Tolerância Imunológica e Linfócitos T reguladores

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Aula “Tolerância Imunológica e Linfócitos T reguladores” áudio 11/05/2016
Em rosa, são coisas que o professor está enfatizando ou que já foram explicadas em outras aulas.
Os linfócitos t virgem nunca foram ativados antes por nenhum antígeno em sua vida e são esses que saem do timo. 
Onde ficam os nossos linfócitos virgens? Nos órgãos linfoides secundários. 
Os linfócitos, saem do Timo pela circulação sanguínea até que encontre órgão linfoide secundário, assim que o encontra, entram nele através de um epitélio especializado que é o Endotélio de veias endoteliais altas (HEV), que tem como característica ser um endotélio ativado pelo aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação. 
Então todos os órgãos linfoides secundários possuem esse tipo de endotélio. As células são capazes são capazes de atravessar esse endotélio e entrar dentro do órgão linfoide secundário, neste caso mais especificamente estamos nos referindo os órgãos linfoides secundários associados a Linfa (linfonodos, placa de Peyer, Malt). 
O baço já é conectado ao sangue, então quando o linfócito passa por dentro do baço (em algum momento todo linfócito precisa passar), ele passa a ficar ali por um período de tempo para ser ativado mas nos órgãos que não são banhados por sangue, como baço (órgão branco), esse procedimento precisa ocorrer. 
Isso difere no caso de outras células do sangue como neutrófilos, macrófagos, neste caso o pré-requisito para a célula que passa pelo endotélio ativado saia do endotélio são 2, primeiro, o endotélio precisa estar ativado (expressão de integrinas, selectinas para fazer rolamento e adesão) mas pra ele efetivamente sair, precisa ser atraído por quimiocinas, então no endotélio desses órgãos existem quimiocinas que são produzidas dentro do endotélio dos órgãos linfoides secundários que atraem os linfócitos maduros, virgens. 
Ou seja é um tipo de migração parecida com a que vimos no processo de inflamação, porém um pouco diferente, já que na inflamação as células são atraídas por quimiocinas inflamatórias, já nessa há uma migração fisiológica já que todos os órgãos do nosso corpo produzem algumas quimiocinas para poder atrair células que precisam ir para aquele órgão. 
No caso do órgão linfoide secundário, os linfócitos virgens chegam da circulação sanguínea, quando chegam no endotélio ativado conseguem fazer o rolamento e adesão, são atraídos pelas quimiocinas de dentro do órgão linfoide secundário, saem do endotélio e vão para dentro do órgão linfoide secundário. Chegando nele, eles podem encontrar uma célula dendrítica que esteja apresentando um antígeno e serem ativadas ali, caso não encontre, eles seguem o fluxo da linfa e vão para o próximo órgão linfoide secundário, depois para outro órgão linfoide secundário e assim por diante, até que encontre um antígeno ou vá para o sangue novamente, circulam novamente e depois vão para órgão linfoide secundário. O linfócito virgem ou maduro sempre faz esse procedimento.
Processo de ativação e diferenciação de linfócitos 
Existem diversos tipos de linfócitos T, os principais são os que vamos falar hoje.
Ativação é o processo de reconhecimento de antígeno, são os sinais que os linfócitos recebem quando interagem com a célula dendrítica. Quando qualquer linfócito é ativado, a primeira coisa que acontece com ele é proliferar. Por que? Possuímos uma diversidade de linfócitos no corpo (10 elevado a 11) Essas populações podem ser chamadas de clones (células geneticamente iguais). E cada um tem um receptor diferente. Quando ele é ativado sofre proliferação. Após isso ocorre diferenciação.
Diferenciação é: o linfócito virgem se transforma em alguma coisa. O linfócito T ativado irá realizar algum tipo de resposta imunológica. Se ele não for ativado continuará circulando sucessivamente.
 Para cada antígeno, estipula-se que existem de 100 a 300 linfócitos capazes de responder contra ele. Esse número de linfócitos que respondem não é suficiente para combater a bactéria, então quando um desses linfócitos encontra a bactéria e é ativado ocorre a proliferação (primeira coisa que ele faz). O evento de proliferação ocorre de forma bem agressiva, como se fosse um tumor chegando até a 1 milhão de células capazes de responder, isso se chama expansão clonal.
Linfoadenomegalia, que é o aumento do tamanho dos linfonodos. Um exemplo é quando ocorre infecção de garganta e os linfonodos ficam aumentados e apalpáveis, devido à expansão clonal. No caso dessas infecções sistêmicas, pode ocorrer hepatoesplenomegalia que é o aumento do fígado e do baço pelo mesmo motivo. O fígado também pode ser um órgão linfoide, no adulto quando há infecção expansão clonal intensa, na tentativa do baço não romper, ele libera algumas células que vão para o fígado e começam a proliferar lá. 
No caso do CD8, são linfócitos citotóxicos. Ele mata a célula que apresente um peptídeo correto e um MHC de classe 1, ou seja citotóxico é tóxico para a célula e essa é sua função. Atua um pouco diferente da célula CDK que precisa dos sinais. No caso das CD8 são adaptativas que precisam encontrar uma célula que apresente mhc classe 1 ou peptídeo correto. Todo linfócito T para exercer sua função precisa de sinapse imunológica, então mesmo que ele seja efetor não vai exercer função se não encontrar uma célula que apresenta mhc + peptídeo para ele se ligar. A função primordial do linfócito CD8, é matar células infectadas por vírus, mas ele também vai ser importante para algumas bactérias intracelulares e tumores. 
O linfócito CD4 é um pouco mais complexo, 
CTL (linfócito efetor do cd8), TH (efetor cd4 “auxiliador”).
A principal função da célula TH1 é matar linfócitos infectados, pois aumenta, auxilia na capacidade de destruir a bactéria. Ele também auxiliar o macrófago a destruir qualquer microrganismo que consiga sobreviver dentro do macrófago, auxiliando ele a eliminar.
O linfócito th17 auxilia na função dos neutrófilos.
O Tregulador é uma célula supressora, inibidora. Especializada em suprimir respostas de linfócitos cd4 e cd8.
Sinapse imunológica é um local específico de encontro da célula apresentadora de antígeno e o linfócito T, e este pode interagir com a célula apresentadora de duas formas, uma é através do TCR, reconhecendo o MHC e através de moléculas de adesão para firmar a interação entre a célula apresentadora e o linfócito T.
As células apresentadoras de antígeno são, nos órgãos linfoides secundários, as células dendríticas. Outras que podem fazer isso são macrófagos e linfócitos B, em situações de extrema inflamação. 
A célula dendrítica é uma célula profissional em apresentar antígenos por duas razões, uma delas é ser ativada nos tecidos e sair do órgão linfoide secundário, o segundo motivo é que elas são capazes de expressar o segundo sinal, a célula co-estimulatória B7”1” ou B7”2”. 
B7 é um sensor que demonstra a resposta inflamatória. A célula dendrítica imatura que está nos tecidos encontra o patógeno e é ativada por PAMPS. A primeira coisa que ela faz é processar o patógeno e depois migrar para os órgãos linfoides secundários, aumentando a expressão de mhc e moléculas co-estimulatória. 
Para que um linfócito T virgem seja ativado, precisa de 2 sinais, primeiro e segundo sinal. O primeiro e o segundo sinal estão relacionados com vias intracelulares que vão levar a ativação do linfócito T, a célula dendrítica expressa o segundo sinal que pode ser B7”1” ou B7”2” e expressa o primeiro sinal que é o MHC+peptídeo e com isso o linfócito T reconhece o primeiro e segundo sinal.
O primeiro sinal leva a ativação do linfócito T, e o segundo sinal leva a capacidade dele sobreviver.
Esses dois sinais em conjunto levam a ativação do linfócito T e a sobrevivência do linfócito T. ou seja ele vai poder ser ativado e proliferar e vai desenvolver capacidade de sobreviver através de proliferação intensa. 
O terceiro sinal vem na forma de citocinas, é o sinal de diferenciação que vai definir qual tipo de linfócito vai ser ativado. São citocinas que a célula apresentadora de antígenos produz.O sistema imune não está confinado em nenhum lugar, ele é um conjunto de órgãos e células em diversos locais. Quando há algum tipo de agressão em determinado local, todo o sistema converge para aquele local, especificamente para controlar a agressão. Para que isso aconteça, existe um sistema de comunicação por célula-célula, ou citocinas que elas produzem. 
Essas citocinas produzidas são derivadas da resposta inflamatória, a célula dendrítica estava no tecido e daí ocorre uma resposta inflamatória direcionada para aquele dano e a resposta inflamatória está correlacionada com o tipo de patologia que está acontecendo naquele tecido no momento. E a célula dendrítica percebendo tudo isso, vai para o órgão linfoide secundário e vai produzir citocinas lá. Ou seja funciona como uma espécie de mensageiro, ela sai do seu local, vai para o órgão linfoide secundário e suas citocinas produzidas são as informações derivadas da resposta inflamatória, essas citocinas vão “dizer” o que estava acontecendo no tecido periférico e essas citocinas do terceiro sinal vão determinar a diferenciação de linfócito T. 
Relembrando, Existem vários tipos de linfócitos que podem surgir. Alguns mais relacionados a patógenos dentro de macrófagos, outros relacionado a helmintos e alergias, outros relacionados a bactérias extracelulares com ação de neutrófilos principalmente... 
As que estamos estudando agora estão mais relacionadas a supressão e quem vai determinar o tipo de linfócito que vai surgir é a célula dendrítica, por ir até o órgão linfoide secundário e dizer o que tem que ser formado. 
Relembrando, o que o primeiro e o segundo sinal fazem? Induzem a ativação e a sobrevivência da célula. A primeira coisa que um linfócito faz quando é ativado é proliferar, a expansão clonal. Expansão clonal é a proliferação exacerbada de linfócitos T quando ativados. O primeiro (MHC) e segundo sinal (B71 e B72) são interações bioquímicas, que envolvem proteínas, receptores e ligantes. Os receptores reconhecem os ligantes e são ativadas, e com isso a célula responde expressando uma série de proteínas que estão relacionadas com transmissão de sinais. 
No final de tudo isso, são ativados 3 fatores de transcrição. O primeiro deles é o NFK-b, que possui funções da imunidade adaptativa também, o segundo deles é o NF-aT (fator nuclear de linfócitos T ativados), e o último é o AP-1. Com o primeiro e segundo sinais, esses 3 fatores de transcrição precisam ser ativados necessariamente. Se existir apenas o primeiro sinal, apenas o NF-aT é ativado. Se existir apenas o segundo sinal, só o NFK-b vai ser ativado. Já os dois sinais precisam estar presentes para que AP-1 seja ativada. 
O gene mais importante neste caso, é o gene para a produção de IL2, Inter leucina 2, ela é responsável pela expansão clonal. A IL2 é um fator que induz a proliferação de linfócitos T. os 3 fatores de transcrição se ligam no promotor da IL2 e induzem a expressão do gene. Se você pensar o seguinte: na área de linfócitos T, há muitos linfócitos T, relativamente desorganizados dentro do linfonodo. 1 desses linfócitos, vai conseguir interagir com uma célula apresentadora e vai receber o primeiro e o segundo sinais e daí ele vai começar a produzir IL2, secretar IL2. Esse linfócito recebeu as informações da célula apresentadora porque ele é específico ao que é apresentado e isso significa que os outros não são capazes de reconhecer o que ela está apresentando. Um exemplo, é uma infecção bacteriana em determinado local do corpo, a célula dendrítica digere e fagocita a bactéria, sai e vai para o órgão linfoide secundário apresentando um pedacinho daquela bactéria, o linfócito neste caso, para ser ativado precisa reconhecer esse pedacinho da bactéria, e só ele pode ser ativado e se proliferar. A IL2 precisa atuar apenas neste linfócito ativado, as células que estão próximas ao linfócito ativado não podem utilizar dessa IL2. 
Como isso é possível, se ficam todos grudados um no outro? Vamos relembrar.... Qual é o pré-requisito para uma célula usar uma citocina? Receptor! Então nossos “NFK-b”, “NF-aT” e “AP-1”, além de induzirem a secreção de IL2, induzem também a expressão de receptor de IL2. O receptor completo de IL2 é da família Gama comum, que tem 3 subunidades, que são Alfa, Beta e Gama. 
Os linfócitos T virgens (que não foram ativados), só expressam o receptor de afinidade moderada de IL2, que é um receptor formado pelas cadeias gama e beta. Esse receptor de afinidade moderada de IL2 não é capaz de interagir com IL2 pra poder gerar a proliferação das células. Então todos os linfócitos virgens tem esse receptor Beta e Gama que não é capaz de reconhecer IL2 pra fazer expansão clonal. 
Quando o linfócito recebe o primeiro e o segundo sinal e os fatores de transcrição são ativados, ele então expressa a subunidade Alfa IL2. Essa cadeia alfa de IL2 também é conhecida como CD25 (guarde esse nome), esse nome se refere a produção para o próprio uso, maneira autócrina. Só o linfócito ativado pode usar a IL2 para proliferar no linfonodo todo.
Reafirmando, expansão clonal, é o aumento de clones, só os linfócitos capazes de reconhecer o MHC+peptídeo que a célula dendrítica está apresentando que vão ser capazes de expandir, os outros não vão interagir com a célula dendrítica, não vão fazer sinapse imunológica com ela, com isso não receberão primeiro e segundo sinal, e com isso não vão ter, cadeia alfa da IL2.
Os imunossupressores que são usados clinicamente, agem nessa via, os mais usados são a ciclosporina e a rapamicina em pessoas transplantadas, com problemas autoimunes. A ciclosporina é uma droga que inibe a ação da NF-aT, impedindo a expressão de IL2 e CD25. A rapamicina inibe a ação do receptor IL2 que induz a célula a proliferar. Ciclosporina junto com rapamicina inibe a capacidade de expansão clonal e assim não há ativação de linfócitos T. (drogas)
Relembrando para fixar: uma célula reconhece um antígeno e é ativada que é o primeiro passo da proliferação, depois ela diferencia para exercer sua função.
Qual sinal está relacionado a diferenciação? Terceiro sinal! Que são as citocinas. O terceiro sinal é entregue por células apresentadoras de antígenos. Relembrando que o linfócito T virgem fica grudado na célula dendrítica durante os cinco primeiros dias, se essa célula dendrítica estiver produzindo predominantemente TGF-BETA, o linfócito t virgem diferencia em uma célula T Reguladora porque o TGF-BETA induz um fator de transcrição específico que é o FOXP3. TGF-BETA produzido por uma célula dendrítica quando encontra um linfócito T virgem transforma-o em um linfócito T regulador, neste caso, o que provavelmente está acontecendo no tecido é um dano asséptico ou seja alguma coisa que não envolve bactérias, infecção...a célula dendrítica ativada por um dano desse tipo precisa sair do tecido para o órgão linfoide secundário e produzir uma citocina anti-inflamatória para dar instrução para o linfócito T se tornar uma célula reguladora. 
Um exemplo oposto seria uma infecção bacteriana pesada grave, se a célula dendrítica estiver nesse ambiente, ela vai para o órgão linfoide secundário e vai produzir citocinas extremamente inflamatórias IL2 e Interferon-Gama, daí ela instrui o linfócito T virgem a se tornar o linfócito TH1, que é uma célula extremamente inflamatória que é capaz de ativar macrófagos, produzir citocinas bastante inflamatórias. O linfócito TCD8 citotóxico tem por principal função encontrar células e mata-las. Já a principal função do CD4 é produzir citocinas, são células auxiliadoras que quando ativados começam a secretar citocinas que vão modificar resposta imune, auxiliam modificando a resposta como um todo, tanto no caso da inata como na adaptativa. Então se olharmos, por exemplo, a célula dendrítica está inicialmente no ambiente inflamado e então vai para o órgão linfoide secundário produzir IL2 e Interferon e induz a diferenciação de linfócitos T virgens para linfócitos TH1. Depois que o linfócito TH1 termina a sua diferenciação no linfonodo, ele sai do linfonodoe cai na circulação sanguínea. Quando ele passa pelo tecido que está ocorrendo a infecção bacteriana ele encontra o endotélio ativado permeável com selectinas e integrinas, com isso ele rola pelo endotélio, gruda e migra para dentro do tecido, onde está acontecendo a infecção e lá dentro do tecido, ele vai interagir com os macrófagos. Neste caso ele vai ativar o macrófago a se tornarem M1, através do seu Interferon gama. Ou seja ela vai auxiliar a todos os macrófagos do local a se tornarem M1 e com isso eles vão conseguir controlar a infecção.
 Vamos dar mais um exemplo para mentalizar: uma infecção no dedo mínimo do pé, por um corte. Neste caso temos uma resposta inflamatória, neste caso a resposta não vai ser capaz de controlar a infecção, a exemplo, o tétano. Essa infecção vai ocasionar uma resposta inflamatória local exacerbada com produção exacerbada de IL1, TNF... Essa célula dendrítica vai coletar essas informações e se tornar uma célula dendrítica extremamente ativada produtora de citocinas inflamatórias e vai sair do dedo mínimo e migrar até o primeiro órgão linfoide secundário que ela encontrar, que pode ser hipoteticamente (exemplificado no slide o linfonodo poplíteo, localizado atrás do joelho), se ali ela encontrar um linfócito T que é capaz de reconhecer aquele antígeno, ela vai interagir com ele, grudada durante 5 dias. Se ela não encontrar esse linfócito T nesse órgão linfoide secundário, ela vai para o próximo, que seguindo a linha seria o linfonodo inguinal. 
Com isso o linfócito T vai receber o primeiro, segundo sinal da célula dendrítica. O primeiro sinal é o MHC de classe 2, apresentando o peptídeo da bactéria que infectou o dedo, o segundo sinal vai ser o co-estímulo que vai dizer claramente para o linfócito T que está acontecendo uma inflamação em um determinado local. Já o segundo sinal vai determinar o tipo de resposta que vai acontecer (de acordo com o tipo de bactéria), as características da bactéria vão dizer se ela deve produzir menos ou muita toxina já que as células dendríticas reconheceram a bactéria através de seus receptores de padrão molecular. Vamos supor que na resultante final da resposta inflamatória que a célula dendrítica está fazendo, ela produza IL2 e Interferon Gama predominantemente, então no órgão linfoide secundário, no momento em que ela estiver grudada com o linfócito T nos 5 dias, ela vai dizer para o linfócito T através das citocinas que ele precisa diferenciar para o tipo 1, linfócito T CD4 tipo 1. Esse linfócito depois de 5 dias vai se separar da célula dendrítica e primeiramente vai proliferar, depois vai diferenciar e virar um linfócito TH1, deixando de ser um linfócito virgem, se ele não é mais um linfócito virgem, ele não consegue mais ficar dentro do órgão linfoide secundário que é um local de armazenamento de linfócitos virgens e de ativação dos mesmos, perdendo as quimiocinas que faziam com que ele ficasse preso ao órgão linfoide secundário. Então ele sai como TH1, caem no sangue, caem na linfa sem saber onde está a infecção, até ele passar pela circulação do dedinho e encontrar um endotélio ativado, rolando, se aderindo, faz a diapedese e cai no tecido. Chegando no tecido, ele vai encontrar macrófagos e outras células infectadas que estejam apresentando MHC de classe 2. Lembrando que esse MHC de classe 2 e o peptídeo precisam ser exatamente iguais ao que a célula dendrítica apresentou para ele no linfonodo porque o receptor dele não muda. Interagindo com essas células ele vai ativá-las por meio do Interferon gama. 
Então a resposta deixa de ser inflamatória inata e passa a ser uma resposta inflamatória adaptativa sob o controle do linfócito TH1. 
O linfócito TH2 faz a mesma coisa porém com helmintos. 
Logo que todas essas células combatem a bactéria, eliminando-a, elas morrem.
Caso esse mecanismo não funcione, significa que o sistema imune não foi capaz de combater e com isso há necessidade de antibióticos. 
CD8 não diferencia em tipos diferentes de células. A célula CD8 recebe o primeiro e segundo sinais, o terceiro sinal não é necessário para diferenciação de CD8, pois elas conseguem se tornar citotóxicas apenas com o primeiro e segundo sinal, após isso produz IL2 e expressa o receptor de IL2, entra em expansão clonal, prolifera, diferencia, e quando termina a diferenciação sai do órgão linfoide secundário e vai a busca das células que precisa matar. Para matar uma célula, não é necessário o segundo sinal, só o primeiro sinal, esse primeiro que é o MHC classe 1 + peptídeo tem que ser idêntico ao que a célula dendrítica apresentou de antígeno inicialmente.
Na diferenciação da célula CD8, é a capacidade que ela tem de produzir os grânulos citotóxicos, as células virgens não são capazes de produzir eles. Quando ela diferencia passa a produzir esses grânulos, ele libera esses grânulos em contato íntimo com a célula alvo. Os grânulos são secretados apenas na superfície das células cd8, apenas no local de contato vai ter grânulos cd8. Os grânulos possuem duas proteínas, a perforina perfura a membrana da célula alvo, fazendo furos, permitindo que o grânulos entrem dentro da célula alvo. Já as granzimas vão induzir a apoptose da célula alvo. Ou seja a célula CD8 mata as células alvo por apoptose. 
Como vimos na resposta inflamatória inata e CD4 ocorrem danos aos tecidos pela ativação dos macrófagos, neutrófilos, granulócitos. Já a resposta CD8 é limpíssima, ela mata célula específica por apoptose. Para a célula CD8 virar uma célula citotóxica, precisa ter resposta inflamatória e a célula dendrítica ativar a célula CD8 pelo primeiro e segundo sinais para resposta inflamatória prévia. Como ocorre no caso da diabetes autoimune, que as células beta pancreáticas somem, sem inflamação.
O terceiro sinal para célula CD8 não é fundamental para ela virar citotóxica, ela diferencia tranquilamente apenas com primeiro e segundo sinais. Porém se ela receber o terceiro sinal, tanto proveniente de célula apresentadora de antígeno, quanto da própria célula CD4, que também pode produzir em alguns casos citocinas que a CD8 utiliza, como por exemplo, Interferon gama e IL2. Essas citocinas vão aumentar o tempo que a CD8 consegue matar células, conseguindo matar por mais tempo. Aumentando sua capacidade citotóxica pelo Interferon gama vindo da CD4 ou célula dendrítica.