüenciamento. 
Ishikawa et al. (2003) demonstraram que a tecnologia de 
seqüenciamento transcricional é um método poderoso e preciso parar 
sequenciar regiões ricas em GC, seqüências repetidas simples, grampos 
(repetições invertidas), DNA repetitivo e no fechamento de lacunas em dados 
de seqüenciamento. Tauch et al. (2002) empregaram uma combinação de 
cosmídeos e BAC para efetuar o seqüenciamento do genoma de uma bactéria. 
No seqüenciamento do genoma de Xylella fastidiosa, Frohme et al. (2000) 
citam que nas lacunas observadas durante o processo de ordenamento das 
seqüências (contigs), dois destes espaços correspondiam ao operon do DNAr, 
presente em duas unidades. Sabe-se da dificuldade em clonar genes 
ribosomais, devido ao efeito deletério destes genes no organismo que hospeda 
o plasmídio. 
O seqüenciamento é uma ferramenta importante para demonstrar 
que pequenas variações na seqüência de um gene, assim como deleções e 
inserções, podem alterar a função deste gene. Swords et al., 1996, 
demonstraram que dois tipos de Xanthomonas possuem, ou uma inserção de 
5 pb ou a região 3‟ do locus avrBs2 divergentes. Linhagens de X. campestris 
pv. vesicatoria que possuem o gene avrBs2 são reconhecidas por hospedeiros 
(pimentão) que possuem o gene de resistência Bs2. Este trabalho é um 
exemplo da necessidade de se conhecer a seqüência do gene em detalhes, pois 
a simples amplificação ou detecção via Southern blot indicaria que ambos 
clones são positivos para o gene em questão. 
Na tabela 1 estão reunidas informações dos genomas bacterianos 
que foram ou estão sendo seqüenciados completamente. Embora a tendência 
desta lista é de crescer e aumentar a disponibilização destas informações, de 
grande importância são os trabalhos que visam caracterizar a funcionalidade 
destes genes. Na revisão de Van Sluys et al. (2002), encontram-se 
informações detalhadas da comparação do genomas de diversas bactérias 
fitopatogênicas. 
 
 
COMENTÁRIOS FINAIS 
 
Antes de ser um texto teórico, com a descrição de variadas técnicas 
18 – Nelson A. Wulff e Elaine C. Martins 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
e possibilidades envolvidas na clonagem e seqüenciamento, os autores 
optaram por tratar o assunto de forma expositiva, fornecendo embasamento ao 
leitor interessado em buscar um ponto de partida no assunto. Objetivamos 
ressaltar o aspecto histórico destes processos, pois é importante dimensionar 
os avanços a que estamos sendo submetidos atualmente. Falar em clonagem, 
seqüenciamento e também em transgênicos, tornou-se corriqueiro e em muitas 
ocasiões virou manchete de jornal. Assim, é imperativo que o estudioso de 
fitopatologia tenha argumentos para entender e discutir o assunto, também 
como possibilidade de resolver questões prementes de sua especialidade. O 
emprego de técnicas de biologia molecular associado ao desenvolvimento de 
técnicas analíticas fornece dados detalhados das sutis relações entre o 
hospedeiro e patógenos. Compreender esta interação é o objetivo de todos 
nós. Nossa intenção foi assim, esclarecer o assunto proposto e contribuir para 
seu desenvolvimento, pois muito conhecimento foi gerado com esta 
tecnologia e muito será feito. 
 
 
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