Técnicas de biologia molecular e clonagem

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Técnicas de biologia 
molecular e clonagem
Brasília-DF.
elaboração
Joci Neuby Alves Macedo
José Luiz de Souza Lopes 
Júlio Cesar Pissuti Damalo
Produção
Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração
Todos os direitos reservados.
W Educacional Editora e Cursos Ltda.
Av. L2 Sul Quadra 603 Conjunto C
CEP 70200-630
Brasília-DF
Tel.: (61) 3218-8314 – Fax: (61) 3218-8320
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equipe@ceteb.com.br | editora@WEducacional.com.br
SUMÁRIO
aPresenTaÇÃo ..................................................................................................................................... 5
organiZaÇÃo do caderno de esTudos e PesQuisa ................................................................................. 6
inTroduÇÃo ......................................................................................................................................... 8
unidade i
Biologia Molecular: Breve Histórico .................................................................................................. 11
caPíTulo 1
uM pouco de História ............................................................................................................ 13
caPíTulo 2
a descoBerta do dNa coMo traNsMissor da iNforMação gêNica e o surgiMeNto da 
eNgeNHaria geNética ............................................................................................................. 18
unidade ii
MaNipulação do dNa .......................................................................................................................... 21
caPíTulo 3
reação eM cadeia da poliMerase (pcr) .................................................................................... 23
caPíTulo 4
sequeNciaMeNto de dNa ........................................................................................................ 29
caPíTulo 5
eNziMas de restrição e ligases: MoNtaNdo o dNa .................................................................... 34
caPíTulo 6
extração, purificação de dNa e eletroforese ........................................................................ 39
caPíTulo 7
vetores de cloNageM Molecular ........................................................................................... 43
caPíTulo 8
traNsforMação BacteriaNa................................................................................................... 50
caPíTulo 9
cloNageM Molecular ............................................................................................................ 53
caPíTulo 10
BiBlioteca de dNa geNôMico e de cdNa ................................................................................... 60
unidade iii
técNicas de HiBridização ................................................................................................................... 65
caPíTulo 11
soutHerN Blot, NortHerN Blot e westerN Blot ....................................................................... 68
caPíTulo 12
MicroarraNjo de dNa e de proteíNas ..................................................................................... 77
caPíTulo 13
HiBridização de colôNias: triageM de BiBliotecas ................................................................... 79
unidade iV
ideNtificação de parceiros proteicos ................................................................................................. 81
caPíTulo 14
duplo HíBrido eM leveduras .................................................................................................. 84
unidade V
depois da dupla Hélice ....................................................................................................................... 87
caPíTulo 15
BiotecNologia ...................................................................................................................... 91
caPíTulo 16
células-troNco, cloNageM terapêutica 
e terapia gêNica .................................................................................................................... 95
caPíTulo 17
cloNageM reprodutiva – dolly .............................................................................................. 99
caPíTulo 18
iMpressão digital do dNa – MediciNa foreNse ....................................................................... 103
caPíTulo 19
teste de paterNidade .......................................................................................................... 109
caPíTulo 20
orgaNisMos traNsgêNicos ................................................................................................... 112
Para (nÃo) FinaliZar ....................................................................................................................... 117
reFerências ................................................................................................................................... 118
5
APRESENTAÇÃO
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem necessários 
para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica 
e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, 
adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos a 
serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma competente 
e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios 
que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar sua 
caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a como 
instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
6
ORGANIZAÇÃO DO CADERNO 
DE ESTUDOS E PESQUISA
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de forma 
didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões para reflexão, 
entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, 
também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares.
A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos e Pesquisa.
Provocação
Pensamentos inseridos no Caderno, para provocar a reflexão sobre a prática 
da disciplina.
Para refletir
Questões inseridas para estimulá-lo a pensar a respeito do assunto proposto. Registre 
sua visão sem se preocupar com o conteúdo do texto. O importante é verificar 
seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. É fundamental que você 
reflita sobre as questões propostas. Elas são o ponto de partida de nosso trabalho.
Textos para leitura complementar
Novos textos, trechos de textos referenciais, conceitos de dicionários, exemplos e 
sugestões, para lhe apresentar novas visões sobre o tema abordado no texto básico.
abc
Sintetizando e enriquecendo nossas informações
Espaço para você, aluno, fazer uma síntese dos textos e enriquecê-los com sua 
contribuição pessoal.
7
Sugestão de leituras, filmes, sites e pesquisas
Aprofundamento das discussões.
Praticando
Atividades sugeridas, no decorrer das leituras, com o objetivo pedagógico de 
fortalecer o processo de aprendizagem.
Para (não) finalizar
Texto, ao final do Caderno, com a intenção de instigá-lo a prosseguir com a reflexão.
Referências
Bibliografia consultada na elaboração do Caderno.
8
INTRODUÇÃO
Este Caderno de Estudos foi elaborado com o propósito de oferecerconhecimentos sobre as principais 
técnicas da Biologia Molecular e suas aplicações, além de fornecer informações sobre alguns temas 
recentes desta área da Ciência.
Iniciaremos nosso Curso fazendo uma rápida viagem pela história da Biologia Molecular, conhecendo as 
principais descobertas no meio científico que consolidaram esta área da Ciência. Não podemos deixar de 
falar sobre o DNA, a molécula da vida que armazena nossa herança genética. Após um pouco de história, 
vamos abordar as principais técnicas utilizadas em biologia molecular que representam “A tecnologia do 
DNA recombinante”, como, por exemplo, a PCR. O que seria desta área da ciência sem essa ferramenta? 
Vocês verão que, depois dessa técnica, tudo aconteceu mais rápido. Para consolidar nossos conhecimentos, 
vestiremos nossos jalecos e seguiremos todas as etapas de um procedimento de clonagem, produção de 
DNA recombinante. 
Agora já estamos prontos para aprofundar nossos conhecimentos com técnicas específicas para a 
identificação de uma molécula de DNA, RNA e proteína entre milhões de moléculas, assim como procurar 
uma agulha no palheiro. Vamos introduzir os conceitos de uma técnica para identificação de interação 
entre proteínas, e o porquê da busca de parceiros proteicos. Como nós, as moléculas da vida convivem 
interagindo entre si. 
Para finalizar, exploraremos o que veio depois da Dupla hélice, a busca por informação em grande escala, 
não pensamos em um gene, mas, sim, no genoma; uma proteína é pouco para todo conhecimento que já 
armazenamos chegou a era das “ômicas”, e assim pensamos com todas biomoléculas. 
Vamos discutir um pouco sobre temas atuais e alguns polêmicos da Biologia Molecular, por exemplo, 
biotecnologia, clonagem terapêutica e as famosas células-tronco; a clonagem reprodutiva com o caso 
da ovelha Dolly e a terapia gênica. Vamos entender a importância da impressão digital do DNA, sua 
aplicação no teste de paternidade e na medicina forense. E, por fim, os organismos transgênicos tão 
polêmicos e, ao mesmo tempo, tão necessários. 
Bom estudos!
objetivos
 » Introduzir os principais acontecimentos históricos que deram origem a 
biologia molecular.
9
 » Apresentar os grandes cientistas que contribuíram para o desenvolvimento da 
biologia molecular.
 » Conhecer as principais características do DNA como a molécula que armazena as 
informações da vida.
 » Introduzir os fundamentos das principais técnicas da biologia molecular.
 » Contextualizar as aplicações das técnicas.
 » Apresentar os diferentes vetores para clonagem e suas aplicações.
 » Consolidar as informações sobre as técnicas apresentando um roteiro para 
clonagem.
 » Reconhecer as diferenças entre as bibliotecas de DNA genômico e de cDNA.
 » Apresentar e estabelecer diferenças entre as técnicas de hibridização e 
suas aplicações.
 » Introduzir o novo conceito de pesquisa: as “ômicas”.
 » Apresentar a biotecnologia com exemplos que fazem parte do nosso cotidiano, a 
ciência em nossas casas.
 » Introduzir os conceitos de clonagem reprodutiva e terapêutica, e terapia gênica.
 » Discutir temas polêmicos e atuais: clonagem reprodutiva e terapêutica, terapia 
gênica e organismos transgênicos.
 » Compreender a importância da impressão digital do DNA para a medicina forense 
e o teste de paternidade.
UNIDADE Ibiologia molecular: breVe HisTórico
13
CAPíTUlO 1
um pouco de história
O termo Biologia Molecular foi usado, pela primeira vez, por Warren Weaver em 1938, num relatório 
enviado para a Fundação Rockefeller: “Entre os estudos para os quais essa fundação dá suporte, há um 
grupo, em um campo relativamente novo, que pode ser chamado de Biologia Molecular”.
O marco inicial da história da Biologia Molecular moderna foi a descoberta do DNA por Friedrich 
Meischer em 1869, como uma nova substância química presente no núcleo de células de glóbulos 
brancos, que foi inicialmente chamada de nucleína. A partir de então, vários acontecimentos no meio 
científico contribuíram para consolidar essa área da ciência, que, hoje, pode ser definida como uma forma 
de abordagem de um problema em nível molecular, onde a combinação de técnicas e teorias provindas 
da genética microbiana, microbiologia, bioquímica e biofísica auxiliam na busca das respostas. Abaixo, 
apresentaremos algumas das descobertas que contribuíram para a consolidação da Biologia Molecular 
como uma área das ciências biológicas.
 » 1869 – Friedrich Miescher: bioquímico suíço que isolou do núcleo de células de 
glóbulos brancos provenientes de pus um composto de caráter ácido que foi 
denominado de nucleina. Esse composto era constituído por hidrogênio, oxigênio, 
nitrogênio e fósforo. Mais tarde, ele conseguiu isolar o mesmo composto de células 
de esperma de salmão. Este composto era resistente à ação da enzima pepsina, uma 
protease. O próprio Miescher acreditava que as proteínas fossem as moléculas da 
hereditariedade, ele não sabia que estava dando o pontapé inicial para elucidar 
esta questão.
 » 1882 – Walther Flemming: considerado o criador da ciência da citogenética, foi o 
primeiro pesquisador a descrever o comportamento dos cromossomos durante o 
processo da divisão celular. Os termos mitose e cromatina foram primeiramente 
usados por ele. 
 » 1915 – Thomas Hunt Morgan: biólogo norte americano que formulou a teoria 
cromossômica da hereditariedade por meio dos seus trabalhos com a mosca 
Drosophila melanogaster. Ganhou o prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em 1933.
 » 1928 – Frederick Griffith: identificou o princípio transformante e hereditário, 
que, mais tarde, seria chamado de DNA. No clássico experimento realizado com 
Diplococcus pneumoniae, Griffith demonstrou o seguinte.
14
 › Camudongos morreram após receberem uma injeção de uma estirpe virulenta 
de Diplococcus.
 › Camundongos permaneceram vivos após injeção de uma estirpe avirulenta 
de Diplococus. 
 › Camudongos conservaram-se vivos após injeção da estirpe virulenta morta por 
aquecimento. Tudo bem até aqui!
 › Camudongos morreram após injeção de uma mistura composta por estirpe 
virulenta morta por aquecimento juntamente com uma estipe avirulenta viva. 
Griffith isolou do sangue destes camudongos a estirpe virulenta da bactéria viva. 
Como isso pode acontecer, visto que a estirpe virulenta estava morta?
 › Conclusão: alguma coisa foi transferida da bactéria virulenta morta para a 
bactéria avirulenta viva, conferindo-lhe a capacidade de matar os camudongos. 
A essa “coisa”, foi dado o nome de princípio transformante. No entanto, ele não 
conseguiu responder o que seria esse princípio. Por outro lado, Griffith também 
estava descobrindo a transformação bacteriana. 
 › Fiquem atentos, pois este enigma começa a ser elucidado em 1944.
 » 1941 – George Beadle e Edward Lawrie Tatum: foram os primeiros a fazer a relação: 
um gene uma enzima a partir de trabalho com o fungo Neurospora. Eles 
observaram que a mutação em um gene alterava a atividade de uma enzima. Este 
trabalho resultou nas bases da genética bioquímica. Juntos, ganharam o prêmio 
Nobel em Fisiologia e Medicina em 1958.
 » 1944 – Frederick Sanger: Bioquímico inglês, desenvolveu um método de 
sequenciamento de proteínas e determinou a sequência completa de aminoácidos 
da insulina. Em 1958, recebeu o prêmio Nobel em Química graças a este trabalho. 
Sanger aparecerá em nosso histórico mais uma vez ganhando um prêmio, agora em 
trabalhos com o DNA.
 » 1944 – Oswald Avery, Colin McLeod e Maclyn McCarty: apresentaram as primeiras 
evidências de que as informações hereditárias estariam armazenadas no DNA 
e não nas proteínas, como ainda se pensava na época. Dessa forma, responderam 
a pergunta que Griffith não tinha elucidado em 1928: o princípio transformante 
é o DNA. Eles demonstraram que o princípio transformante era degradado pela 
ação de uma desoxirribonucleasepancreática (DNAse), mas não pela atividade de 
ribonuclease pancreática (RNAse) ou de enzimas proteolíticas (proteases). O mundo 
já começava a relacionar o DNA com a hereditariedade, mas, mesmo assim, ainda 
havia os que não acreditavam nesta proposição.
 » 1950 – Rosalind Franklin: biofísica britânica que obteve o primeiro padrão de 
difração de raios-X para o DNA, o qual foi fundamental para a proposição da 
UNIDADE I | Biologia Molecular: Breve Histórico
15
estrutura em dupla hélice para o DNA por Watson e Crick. Muitos dizem que ela 
foi negligenciada por Watson e Crick, que não a mencionaram por este feito em seu 
trabalho sobre a estrutura do DNA, visto que, a imagem por ela obtida do DNA foi 
de fundamental importância para que eles chegassem a estrutura de dupla hélice 
para o DNA. Independentemente do que a história relata, aqui nós daremos a ela a 
importância merecida pelo seu trabalho.
 » 1950 – Erwin Chargaff: bioquímico austríaco, demonstrou uma razão constante 
entre as bases nitrogenadas adenina/timina e citosina/guanina no DNA, 
independentemente do DNA analisado.
 » 1951 – Linnus Pauling: Propôs as estruturas de alfa hélice e folha beta 
para proteínas.
 » 1952 – Alfred Hershey e Martha Chase: provaram que o DNA, e não a proteína, 
é o material genético. Colocaram um ponto final nesta questão no experimento 
conhecido como experimento do liquidificador. Eles adicionaram o isótopo 
radioativo P32 (fósforo) em uma cultura de bacteriófagos (um tipo de vírus que 
infecta bactérias), e em outra cultura adicionaram o isótopo radioativo S35 (enxofre). 
Lembre-se de que o DNA não possui enxofre e que as proteínas não possuem o 
elemento fósforo. Após infecções de E. coli com os bacteriófagos marcados, as 
amostras foram agitadas em um liquidificador para separar os bacteriófagos das 
bactérias. Eles observaram que no precipitado formado pelas bactérias havia apenas 
P32, enquanto no sobrenadante onde se encontrava os bacteriófagos estava presente 
apenas S35. Dessa forma Hershey e Chase constataram que o DNA dos bacteriófagos 
tinha sido transferido para o interior das bactérias.
 » 1953 – James Watson e Francis Crick: determinaram a estrutura tridimensional 
do DNA – Este é o marco principal da biologia molecular. No próximo capítulo, 
discutiremos essa descoberta. Estes pesquisadores receberam o prêmio Nobel em 
Medicina e Fisiologia em 1962.
 » 1957 – Francis Crick: postulou o “dogma central” da biologia molecular: DNA
RNA Proteína. 
 » 1957 – Arthur Kornberg: bioquímico americano que isolou a enzima DNA 
polimerase e foi o primeiro pesquisador a sintetizar DNA in vitro. Foi agraciado 
com o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em 1959. As ferramentas da tecnologia 
do DNA recombinante começam a surgir.
 » 1958 – Matthew Meselson e Franklin Stahl: demonstraram que o DNA se duplica 
de forma semiconservativa, em um experimento considerado um dos mais bonitos 
da biologia molecular. 
 » 1961 – François Jacob e Jacques Monod: biólogos franceses que decifraram os 
mecanismos de regulação gênica em procariotos – o operon. Atualmente, a 
Biologia Molecular: Breve Histórico | UNIDADE I
16
expressão de proteínas heterólogas em bactérias tem como fundamentos os operons. 
Receberam o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em 1965.
 » 1966 – Marshall Nirenberg e Phil Leder: biólogos americanos que juntos decifraram 
o código genético. Nierenberg ganhou o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia 
em 1968, com estudos que culminaram na descoberta de que cada aminoácido é 
codificado por, pelo menos, uma trinca de nucleotídeos.
 » 1966 – Bernard Weiss e Charles Richardson: pesquisadores americanos que 
isolaram a enzima DNA ligase do bacteriofago T4, uma ferramenta essencial para 
a tecnologia do DNA recombinante.
 » 1968 – H.O. Smith, K.W. Wilcox, e T.J. Kelley: isolaram a primeira endonuclease de 
restrição especifíca. Tal fato permitiu o início da consolidação da tecnologia do DNA 
recombinante, pois as endonucleases são uma das principais ferramentas nessa área.
 » 1971 – David Baltimoree e Howard Temin: identificaram uma transcriptase reversa 
viral – enzima capaz de sintetizar DNA a partir de um molde de RNA. A partir de 
então, houve uma reavaliação do dogma central e novas expectativas para a biologia 
molecular: DNA RNA Proteína. Receberam o prêmio Nobel em Medicina e 
Fisiologia em 1975.
 » 1972 – David Jackson, R.H. Symons e P. Berg: Produziram a primeira molécula de 
DNA recombinante. Estaria o homem começando a brincar de “Deus”?
 » 1975 – Edwin Southern – Desenvolveu um método de detecção de sequência 
específica de DNA – Southern blot. Assim começavam a surgir as técnicas da 
biologia molecular.
 » 1976 – Robert Swanson e Herber Boyer – Fundaram a empresa Genentech de 
biotecnologia na Califórnia. A biologia molecular começa a se torna rentável.
 » 1977 – Frederick Sanger e Walter Gilbert: Independentemente desenvolveram 
métodos para determinar a sequência exata do DNA. Olha o Sanger retornando 
ao nosso histórico e, junto com Gilbert e Berg (DNA recombinante), ganhou mais 
um prêmio Nobel, agora em química, em 1980.
 » 1985 – Kary Mullis: inventou a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase – PCR, 
fato pelo qual foi agraciado com prêmio Nobel em química em 1993. Podemos dizer 
que, as pesquisas em engenharia genética e biologia molecular só chegaram ao nível 
de complexidade em que estamos atualmente graças a essa técnica. É difícil imaginar 
a manipulação do DNA sem a PCR.
 » 1986 – Leroy Hood: Desenvolveu o sequenciamento automático. A partir de então 
se podia pensar em projetos genomas.
UNIDADE I | Biologia Molecular: Breve Histórico
17
 » 1988 – NIH (National Institutue of Health) e DOE (Department of Energy): lançam 
nos EUA o consórcio do projeto genoma humano (PGH).
 » 1995 – TIGER (EUA): finalizam o sequenciamento do primeiro genoma 
sequenciado: Haemophilus influenzae.
 » 1996 – Ian Wilmut: criador do primeiro clone de um mamífero adulto: a ovelha 
Dolly. Aqui fica novamente a questão: será que o homem está brincando de “Deus”?
 » 2000 – Consórcio PGH: Publica um rascunho do genoma humano com 30 mil 
genes.
 » 2003 – Consórcio PGH: conclui o sequenciamento do genoma humano.
 » 2003 – Pesquisadores brasileiros concluem o sequenciamento do genoma da 
bactéria Xylella fastidiosa, a causadora da doença do amarelinho em cítricos.
A doença do amarelinho é causada devido a oclusão de vasos do xilema por 
agregados da bactéria Xylella fastidiosa. Isso impede a passagem de água e sais 
minerais até as folhas, causando um estresse hídrico. O sequenciamento do 
genoma da Xylella envolveu 192 pesquisadores em 34 laboratórios distintos. O 
resultado desse sequenciamento foi capa da revista científica Nature, aliás, foi a 
primeira vez que um trabalho desenvolvido nos laboratórios brasileiros foi capa 
dessa prestigiada revista. 
Este histórico ilustra a corrida cientifica na área da Biologia Molecular para elucidar 
os mecanismos moleculares que governam a vida, inclusive vários deles receberam o 
prêmio Nobel por isso. Há 60 anos não se conhecia a estrutura do DNA, na atualidade 
manipulamos está molécula com uma facilidade inimaginável naqueles tempos. 
Muitas perguntas ainda estão sem respostas, mas os conhecimentos acumulados 
pelos biologistas moleculares na atualidade são essenciais para futuras descobertas.
Biologia Molecular: Breve Histórico | UNIDADE I
18
CAPíTUlO 2
a descoberta do dNa como transmissor da 
informação gênica e o surgimento da 
engenharia genética
A história da biologia molecular tem como marco inicial a descoberta do DNA em 1869. Desde então, 
várias perguntas foram a motivação para elucidar a importância desta molécula para o ser vivo e a 
conservação de suas características ao longo de gerações. Essas perguntas só começaram a serrespondidas 
há sete décadas, com o clássico experimento de Oswald Avery, Colin McLeod e Maclyn McCarty, em que 
eles demonstraram que o chamado princípio transformante era o ácido nucleico. E o ponto culminante 
das descobertas, que, enfim, forneceram os conhecimentos necessários para entender como a informação 
genética era armazenada e transmitida, foi a elucidação da estrutura do DNA, há quase 60 anos. 
O evento considerado o mais importante da Biologia do século passado, foi a elucidação da estrutura do 
DNA por Watson e Crick em 1953. A simplicidade das palavras dos autores no início da publicação dos 
dados não mensurava a importância de tal feito: “We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose 
nucleic acid [DNA]. This structure has novel features which are of considerable biological interest” (Nós 
queremos sugerir uma estrutura para o sal de ácido desoxirribonucleico [DNA]. Esta estrutura tem novas 
características que são de considerável interesse biológico). 
É importante ressaltar que outros pesquisadores contribuíram com informações importantes para este 
feito, como Maurice Wilkins e Rosalind Franklin, entre outros. Assim, hoje, sabemos que o DNA (Ácido 
desoxirribonucleico) é a molécula da vida, na qual toda a informação necessária para o desenvolvimento 
de um organismo está armazenada na forma de um código formado por 4 unidades, chamadas de 
desoxinucleotídeos (nucleotídeos). Esses nucleotídeos são simplificadamente abreviados pelas letras A 
(adenina), T(timina), C (citosina) e G (guanina) e são constituídos por um grupo fosfato ligado a uma 
pentose (desoxirribose – açúcar de cinco carbonos) que, por sua vez, se encontra ligada a uma das quatro 
bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e guanina). 
A estrutura do DNA foi, então, demonstrada ser formada por duas cadeias de nucleotídeos que se 
polimerizam por meio de ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos. Essas cadeias se encontram 
pareadas em uma orientação antiparalela e unidas por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas 
complementares (A/T e C/G). Essas duas cadeias formam uma hélice que lembra uma escada em espiral 
onde os degraus são as bases nitrogenadas e o corrimão é formado pelas desoxirriboses e os grupos 
fosfatos (Figura 1). 
Os autores fazem uma importante observação no texto que será mais tarde confirmada: “It has not escaped 
our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggest a possible copying mechanism 
19
for the genetic material (Não nos passou despercebido que o pareamento específico, que nós postulamos 
imediatamente sugere um possível mecanismos de cópia para o material genético). Logo em seguida, 
o mecanismo de replicação semiconservativa do DNA foi descrito por Matthew Meselson e Franklin 
Stahl (1958), mostrando, assim, que a informação contida em uma molécula de DNA era passada para 
novas moléculas. 
Com todos esses eventos, surgiu a Engenharia Genética, que podemos dizer ser toda manipulação do 
DNA que resulte em uma molécula de DNA recombinante, por este motivo é também conhecida por 
tecnologia do DNA recombinante. 
Mas, o que é esse tal de DNA recombinante? O DNA recombinante é o termo utilizado para definir uma 
molécula de DNA que sofreu alguma modificação quando comparada com a molécula de origem, seja uma 
clivagem com endonucleases de restrição, a inserção em um plasmídeo, a substituição ou inserção de um 
ou mais nucleotídeos, entre outras. Desta forma, as técnicas que permitem gerar um DNA recombinante 
constituem a tecnologia do DNA recombinante ou a engenharia genética. 
Figura 1. Estrutura do DNA – (A) Representação das duas cadeias da molécula de DNA interligadas por ligações de hidrogênio 
entre as bases nitrogenadas complementares (A/T e C/G). S corresponde a pentose e P ao grupo fosfato. (B) Estrutura da 
molécula de DNA na forma de uma hélice, como descrita por Watson e Crick. 
Figura modificada do site: <http://www.guianet.com.br/vegetarianismo/era10.html>, retirada em 17/9/2011.
Várias descobertas favoreceram a manipulação do DNA, como, por exemplo, a descoberta de enzimas 
tais como as endonucleases, a DNA polimerase, a T4 DNA ligase; o desenvolvimento de protocolos para 
extração de DNA de vários organismos, a manipulação de bactérias como vetores de propagação de DNA 
recombinante, a descoberta dos plasmídeos bacterianos (moléculas de DNA circular), a invenção das 
técnicas de PCR e de sequenciamento do DNA, entre outras. 
Hoje, a Engenharia Genética é essencial para os estudos na grande área da biologia que em algum momento 
envolvam a molécula de DNA. Por mais simples que sejam as análises, alguma ferramenta da engenharia 
genética será aplicada para auxiliar nas investigações, seja na simples análise do padrão de restrição de 
uma molécula de DNA, seja nas mais complexas formas de clonagem molecular em plasmídeo. Esse 
último, sempre tem início com a busca do gene de interesse dentro do genoma de um determinado 
Biologia Molecular: Breve Histórico | UNIDADE I
20
organismo, a identificação de sua sequência de nucleotídeos até a inserção no plasmídeo, gerando, assim, 
uma molécula de DNA recombinante. 
Leia mais a respeito do assunto em:
<http://www.abfhib.org/FHB/FHB-04/FHB-v04-05-Mariana-Andrade-Ana-Maria-
Caldeira.pdf>
<http://www.biology-nation.com/History_of_Molecular_Biology.html>
UNIDADE I | Biologia Molecular: Breve Histórico
21
UNIDADE IImaniPulaÇÃo do dna
23
CAPíTUlO 3
reação em cadeia da polimerase (pcr)
A reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi inicialmente desenvolvida por 
Saiki e colaboradores em 1985, e, em seguida, foi aprimorada por Kary Mullis, que tentou publicar seus 
experimentos nas duas revistas científicas mais importantes do mundo, a Science e a Nature, as quais 
não reconheceram a importância de tal conquista. Desta forma, Kary Mullis publicou seus dados sobre 
a amplificação do gene da β-globina humana em uma revista de fator de impacto imensamente menor, 
a Methods in Enzymology, e, mais tarde, em 1993, sua criação foi reconhecida e ele foi agraciado com o 
prêmio Nobel em quimíca. Mullis é conhecido como o criador da técnica de PCR, pois ele a idealizou 
da forma que é realizada atualmente, introduzindo o uso de uma enzima termoestável e os conceitos de 
oligonucleotídeos (primers) e, consequentemente, de especificidade do produto amplificado. 
O fator de impacto de uma revista é uma medida que reflete o número médio 
de citações de artigos científicos publicados naquela revista. É empregado 
frequentemente para avaliar a importância de uma dada revista em sua área, sendo 
que aqueles com um maior fator de impacto são considerados mais importantes.
Saiki que descreveu a técnica precursora da PCR a realizava de forma “rústica” e onerosa, adicionando 
a enzima DNA polimerase de Escherichia coli, que possui ótima atividade a 37°C, a cada ciclo da reação. 
Pois a mesma era inativada durante as etapas de elevação de temperatura para 94 °C. 
Com Mullis duas mudanças fundamentais foram adicionadas à técnica tornando a viável do ponto de 
vista científico e econômico.
1. O uso da enzima recém-identificada Taq, uma DNA polimerase termoestável 
isolada da bactéria de fontes termais, Thermus aquaticus, que se mantém estável em 
temperaturas próximas a 117ºC e tem como ótima temperatura 72ºC. 
2. E as pequenas sequências de DNA, conhecidas como oligonucleotídeos, que 
delimitam a região a ser amplificada do DNA-alvo, tornando, assim, o produto 
amplificado específico. 
Logo em seguida, o interesse comercial pela técnica resultou no desenvolvimento dos termocicladores, 
máquinas que variam a temperatura e controlam o tempo, repetindo o ciclo por várias vezes, permitindo, 
assim, automatizar a técnica, eliminando as exaustivas etapas de transferência dos tubos com a reação por 
váriosbanhos-maria de temperaturas diferentes.
24
A técnica de PCR veio para resolver um grande problema nas análises de DNA, a baixa quantidade de 
DNA nas células, pois ela visa a amplificar uma região específica do DNA a partir de uma única molécula, 
de tal forma que, após inúmeros ciclos de amplificação, tenhamos quantidade de DNA suficiente para ser 
detectado e manuseado para diversos fins (Tabela 1).
A PCR é um processo de replicação do DNA in vitro, com uma diferença básica em relação a este processo 
na célula, apenas uma região desejada do DNA é amplificada, diferente do que acontece na célula que a 
replicação é de todo o DNA celular. 
tabela 1 – componentes necessários para a pcr. 
Componentes Função
DNA Alvo a ser amplificado
Temperatura: 94ºC Temperatura para separação das fitas do DNA-alvo
Um par de oligonucleotídeos Delimitar a região a ser amplificada 
Temperatura: 58 – 66ºC
Temperatura para o pareamento dos oligonucleotídeos no 
DNA-alvo
Nucleotídeos* (C, G, A e T), Taq e temperatura: 72ºC Polimerização da nova fita de DNA
*Na PCR utilizamos a nomenclatura dNTPs para a mistura dos quatros nucleotídeos.
Os oligonucleotídeos são pequenos fragmentos de DNA de aproximadamente 17 a 35 pares de bases que 
são complementares as regiões que delimitam a sequência de DNA de interesse. Cada nucleotídeo pareia 
com uma das fitas do DNA. Estes podem conter além da sequência complementar ao DNA-alvo, pequenas 
sequências de DNA que caracterizam sítios de reconhecimento para enzimas (como endonucleases). 
Estas sequências serão incorporadas nas novas moléculas de DNA amplificadas (Figura 2). 
Figura 2. Exemplos de oligonucleotídeos. (A), Sequência de DNA-alvo. (B) e (C) Oligonucleotídeos (em negrito) pareados na 
sequência-alvo. (C) Oligonucleotídeos contendo sequência adicional (letras minúsculas). 
A PCR ocorre em três etapas de forma automatizada em um equipamento chamado de termociclador.
1. Desnaturação: corresponde a separação da dupla fita de DNA por elevação da 
temperatura para 94ºC durante 2 a 5 minutos.
2. Anelamento: com as fitas de DNA separadas a temperatura é reduzida para 
valores entre 58 e 66ºC, favorecendo o pareamento dos dois oligonucleotídeos nas 
fitas complementares do DNA, desta forma delimitando a região do DNA a ser 
amplificada.
UNIDADE II | Manipulação do dna
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3. Extensão: a 72 ºC a enzima Taq posiciona-se próximo aos oligonucleotídeos e 
recruta os nucleotídeos para a síntese da nova fita de DNA.
Finalizado o ciclo da reação composto por essas três etapas, o ciclo é repetido por aproximadamente 35 
vezes até que se obtenha o DNA amplificado em quantidades suficientes para as análises (Figura 3). A 
quantidade de DNA amplificada segue uma função exponencial, onde: 
N= N0 x 2n
N = quantidade final de DNA amplificado
N0 = quantidade inicial de DNA molde
n = números de ciclos da reação
Desta forma, para uma molécula de DNA-alvo teremos no final de 35 ciclos 235 moléculas. 
Figura 3. Reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação ilustrada inicia com uma molécula de DNA que no final de dois 
ciclos originam 4 moléculas de DNA idênticas a molécula molde. 
Figura modificada do site: <http://acccn.net/Bio/book/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/lec24.html>, retirada em 17/9/2011.
Uma variável da técnica de PCR é a RT-PCR, que é composta por duas partes: 
a primeira corresponde a reação da transcrição reversa, e a segunda a PCR. A 
diferença básica entre a PCR e a RT-PCR é que na última se sintetiza moléculas de 
DNA a partir de moléculas de RNA mensageiro (mRNA) como molde, diferente 
do PCR que o molde é DNA. Desta forma, podemos obter apenas a região 
codificadora de um gene eucarioto. Ou seja, a sequência que tem a informação 
final para a codificação de uma proteína.
Manipulação do dna | UNIDADE II
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Recordando: 
1. O gene eucarioto é formado por sequências de DNA codificantes chamadas de éxons 
e por sequências não codificantes chamadas de íntrons. No processo de transcrição 
do gene, teremos um mRNA chamado de transcrito primário. Esse transcrito 
passará por algumas etapas de processamento, sendo uma delas a retirada dos 
íntrons originando o mRNA maduro, o qual será responsável pela codificação de 
uma proteína no processo de tradução (Figura 4). A partir do mRNA maduro que 
ocorre a síntese de molécula de DNA na RT-PCR.
2. A descoberta da enzima transcriptase reversa resultou na reavaliação do “dogma 
central”, o qual postulava que o fluxo da informação genética era unidirecional: 
DNA RNA Proteína. Após tal descoberta, observou-se que DNA RNA 
Proteína.
Figura 4. Transcrição do gene eucarioto e o processamento do mRNA. 
Na primeira etapa da RT-PCR, moléculas de mRNA são moldes para a síntese de uma fita de DNA 
complementar à sua sequência, chamada de cDNA. Nesta etapa, utiliza-se apenas um oligonucleotídeo 
que geralmente não é tão específico quanto no PCR, pois este é formado por uma sequência de Timinas 
(oligo-dT) que irá anelar na cauda poli-A presente nos mRNAs. A polimerização da cadeia de cDNA é 
realizada pela adição dos nucleotídeos (dNTPs) complementares a fita de mRNA pela enzima transcriptase 
reversa. Após a síntese do cDNA, o mRNA molde é degradado pela ação da enzima RNAse-H e o DNA 
fita simples fica disponível para iniciar a PCR (Figura 5).
UNIDADE II | Manipulação do dna
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Figura 5. Primeira etapa da RT-PCR. Síntese da fita de cDNA apartir de mRNA como molde pela ação da enzima transcriptase 
reversa. Após esta etapa o cDNA está disponível para iniciar a PCR.
A segunda etapa da reação é uma PCR, onde dois oligonucleotídeos específicos para o gene determinarão 
a região a ser amplificada. No primeiro ciclo da reação, temos apenas DNA fita simples, logo, apenas um 
dos nucleotídeos terá sua fita complementar para parear. No final deste ciclo, teremos como produto 
DNA fita dupla. Nos próximos ciclos, a reação ocorre seguindo uma progressão exponencial, como já 
descrita anteriormente.
Mas o porquê de se obter DNA a partir de RNA? 
Como já mencionado acima, primeiramente porque esta é a forma que temos de obter apenas a sequência 
codificadora de um gene eucarioto. Mas você poderia perguntar: e daí? 
Em primeiro lugar, este é um dos pontos mais importante para o uso desta técnica, pois grande parte 
dos estudos em Biologia Molecular é realizado em bactérias, expressando-se e purificando proteínas 
de eucariotos neste organismo. Bactérias, diferente de eucariotos, não possuem íntrons em seu DNA, e 
desta forma, não possuem a maquinaria necessária para, após a transcrição, retirar os íntrons do mRNA 
(Figura 4). Por isso a RT-PCR veio para resolver este problema, pois agora conseguimos obter apenas a 
sequência codificante dos genes eucariotos para, então, expressá-los em bactérias. 
Mas você ainda poderia questionar: não se pode expressar genes em organismos eucariotos? Sim, 
mas muitos genes eucariotos são muito grandes para serem manipulados de forma a gerarem DNA 
recombinante para este fim.
Em segundo lugar, os cDNAs nos permitem avaliar o padrão de expressão dos genes, de um organismo ou 
de partes deste organismo, em diferentes condições ambientais ou de estresses, por exemplo. 
A técnica de PCR continua tendo como uso principal o processo de amplificação de sequências específicas 
de DNA, mas, atualmente, várias novas aplicações são dadas a esta técnica, tais como: sequenciamento 
de DNA, análise de polimorfismo, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, é aplicada nos testes de 
paternidade e na medicina forense, como também na criação de organismos transgênicos.
Manipulação do dna | UNIDADE II
28
.
Se a PCR é um processo de replicação do DNA in vitro, então:
1. Na célula, quem é responsável pela função da elevação da temperatura 
para 94ºC?
2. Quem é o análogo dos oligonucleotídeos na célulae qual a diferença 
básica entre eles?
3. Compare as etapas da PCR e a replicação do DNA na célula, e você 
entenderá o quanto foi merecido o prêmio Nobel que Mullis recebeu.
Conheça animações para o melhor entendimento da PCR:
<http://www.youtube.com/watch?v=HMC7c2T8fVk&feature=related>
<http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html>
<http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ>
<http://www.youtube.com/watch?v=rd1-QpJNTF8&feature=related>
<http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072552980/student_view0/chapter10/
animation_ quiz_2.html>
UNIDADE II | Manipulação do dna
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CAPíTUlO 4
sequenciamento de dNa
A primeira pergunta que deve ser respondida neste capítulo é: o que é o sequenciamento de DNA? 
É uma técnica que tem por finalidade determinar com fidelidade a sequência dos nucleotídeos que 
compõem um determinado DNA, independentemente de sua origem e, desta forma, dando as moléculas 
de DNA uma marca digital, ou seja, um registro que pertence só a ela.
Trabalhando independentes, Frederick Sanger e Walter Gilbert desenvolveram as primeiras técnicas de 
sequenciamento do DNA. O primeiro método de sequenciamento de DNA foi desenvolvido em meados 
da década de 1970 e é conhecido como sequenciamento químico ou Maxan-Gilbert. O segundo, e mais 
utilizado, é o sequenciamento enzimático também conhecido como método de Sanger, método dideoxi 
ou método de terminalização. Sanger utilizou sua técnica para sequenciar o genoma do bacteriófago ϕ X174 
(5.375 nucleotídeos), podendo ser considerada a primeira descrição do genoma completo de um organismo. Já 
Gilbert sequenciou um operon de um genoma bacteriano. Junto com Paul Berg, Gilbert e Sanger dividiram o 
prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina, em 1980.
A metodologia do sequenciamento de DNA, nos dias atuais, tem como fundamentos o método de Sanger, 
com várias modificações que permitiram automatizar a técnica. 
Para explanarmos o sequenciamento automático do DNA baseado no método de Sanger, é necessário 
relembrarmos alguns conceitos importantes referente ao DNA. Na síntese do DNA, temos como 
precursores os desoxinucleotídeos ou nucleotídeos (dNTP) que possuem a seguinte estrutura (Figura 6).
Figura 6. Esquema ilustrativo da estrutura de um desoxinucleotídeo ou nucleotídeo (dNTP). P corresponde ao grupo fosfato; 
BN, base nitrogenada que pode ser adenina ou timina ou guanina ou citosina. E no centro a pentose na qual os cabornos 
estão numerados de 1’ a 5’. 
Estes nucleotídeos polimerizam por meio de ligação fosfodiéster entre uma hidroxila na posição 3’ de 
um nucleotideo e o grupo fosfato na posição 5’ do nucleotídeo a ser adicionado. A nova fita de DNA é 
estendida a partir da hidroxila 3’ (Figura 7).
30
Figura 7. Esquema ilustrativo da polimerização da cadeia de DNA. A seta indica ligação fosfodiéster 
entre a OH 3’ e o grupo fosfato 5’. 
No método de sequenciamento automático de DNA, utiliza-se desoxinucleotídeos (dNTP) e análogos, 
chamados de didesoxinucleotídeos (ddNTP), que diferenciam dos dNTPs pela ausência da hidroxila na 
posição 3’ (Figura 8). O que carreta essa alteração veremos a seguir.
Figura 8. Esquema ilustrativo da estrutura de um didesoxinucleotídeo (ddNTP). P, corresponde ao grupo fosfato; BN, base 
nitrogenada que pode ser adenina, timina, guanina ou citosina. E no centro, a pentose na qual os carbonos estão numerados 
de 1’ a 5’. A seta indica a ausência da hidroxila no carbono 3’.
Neste método de sequenciamento de DNA, realiza-se uma reação de PCR onde são adicionados os 
componentes básicos da PCR (enzima, DNA molde, os quatros dNTPs e apenas um oligonucleotídeo). 
Além, dos dNTPs são adicionados em quantidades menores (1%) os quatros ddNTPs. Estes ddNTPs 
encontram-se marcados com sondas fluorescentes distintas, que permitem distingui-los um dos outros 
quando são excitados com laser. Durante a reação de PCR, de forma aleatória, um ddNTP é inserido 
na cadeia no lugar do respectivo dNTP e a polimerização da cadeia é finalizada, parando assim a 
reação (Figura 9).
UNIDADE II | Manipulação do dna
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Figura 9. Esquema ilustrativo da interrupção da polimerização da cadeia nucleotídica devido a adição de um ddNTP. A seta 
indica a ausência da hidroxila na posição 3’, sendo assim impedindo a formação de uma ligação fosfodiéster 
com o próximo dNTP.
Logo, é fácil imaginar que se temos quantidades iguais dos ddNTPs competindo com os dNTPs para 
serem inseridos durante a polimerização da cadeia, o resultado da amplificação após os ciclos da reação, 
será uma mistura de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos e que foram finalizados pela adição de 
um ddNTP. Ou seja, os fragmentos diferenciam-se por um nucleotídeo até atingir o tamanho total do 
fragmento de DNA molde (Figura 10).
Figura 10. Fragmentos de DNA produzidos após a adição de ddNTPs na PCR. As letras minúsculas e em negrito 
correspondem ao oligonucleotídeo utlizado na PCR. As letras maiores e em negrito no final de cada fragmento correspondem 
ao ddNTP introduzido interrompendo assim a polimerização.
Manipulação do dna | UNIDADE II
32
Concluída a PCR, a próxima etapa é a separação dos fragmentos de DNA amplificados por tamanho 
em eletroforese em gel de poliacrilamida em placa (sequenciadores mais antigos) ou em microcapilares 
(sequenciadores modernos). À medida que os fragmentos de DNA migram pelo gel eles são separados 
por ordem de tamanho crescente, estes a medida que se aproximam da extremidade do gel a sonda 
fluorescente presente na extremidade do fragmento é excitada por um feixe de laser e, então, emite uma 
fluorescência específica que o caracteriza. Esta fluorescência será capturada por um sistema de detecção 
que converte esse sinal em um gráfico chamado de eletreferograma (Figura 11). 
Um eletreferograma é composto por uma sequência de picos de quatro cores diferentes e cada cor 
corresponde a um dos quatros ddNTPs que foram adicionados durante a polimerização da molécula 
de DNA. 
Figura 11. Etapas do sequenciamento automático do DNA, baseado no método de Sanger. 
Figura modificada do site: <http://www.papociencia.ufsc.br/bio5.htm>, retirada em 17/9/2011.
O maior progresso na técnica de sequenciamento automático é a utilização do laser e o uso de 
programas de computadores específicos para converter o sinal da fluorescência para uma linguagem por 
nós compreendida.
UNIDADE II | Manipulação do dna
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O desenvolvimento do sequenciamento automatizado do DNA foi essencial para o surgimento da era 
dos genomas, na qual vários projetos de sequenciamento de genoma de organismos diferentes foram 
desenvolvidos, entre eles o humano. Antes do sequenciamento ser automatizado, o sequenciamento 
de DNA manual era utilizado apenas em pequena escala e era inimaginável decifrar um genoma tão 
complexo quanto o humano. Novos aperfeiçoamentos foram adicionados à técnica de sequenciamento 
automático, como o Shotgun e o pirosequenciamento, tornando-a mais eficaz e rápida
O sequenciamento do DNA e os projetos genomas foram os responsáveis pelo crescimento de uma nova 
área da ciência biológica, a bioinformática. A partir de então, surgiram os bancos de dados de sequências, 
várias ferramentas para análises de sequências foram desenvolvidas e toda essa tecnologia se encontra 
disponível para qualquer pessoa em sites na web. 
Veja animação sobre o sequenciamento de DNA:
<http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html>
<http://www.youtube.com/watch?v=ezAefHhvecM&feature=related>
Pesquise as diferenças entre o método de Sanger e o método automático de 
sequenciamento de DNA.
Manipulação do dna | UNIDADE II
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CAPíTUlO 5
enzimas de restrição e ligases: montando o dNa
enzimas de restrição – as endonucleases
Um processo de defesa das bactérias contra infecções virais é chamado de restrição/modificação. Neste 
processo, os vírus bacterianos(bacteriófagos), ao invadirem a bactéria, têm seu DNA reconhecido por 
nucleases (enzimas) bacterianas e estas clivam o DNA viral de maneira específica, interrompendo o 
ciclo de replicação viral, que causaria a lise ou destruição da bactéria. Mas, por que o DNA da bactéria 
não é também picotado? Simples, para cada enzima de restrição as bactérias produzem uma enzima 
modificadora, que protege seu DNA da ação das nucleases, marcando-o para diferenciá-lo do DNA do 
vírus, geralmente por metilação. A enzima modificadora adiciona um grupo metil em uma ou duas bases, 
geralmente dentro do sítio de reconhecimento da enzima de restrição. Desta forma a molécula de DNA 
“camuflada” não é reconhecida pelas nucleases (Figura 12). Este processo ocorre em diferentes espécies e 
linhagens de bactérias. 
Figura 12 – Nucleases clivando DNA viral em um processo de proteção da célula bacteriana contra a infecção viral. 
Figura modificada do site: <http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture2/Lecture2.html>, retirada em 17/9/2011.
Essas nucleases são conhecidas como enzimas de restrição ou endonucleases (endo = dentro, nuclease = 
quebra) de restrição, são proteínas que reconhecem uma sequência específica dentro da dupla hélice do 
DNA e clivam em um ponto específico. As enzimas de restrição são classificadas em três tipos, I, II e III:
 » Tipo I – reconhecem uma sequência específica assimétrica e bipartida e clivam o 
DNA a mais de 1000 pares de bases depois.
 » Tipo II – São as mais importantes para a engenharia genética e possuem algumas 
características interessantes.
35
1. Não precisam de ATP para realizar sua função.
2. Reconhecem uma sequência simétrica e específica de 4 ou 6 ou 
8 nucleotídeos, ou seja, palíndroma, que é lida simetricamente. 
Em ambas as direções, lê-se a mesma coisa. Exemplo de palíndromo: OVO, ANA, 
ARARA, RADAR, e REVIVER.
3. Clivam dentro do sítio de reconhecimento.
4. Clivam a ligação fosfodiéster.
 » Tipo III – reconhecem uma sequência assimétrica de 5 a 7 nucleotídeos e clivam 
aproximadamente 24 a 26 pares de bases depois.
Após reconhecer a sequência específica, as enzimas do tipo II fazem dois cortes na molécula de DNA, um 
em cada fita. 
Existem dois tipos de cortes (Figura 13).
 » Os dois cortes são feitos no eixo de simetria da sequência específica, gerando 
extremidades chamadas de abruptas.
 » Os dois cortes são feitos assimetricamente, mas no mesmo local nas duas fitas do 
DNA, resultando em extremidades coesivas.
Figura 13. Tipos de extremidades produzidas no DNA pela ação de endonucleases do tipo II. (A) Extremidades coesivas 
geradas pela ação da endonuclease EcoRI. (B) Extremidades abruptas produzidas após clivagem com a endonuclease EcoRV. 
Em negrito sequência de reconhecimento das endonucleases. 
Atualmente, já foram isoladas mais de 1000 enzimas de restrição de diferentes bactérias (Tabela 2). 
Padronizou-se uma nomenclatura para as enzimas baseada na abreviação do nome do micro-organismo 
do qual a enzima foi identificada e isolada.
Primeira Letra maiúscula = gênero.
Segunda e terceira letras = espécie.
Letra adicional = cepa da bactéria.
Número em algarismo romano = número da enzima descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada:
Manipulação do dna | UNIDADE II
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Por exemplo: HindIII é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III
EcoRI é isolada de Escherichia coli, linhagem RY13 e foi a primeira enzima de restrição identificada nesta 
espécie.
EcoRV é isolada de Escherichia coli, linhagem RY13 e foi a quinta enzima de restrição identificada 
nesta espécie.
tabela 2 – enzimas de restrição comumente utilizadas na engenharia genética.
Visto que o DNA é formado por 4 nucleotídeos (A, T, G e C) e assumindo que estes nucleotídeos são 
distribuídos ao acaso dentro da sequência, a frequência de reconhecimento de uma enzima de restrição 
é 4n, onde n é igual ao número de nucleotídeos que a enzima reconhece, desta forma, enzimas que 
reconhecem:
4 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 44= 256 nucleotídeos;
6 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 46= 4096 nucleotídeos;
8 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 48= 65536 nucleotídeos.
Porém, esses valores podem sofrer variações significativas, dependendo, principalmente, da composição 
de bases do DNA analisado.
Uma importante consequência da ação dessas enzimas é que quando uma determinada molécula de 
DNA é clivada com uma endonuclease, ela vai clivar sempre nos mesmos pontos, gerando, assim, sempre 
o mesmo conjunto de fragmentos de DNA, ou seja, terá um padrão de restrição específico permitindo, 
desta forma, o isolamento de fragmentos de DNA de interesse. Os sítios das enzimas de restrição são 
distribuídos de forma randômica dentro da molécula, implicando a geração de fragmentos de DNA de 
vários tamanhos após a sua ação.
UNIDADE II | Manipulação do dna
37
Outra consequência de fundamental importância, é o fato de após a clivagem do DNA, este passa a ter 
extremidades de fita simples (coesivas) que permitem a ligação de outra molécula de DNA que possua 
extremidade de fita simples e complementar. Ou seja, se tivermos dois fragmentos de DNA produzidos 
pela ação da mesma enzima de restrição, estes fragmentos podem ser unidos gerando uma molécula de 
DNA recombinante. Essas duas características, junto com a facilidade de se obter essas enzimas, fazem 
com que as enzimas de restrição sejam um dos pilares do desenvolvimento da engenharia genética. Esta 
é uma das ferramentas que permitiu manipular o DNA com extrema precisão.
Além da construção de moléculas de DNA recombinantes, essas enzimas são utilizadas nos testes 
de paternidade, na medicina forense, na construção de bibliotecas genômicas como as usadas nos 
projetos genomas. 
Poderiamos estudar alterações na sequência do DNA por análise do padrão de 
restrição do mesmo?
Conheça melhor as enzimas de restrição:
<http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html>
ligases
E agora que já mencionamos no capítulo anterior que podemos ligar dois fragmentos de DNA gerando 
um DNA recombinante, estudaremos como isso acontece no laboratório.
Lembre-se, primeiro, qual a molécula na célula responsável pela ligação de fragmentos de DNA durante 
o processo de replicação. Como já foi visto durante o processo de replicação do DNA, uma das fitas é 
sintetizada de forma contínua e a outra descontínua. Nesta última, são sintetizados fragmentos de DNA, 
chamados de fragmentos de Okazaki, que serão ligados pela ação da enzima DNA ligase.
Da mesma forma que ocorre na célula, nós realizamos a ligação de moléculas de DNA no laboratório, 
utilizando a enzima DNA ligase, só que, neste caso, a enzima é codificada pelo bacteriófago T4 e é conhecida 
como T4 DNA ligase. Essa enzima catalisa a ligação fosfodiéster entre a hidroxila 3’ de um nucleotídeo e 
o grupo fosfato do próximo nucleotídeo. Ela pode ligar fragmentos de DNA com extremidades coesivas 
ou abruptas, porém extremidades abruptas são ligadas com baixa eficiência. 
Os requisitos necessários para a ação da T4 DNA ligase são (Figura 14) os seguintes.
 » Hidroxila livre na extremidade 3’ de um dos fragmentos do DNA.
 » Grupo fosfato livre na extremidade 5’ do outro fragmento de DNA.
 » Temperatura baixa (16ºC a 22°C) para favorecer o encontro das moléculas de DNA 
e o pareamento das bases nitrogenadas complementares.
Manipulação do dna | UNIDADE II
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Figura 14. Reação de ligação promovida pela T4 DNA ligase. Em negrito, os nucleotídeos que foram unidos por ligação 
fosfodiéster promovida pela ligase.
.
Estamos, agora, montando um quebra-cabeças, pois moléculas de DNA 
com extremidades coesivas só podem ser unidas se as extremidades forem 
complementares. Porém, moléculas com extremidades abruptas não são tão 
seletivas para se unirem, basta a hidroxila 3’e o grupo fosfato 5’ e tudo pode 
acontecer. Pensando em construir uma molécula de DNA recombinante, qual é 
a melhor opção, extremidades coesivas ou abruptas? E por quê? Pensem nesta 
questão como se estivessem montando um LEGO®.
Amplie seus conhecimentos. Veja enzimas de restrição e DNA ligase trabalhando 
juntos em:
<http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0&feature=related>
UNIDADE II | Manipulação do dna
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CAPíTUlO 6
extração, purificação de dNa e eletroforese
extração, purificação de dna
Até o momento, já aprendemos que podemos:
 » amplificar um fragmento de DNA por meio da técnica de PCR;
 » clivar o DNA em regiões específicas;
 » unir fragmentos de DNA.
Mas falta-nos saber como obter a amostra de DNA para iniciarmos qualquer estudo. Sendo esta molécula 
alvo de análises em exames de paternidade, em projetos genomas, em medicina forense, em estudos 
evolutivos, na engenharia genética. E, lembrando que há diferentes fontes do mesmo, desde pequenos 
micro-organismos, até os diversos tecidos e secreções de organismos superiores, além de fosséis, seria 
difícil a existência de apenas um protocolo para a extração do DNA. Independentemente da fonte, alguns 
princípios são válidos para todos os procedimentos de purificação, mas não podemos deixar de mencionar 
que algumas particularidades são adicionadas ao procedimento dependendo da fonte do DNA. Abaixo 
estão descritas as etapas básicas da extração de DNA.
1. Primeiro, o DNA tem de ser liberado de dentro da célula para ser purificado, desta 
forma, a primeira etapa é a lise das membranas plasmáticas e nucleares. Para este 
fim, utilizam-se agentes, como detergentes, que rompam interações hidrofóbicas 
e destruam a bicamada lipídica. Para organismos que possuem parede celular, é 
necessário o uso de enzimas associados a processos mecânicos para destruí-la.
2. Degradação das proteínas inclusive nucleases que possam degradar o DNA. 
Geralmente utiliza-se proteinases (enzimas que degradam proteínas), ou até mesmo 
alteração do pH deixando-o muito alcalino para assim inativar as enzimas.
3. Isolamento do DNA, essa etapa pode ser realizada de diversas formas, desde a 
mais antiga e eficiente, que consiste na precipitação do DNA na presença de sal e 
álcool (etanol ou isopropanol), até com o uso dos diversos kits de purificação que 
se encontram no mercado. Esses kits têm como princípio o uso de uma resina, que, 
por afinidade, liga-se ao DNA e este é liberado pela passagem de uma solução (por 
exemplo, água) a qual o DNA é mais afim.
40
Figura 15. Etapas da purificação de DNA. 1 – rompimento das células com liberação do material celular. 2 – precipitação de 
proteínas e outros componentes celulares; 3 e 4, precipitação do DNA após adição de sal e álcool. 
Estas etapas também são realizadas nos procedimentos de purificação de RNA, mas com alguns cuidados 
adicionais, pois a molécula de RNA é muito instável e de fácil degradação.
DNA, sal e álcool = precipitação do DNA. Por quê?
eletroforese 
Já extraímos e manipulamos o DNA. Agora chegou a hora de apresentarmos a vocês a técnica que nos 
permite monitorar a qualidade do DNA extraído, como confirmamos que a amplificação do DNA foi 
eficiente, ou, então, que a ação das enzimas de restrição resultou no padrão de restrição esperado.
A eletroforese do DNA em gel é a técnica mais utilizada dentro de um laboratório de Biologia Molecular, 
pois com ela se monitora todas as etapas do processo de clonagem molecular. A técnica tem como base 
o fato de as moléculas de DNA serem carregadas negativamente devido aos grupos fosfatos presentes ao 
longo da cadeia. 
Recordando: um corpo com carga (negativa ou positiva), quando submetido a uma diferença de potencial, 
por exemplo, os polos de uma bateria conectados à solução contendo este corpo, irá migrar no sentido do 
polo com carga contrária a sua. Desta forma, um corpo com carga negativa migrará para o polo positivo 
e um corpo com carga positiva, para o polo negativo. Então, quando submetemos moléculas de DNA a 
uma diferença de potencial elétrico, elas irão migrar para o polo positivo do campo elétrico.
A essa migração de moléculas quando submetidas a uma diferença de potencial chamamos de eletroforese.
Vários são os problemas que não tornam viável a realização de eletroforese em solução, como a migração 
das moléculas dispersadamente durante o processo, perturbações mecânicas e movimentos do líquido 
durante o processo. Para contornar esses problemas, na atualidade as eletroforeses são realizadas em 
sistemas que utilizam um suporte que, geralmente, é formado por uma matriz rígida de papel ou gel que 
permite a migração da molécula.
Na eletroforese do DNA, utiliza-se como suporte um gel de agarose e, em algumas análises mais específicas, 
gel de poliacrialmida. A escolha da matriz de agarose ou de poliacrilamida depende do tamanho dos 
fragmentos de DNA a serem analisados. Géis de agarose formam poros maiores que o de poliacrilamida. 
Desta forma, ele é ideal para fragmentos que variam de 200 pares de bases (pb) a 50.000 pb (50 Kpb). Já o 
gel de poliacrilamida tem ótima resolução para fragmentos de até 1.000 pb. A desvantagem em utilizar a 
UNIDADE II | Manipulação do dna
41
acrilamida como rotina para eletroforese de DNA é o seu caráter neurotóxico quando em solução, e por 
ser mais laborioso o preparo do gel.
A agarose é um polissacarídeo que forma uma malha cuja porosidade é dependente da sua concentração. 
O tamanho dos poros desta matriz é inversamente proporcional à concentração de agarose e diretamente 
proporcional ao tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja separar (Tabela 3).
tabela 3 – concentração de agarose em eletroforese de dNa
ConCentração De agarose (% p/V)
tamanhos De Fragmentos separaDos Com 
Boa resolução (pares De Bases)
1 500 – 10.000
1,2 400 – 6.000
1,5 200 – 3.000
2,0 100 - 200
Tabela adaptada de Sambrook, 2001.
Após o preparo do gel, as amostras de DNAs são aplicadas em pequenos poços presentes em uma das 
extremidades do gel, onde será aplicada a carga negativa. Na extremidade oposta, temos o polo positivo. 
Assim, o DNA irá migrar na direção do polo positivo. A malha de agarose funciona como uma barreira 
para as moléculas de DNA, de forma que as moléculas menores migram mais rapidamente pelo gel e as 
maiores são parcialmente retidas e migram mais lentamente. Logo neste procedimento o DNA é separado 
por seu tamanho em pares de bases. 
Alguns fatores influenciam na mobilidade das moléculas de DNA durante a eletroforese.
1. Intensidade da voltagem aplicada: quanto maior for a intensidade maior será a 
velocidade com que as cargas se dirigem para o polo com carga oposta a sua.
2. Quanto maior for a carga total da molécula maior será a atração eletrostática da 
molécula pelo polo de carga oposta, dessa forma mais rápida será sua migração.
3. Por outro lado, quanto maior for a molécula mais lenta será sua migração devido a 
barreira que será imposta pela malha do gel.
Para finalizar, é necessário visualizar o DNA. Para este fim o gel é corado com uma solução de brometo de 
etídio que se intercala entre as bases nitrogenadas do DNA. Em seguida, o gel é exposto a luz ultravioleta e o 
brometo de etídio emite fluorescência. Neste procedimento, utiliza-se uma amostra de DNA composta por 
fragmentos de tamanho conhecido como padrão para comparação com as amostras em análises (Figura 16).
Manipulação do dna | UNIDADE II
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Figura 16. Eletroforese de DNA em gel de agarose. (A) Estrutura do polímero de agarose e da molécula de brometo de etídio 
intercalada na no DNA. Cargas negativas do DNA e malha do gel de agarose. (B) Foto de um gel de eletroforese de DNA após 
excitação do brometo de etídio com luz ultravioleta. 
Figura modificada do site: <http://2008.igem.org/Team:Heidelberg/Human_Practice/ Phips_the_Phage/Technical_Backround>,retirada em 17/9/2011.
Assista ao vídeo que expõe todo o procedimento de eletroforese no laboratório. 
Acesse:
<http://www.youtube.com/watch?v=6mQGNDnOyH8&feature=related>
UNIDADE II | Manipulação do dna
43
CAPíTUlO 7
vetores de clonagem molecular
O objetivo inicial da tecnologia do DNA recombinante é gerar um grande número de uma molécula de 
DNA recombinante. Mas para isso não é suficiente apenas ligar duas moléculas, ou alterar a sequência 
de uma molécula de DNA. Para que se possa alcançar este objetivo, é necessário propagar este DNA em 
células hospedeiras. Mas como fazer isso? Inicialmente, precisamos inserir o DNA de interesse em um 
vetor de clonagem, que nada mais é do que moléculas de DNA que funcionam como um veículo que 
transporta um fragmento de DNA de interesse para o interior de uma célula hospedeira, que geralmente 
é uma bactéria, embora outras células possam ser utilizadas, como leveduras. 
Estas moléculas de DNA possuem duas características principais para sua função como vetores 
de clonagem.
1. Multiplicam-se dentro da célula hospedeira, gerando várias cópias idênticas.
2. Propagam durante a divisão das células hospedeiras para as novas gerações. 
Abaixo citaremos as características dos principais vetores de clonagem utilizados na atualidade.
Plasmídeos
Os plasmídeos são moléculas de DNA circular que se encontram separadas do DNA cromossômico 
da célula. Este DNA circular geralmente ocorre naturalmente em células bacterianas e leveduras. Ele 
geralmente representa uma pequena fração do DNA total da célula hospedeira, mas que pode ser 
facilmente separado devido seu pequeno tamanho. Como o DNA cromossomal, o plasmídeo também é 
replicado durante a divisão celular, mas de forma independente do cromossomo, garantindo a propagação 
do mesmo através das gerações da célula. 
Os plasmídeos mais comumente utilizados na biologia molecular são oriundos de bactérias e foram 
modificados para atuarem mais efetivamente como veículo de propagação. Por exemplo, o tamanho foi 
reduzido quando comparado ao plasmídeo selvagem para facilitar sua manipulação. Desta forma, eles 
carregam quase sempre pouco DNA a mais que o necessário para sua função. 
Esses plasmídeos possuem (Figura 17): 
1. uma origem de replicação (ORI), que confere sua capacidade de se replicarem dentro 
da célula hospedeira.
+
44
Origem de replicação – região específica de 50 a 100 pares de bases que determina 
o ponto de início da replicação do DNA. Uma vez que a maquinaria de replicação 
da célula reconhece a ORI, a replicação do DNA inicia e segue continuamente, 
independentemente do restante da sequência de nucleotídeos. Desta forma, 
qualquer sequência que for inserida no plasmídeo será replicada com ele.
2. Um ou mais genes que conferem resistência a antibióticos. As células 
hospedeiras passam a ter resistência ao antibiótico (por exemplo, 
ampicilina, cloranfenicol, canamicina) quando carregam estes plasmídeos. 
Estes genes são conhecidos como marca de seleção.
3. Outra forma de seleção, como o sistema azul e branco da β-galactosidase. 
Quando um fragmento de DNA é inserido no plasmídeo, ele quebra 
o gene lacZ da β-galactosidase não pemitindo que a bactéria expresse 
esta enzima. Se o processo de clonagem não for eficiente, o gene da 
β-galactosidase não será interrompido. Logo, a bactéria produzirá 
a enzima que, quando entrar em contato com seu substrato que é 
incolor, ela o degradará e gerará um produto azul. Logo, neste sistema, 
a presença de colônias de bactérias azuis significa que o fragmento de 
DNA de interesse (inserto) não foi clonado, e nas colônias brancas, o 
inserto foi inserido no plasmídeo.
4. Devem possuir um ou mais sítios de reconhecimento para enzimas de 
restrição. Normalmente, os plasmídeos possuem uma pequena região 
onde são encontradas sequências para enzimas de restrição, a esta 
região dá-se o nome de múltiplo sítio de clonagem (MSC). Neste local, o 
plasmídeo será clivado por endonucleases, tornando-se linear de forma 
a permitir a inserção de um fragmento de DNA;
Os plasmídeos são de fácil introdução na célula hospedeira e podem carregar fragmentos de DNA de até 
10 mil pares de bases. Eles podem ser propagados em diferentes células hospedeiras, como bactérias e 
leveduras, para isto eles carregam as marcas de seleção adequadas para cada organismo e a capacidade de 
se replicarem. Nos dias atuais, inúmeros plasmídeos estão disponíveis comercialmente. 
UNIDADE II | Manipulação do dna
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Figura 17. Plasmídeo de clonagem. Esquema representativo de uma plasmídeo com seus componentes essenciais. ori, 
origem de replicação; MSC, múltiplo sítio de clonagem; ampR gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina e lacZ’, 
gene da β-galactosidase, para o sistema de seleção branco-azul. Em destaque o múltiplo sítio de clonagem identificando as 
sequências de reconhecimento para algumas endonucleases. 
Figura adaptada do site: <http://www.engenhariageneticabioq.page.tl/Sequencia%E7%E3o-de-DNA.htm>, retirada em 30/9/2011.
Os plasmídeos podem ser apenas vetores para a manutenção de uma informação genética na sua 
composição com o propósito de armazená-la e propagá-la dentro da célula hospedeira. Assim, nomeados 
de plasmídeos de propagação. Além destes, há também os plasmídeos de expressão que, além da função 
primordial, também atuam como vetores para a expressão de um gene de interesse na célula hospedeira. 
Os vetores de expressão podem ser: plasmídeos de expressão procarioto, cuja célula hospedeira para 
expressão do gene é a bactéria, ou plasmídeo de expressão eucarioto, podendo ser células hospedeiras de 
expressão leveduras, células de mamíferos, vegetais, entre outras.
Para este fim, além das características já mencionadas anteriormente os plasmídeos de expressão devem 
possuir (Figura 18) isto.
1. Uma região promotora facilmente reconhecida pela RNA polimerase, 
para assim iniciar o processo de transcrição.
2. Sítio de ligação do ribossomo (RBS).
3. Sítios que determinam o início e o término do processo de tradução.
4. Um sistema de indução da expressão, que geralmente ocorre pela adição 
de um agente indutor. 
5. Normalmente, nesses plasmídeos o gene de interesse se encontra 
fundido a uma sequência codificadora para uma cauda (por exemplo: 
resíduos de histidina) que facilitará a purificação da proteína de interesse.
Manipulação do dna | UNIDADE II
46
Leiam sobre os processos de transcrição e tradução e fiquem atentos às sequências 
de reconhecimento para a realização destes processos.
Figura 18. Plasmídeo de expressão em bactéria pET28a. O Box é um zoom de algumas partes do plasmídeo. As setas 
numeradas indicam: 1, MSC; 2: Sequência do gene que confere resistência ao antibiótico canamicina (Kan).3: Origem de 
replicação (Ori); 4: Região promotora (T7 promoter); 5: RBS; 6: Sequência que codifica para seis resíduos de histidina que 
ficará fusionada ao gene de interesse. 
Figura adaptada do site: <http://www.genomex.com/vector_maps/ pET28_map.pdf>, retirada em: 17/9/2011.
bacteriofágos (fagos)
São vírus que infectam bactérias, propagando facilmente na célula hospedeira. Os fagos como veículos 
de clonagem foram modificados de bacteriófagos encontrados na natureza. Os fagos possuem em seu 
UNIDADE II | Manipulação do dna
47
genoma sequências de DNA essenciais para que este entre no ciclo lítico ou lisogênico. Como o ciclo 
lisogênico do fago, onde o DNA viral é inserido no cromossomo bacteriano não é de interesse para a 
clonagem molecular, esta região do DNA é substituída pela molécula de DNA-alvo. Logo o fago mantém 
as sequências necessárias para sua replicação e o ciclo lítico (Figura 19).
As vantagens dos fagos em relação aos plasmídeos são:
 » o processo de infecção como transformação bacteriana é mais eficiente doque os 
utilizados para plasmídeos;
 » os fagos carregam fragmentos de DNA de 10 mil a 15 mil pares de bases. 
Vetores construídos a partir de bacteriófagos são cerca de 1 mil vezes mais eficiente do que plasmídeos 
para clonagem de fragmentos maiores. Por essa razão, os fagos foram amplamente utilizados na montagem 
de bibliotecas genômicas e são formados por DNA linear que circulariza no interior da célula hospedeira 
durante a infecção. São dois os principais fagos utilizados como vetores de clonagem o M13 e o l (lambda).
A principal desvantagem do uso de fagos como vetores de clonagem é que eles não são de fácil manipulação. 
Figura 19. Ciclo lítico do fago. (A) O fago injeta o DNA dentro da célula bacteriana. (B) e (C) Replicação do DNA viral e 
montagem das novas partículas virais. (D) Lise da célula bacteriana e liberação dos fagos para infectar novas células 
e assim reinicia outro ciclo. 
Figura adaptada do site: <http://wps.prenhall.com/esm_freeman_biosci_1/7/1952/499794.cw/index.html>, retirada em 17/09/2011.
cosmídeos
São os primeiros vetores que surgiram para tentar resolver o problema de clonagem de fragmentos de 
DNA superiores a 15.000 pares de bases. São moléculas de DNA híbridas que possuem características 
do bacteriófago associadas à do plasmídeo e são produzidas em laboratório. São plasmídeos contendo a 
região “cos” do fago l que codifica para proteínas que empacotam o DNA viral dentro do capsídeo.
Desta forma, eles somam as principais vantagens de seus constituintes: 
 » O processo de transformação por infecção foi herdado dos fagos, o que gera uma 
maior eficiência;
 » Dentro da célula hospedeira, os cosmídeos são replicados como um plasmídeo, e as 
células infectadas são selecionadas pela resistência adquirida para algum antibiótico.
Manipulação do dna | UNIDADE II
48
A vantagem deles em relação aos fagos é a clonagem de fragmentos de 35 mil a 45 mil pares de bases.
bac: bacterial artificial chromosome (cromossomo 
artificial de bactéria)
São vetores de clonagem específicos para bactérias que se comportam como um cromossomo extra na 
célula bacteriana. Assim, eles possuem uma origem de replicação e sequências específicas que permitem 
sua manutenção na célula como cromossomo. A grande vantagem dos BACs em relação aos vetores 
anteriormente citados é a capacidade de carregar fragmentos de DNA de 75 mil a 300 mil pares de 
bases. Amplamente usado em projetos genomas que se destinam a mapear, clonar e sequenciar grandes 
genomas, como o humano.
Até o momento, citamos as características de vetores para clonagem que são propagados em bactérias. 
Agora vamos ver quais são as características de um vetor para propagação em leveduras. 
O principal interesse de ter leveduras como células hospedeiras é em estudos que envolvem a expressão 
de genes oriundos de organismos eucariotos. Um fator limitante na expressão de genes eucariotos em 
bactéria são as possíveis modificações pós-traducionais sofridas pelo produto proteico que em bactérias 
não ocorrem. Em muitos casos, as leveduras podem sanar este problema.
A principal levedura utilizada como célula de propagação é a Saccharomyces cerevisiae, cuja genética é 
bem conhecida, sendo esse organismo considerado um organismo modelo e de fácil manipulação. 
Mas um plasmídeo para ser um veículo de propagação em leveduras possui característica que o diferencia 
de um vetor para clonagem em bactéria.
Os marcadores de seleção para leveduras não são antibióticos, mas, sim, genes envolvidos na síntese 
de aminoácido e nucleotídeos que são componentes essenciais para o desenvolvimento de qualquer 
organismo. Por exemplo, uma levedura deficiente na síntese de um determinado aminoácido, sendo 
assim incapacitada de sobreviver na ausência do mesmo, recupera essa capacidade quando um plasmídeo 
inserido na célula lhe restitui a eficiência na síntese deste aminoácido. Geralmente, as marcas de seleção 
restituem a capacidade de sintetizar histidina, leucina, triptofano ou uracila.
Estes plasmídeos são propagados tanto em leveduras quanto em bactérias, logo, possuem a marca de 
seleção para as bactérias também. 
Mas o porquê disto?
Geralmente, os plasmídeos são de expressão em leveduras e, antes deles realizarem sua função nestas 
células, é necessário inserir o fragmento de DNA de interesse neles. Logo, o procedimento de clonagem, 
como veremos no próximo capítulo, ocorre nas células de bactérias, e não nas leveduras. Após a clonagem 
molecular e propagação do plasmídeo na célula de bactéria, este então será propagado nas células de 
leveduras para promover a expressão do gene de interesse.
UNIDADE II | Manipulação do dna
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Yac: Yeast artificial chromosome, cromossomo 
artificial de levedura
Tem como célula hospedeira, exclusivamente, leveduras e replicam dentro da célula como um cromossomo, 
desta forma possuem algumas características que não são observadas nos plasmídeos.
1. Centrômeros que são regiões fundamentais para a distribuição do cromossomo para 
as células filhas na divisão celular.
2. Os telômeros que são encontrados nas extremidades dos cromossomos e que são 
necessários para a replicação correta das extremidades dos cromossomos e, além 
disso, protegem o DNA de serem clivados por exonucleases.
3. ARS (sequência de replicação autônoma) que permite a proliferação do plasmídeo 
na célula hospedeira.
A criação dos YACs veio dos esforços dos geneticistas para entender a estrutura e o comportamento dos 
cromossomos. Eles têm como vantagens em relação aos cosmídeos a capacidade de inserir fragmentos de 
DNA de 200 mil a 500 mil pares de bases. Eles são usados em projetos genomas e estão sendo substituídos 
pelos BACs.
Manipulação do dna | UNIDADE II
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CAPíTUlO 8
transformação bacteriana
O processo de transformação consiste em inserir um DNA recombinante ou não na célula de bactéria. 
Este processo normalmente confere as bactérias novas características, como, por exemplo, a resistência a 
antibiótico. Griffith, em 1928, foi o primeiro a observar esse processo em bactérias. 
Atualmente, são dois os principais procedimentos de transformação bacteriana.
 » Choque térmico.
 » Eletroporação.
Transformação de bactéria por choque térmico
O método mais antigo e ainda mais utilizado para “persuadir” a bactéria a recolher o DNA exógeno é 
o método da transformação por choque térmico descrito por Mandel e Higa em 1970. Desde então, o 
método já sofreu algumas modificações visando a maior eficiência, mas os fundamentos permaneceram. 
Estes pesquisadores observaram que células de Escherichia coli, quando tratadas com solução de cloreto 
de cálcio e, em seguida, submetidas a um curto choque térmico, a eficiência da transformação era maior.
Nesse processo, as células precisam ser tratadas para se tornarem cálcio-competentes. As células na fase 
de crescimento exponencial (log) passam por etapas de lavagens para eliminar as impurezas e, em seguida, 
passam por, pelo menos, uma etapa de incubação em solução de cloreto de cálcio (CaCl2) e no final do 
processo são mantidas nesta solução a baixa temperatura. A mistura de células e DNA que se encontra 
incubada em gelo é, então, submetida a um rápido choque térmico, aproximadamente 1 minuto a 42ºC 
para promover a entrada do DNA na célula. Finalmente as células são colocadas em meio de cultura para 
se recuperarem do choque e, em seguida, são distribuídas em meio de cultura contendo o agente seletivo 
(antibiótico) para a seleção das células que foram eficientes em receber o DNA exógeno.
O mecanismo pelo qual o DNA é captado pela célula ainda não é bem conhecido, mas uma das hipóteses 
que tenta explicá-lo sugere o seguinte. 
1. As moléculas do DNA passam através de canais situados nas zonas de adesão, 
que são locais onde as membranas interna e externa da célula bacteriana unem-se 
formando poros. A necessidade dascélulas na fase exponencial é justamente porque 
estes poros só estão presentes nesta fase de crescimento.
51
2. A entrada do DNA nas células é dificultada pela repulsão eletrostática entre as cargas 
negativas dos grupos fosfatos do DNA e as cargas negativas dos fosfolipídeos que 
compõem a membrana bacteriana. Os íons de cálcio (Ca2+) estariam interagindo 
com as cargas negativas criando um ambiente eletrostaticamente neutro.
3. A baixa temperatura (0 °C, banho de gelo) congela os lipídeos resultando na perda da 
fluidez da membrana celular. Quando as células são submetidas ao choque térmico 
gera um desbalanço térmico entre o interior e o exterior da célula provocando a 
dilatação dos poros da zona de adesão e o DNA passa através deles.
Transformação de bactéria por eletroporação
A eletroporação tem como fundamentos a aplicação de pulsos elétricos que aumentam a capacidade de 
transporte através da membrana pela formação de poros transitórios na bicamada lipídica permitindo a 
migração de macromoléculas através destes poros. 
Essa técnica é rápida e amplamente utilizada para introduzir moléculas de DNA recombinantes tanto em 
bactéria quanto em leveduras. 
As células devem inicialmente ser tratadas para se tornarem eletrocompetentes, ou seja, tem de se tornarem 
capazes e eficientes na formação dos poros após a submissão a pulsos elétricos de forma a permitir a 
entrada do DNA. Esse procedimento é muito simples e consiste em obter as células na fase de crescimento 
exponencial e, em seguida, submetê-las a várias etapas de lavagens para eliminação principalmente de 
íons e impurezas provindas do cultivo. O preparo das células é específico para cada tipo de célula. 
Para transformar as células por eletroporação, basta aplicar o choque elétrico a uma mistura contendo as 
células e o DNA, as membranas serão então desestabilizada e o DNA penetra na célula (Figura 20). Em 
seguida, as células são transferidas para o meio de cultura sob as melhores condições de temperatura, 
para que as mesmas possam se recuperar do choque e, finalmente, serem selecionadas. O choque elétrico 
é dado em um equipamento chamado de eletroporador.
Manipulação do dna | UNIDADE II
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Figura 20. Princípios da transformação de bactéria por eletroporação. Após um choque elétrico poros são formados na 
membrana plasmática favorecendo a entrada das moléculas de DNA. 
Figura modificada do site: <http://www.byreginatorres.com/2011/08/eletroporacao.html>, retirada em 17/9/2011.
Conheça uma animação sobre a transformação bacteriana:
<http://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html>
UNIDADE II | Manipulação do dna
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CAPíTUlO 9
clonagem molecular
Antes de iniciarmos este capítulo, vamos definir o que é clonagem molecular: é todo o processo de 
construção de moléculas de DNA recombinante, que, basicamente, compreende duas etapas.
 » O fragmento de DNA de interesse, chamado de inserto, é ligado à outra molécula de 
DNA (vetor de clonagem), gerando a molécula de DNA recombinante.
 » O DNA recombinante é propagado em uma célula hospedeira.
Clonagem molecular também é conhecida como:
1. Engenharia genética
2. Manipulação gênica
3. Clonagem gênica
4. Tecnologia do DNA recombinante
Até o momento, tivemos uma visão geral das descobertas que resultaram na consolidação da Biologia 
Molecular como uma área das ciências biológicas. Vimos, também, a importância da descoberta do DNA 
como transmissor da informação gênica. Conhecemos as principais técnicas que permitem a manipulação 
do DNA. 
Sintam-se em um laboratório, pois seguiremos um roteiro de clonagem molecular com a finalidade de 
obter uma molécula de DNA recombinante. 
Inicialmente, iremos fazer algumas considerações pertinentes ao processo de clonagem molecular. 
Antes de iniciarmos a clonagem de um gene, temos de saber qual será a fonte para obtermos o DNA de 
interesse em quantidade suficiente para manipulá-lo. Para este fim, precisamos de informações sobre este 
gene, como:
 » sequência de nucleotídeos, que nos permitirá obter os oligonucleotídeos que 
delimitará a sequência de interesse;
 » organismo de origem, se é eucarioto ou procarioto;
 » se for procarioto, poderemos isolar o gene por PCR, a partir do DNA da fonte;
54
 » se for eucarioto, poderemos isolar por PCR, se nos for dado como fonte cDNAs, mas 
teremos que isolar por RT-PCR se a fonte for mRNA;
 » de acordo com as análises a serem realizadas, determinar qual vetor de clonagem 
que será usado. Geralmente, genes específicos são isolados para serem expressos em 
uma célula hospedeira com a finalidade do produto proteico ser caracterizado.
roteiro para clonagem molecular
Objetivo: Adentramos como estagiários em um laboratório que tem como linha de pesquisa o estudo de 
genes que possam estar relacionados com doenças neurodegenerativas. O chefe do laboratório, Dr. X, nos 
deu a incumbência de clonar o gene que codifica a proteína humana Septina 3 (SEPT3) em um plasmídeo 
de expressão em bactéria, pois há informações na literatura que relacionam esta proteína com o mal 
de Alzheimer. 
Dr. X nos deu uma biblioteca de cDNA (nada mais é que uma coleção de diferentes cDNAs) como 
fonte para a obtenção do DNA e os oligonucleotídeos que delimitam a sequência de interesse e contêm 
sequências adicionais para as enzimas de restrição BamHI em um oligonucleotídeos e XhoI no outro. O 
plasmídeo de clonagem será o pET28a (Figura 18) comercializado pela empresa Novagen.
Mais algumas informações nos foram passadas, como a sequência de SEPT3 que está depositada no Gene 
Bank sob o número de acesso NM_019106.4 e que possui 1014 nucleotídeos (Figura 21).
Figura 21. Sequência de nucleotídeos que codifica a proteína SEPT3. Em negrito e sublinhado estão os três nucleotídeos 
que iniciam e os que finalizam a sequência de SEPT3. Em negrito, a região de pareamento dos oligonucleotídeos e em letra 
maiúscula as sequências adicionais dos oligonucleotídeos que codificam a enzima BamHI (GGATCC) e XhoI (CTCGAG).
 Fonte: Gene Bank sob o número de acesso NM_019106.4.
Vamos às etapas do procedimento, aproveitando para consolidar os conhecimentos já adquiridos até 
o momento.
1. Amplificação do fragmento de DNA por PCR, utilizando os oligonucleotídeos e a 
biblioteca de cDNA como DNA molde. Ou seja, vamos agora obter o inserto de DNA 
que codifica a proteína SEPT3. Após a realização da PCR, precisamos confirmar se a 
reação foi realizada com sucesso.
UNIDADE II | Manipulação do dna
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Como podemos analisar o resultado? Utilizaremos a técnica de eletroforese em gel de agarose, onde 
aplicaremos uma pequena amostra da PCR. 
Confirmação: por análise da reação em eletroforese em gel de agarose (Figura 22).
Figura 22. Confirmação da amplificação de SEPT3. 1: Corresponde ao padrão de fragmentos de DNA de tamanhos 
conhecidos. 2: Produto da PCR, conforme o tamanho esperado, próximo a 1000 pares de bases (pb).
2. Agora que temos o inserto, precisamos prepará-lo junto com o vetor de clonagem 
para que eles fiquem adequados para serem unidos.
Como vimos, o Dr. X nos deu os oligonucleotídeos contendo as sequências de reconhecimento para as 
enzimas de restrição BamHI e XhoI. Assim, após a amplificação do fragmento, este deve ser digerido com 
as enzimas juntamente com o plasmídeo pET28a para que ambos tenham extremidades complementares 
para a reação de ligação (Figura 23).
Figura 23. Clivagem do pET28a e do produto amplificado com as enzimas BamHI e XhoI. 
Manipulação do dna | UNIDADE II
56
3. No próximo passo, realizaremos a ligação entre o inserto e o plasmídeo. Lembrando 
que, para este fim, utilizaremos a enzima T4 DNA ligase. Após a ligação, o plasmídeo 
retorna a sua condição circular, só que agora carregando o gene de interesse 
(Figura 24).
Figura 24. Reação de ligação originando um DNA recombinante.4. Montamos nosso DNA recombinante, mas ainda precisamos propagá-lo em bactéria 
para que, assim, possamos obtê-lo em quantidades suficientes para futuras análises. 
Além disso, precisamos confirmar se a ligação do fragmento ao plasmídeo ocorreu 
como esperado. Nesta etapa, realizaremos a transformação da bactéria Escherichia 
coli com o plasmídeo recombinante. As bactérias que carregam o DNA recombinante 
(bactérias transformantes) serão selecionadas por resistência ao antibiótico 
canamicina, conferida pelo plasmídeo pET28a (Figura 25).
Figura 25. Resultado da transformação da bactéria com o DNA recombinante. (A) Placa controle: transformação realizada 
com água no lugar do DNA, neste caso não cresce bactérias no meio contendo antibiótico. (B) Transformação com o DNA 
recombinante, os pontos brancos representam as colônias de bactérias resistentes ao antibiótico canamicina.
UNIDADE II | Manipulação do dna
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5. Tudo indica que conseguimos propagar nosso DNA na bactéria. Mas, para termos 
certeza, precisamos extrair o DNA plasmidial da bactéria. Para realizamos este 
procedimento, colocamos as bactérias para crescer em meio líquido e deixamos 
que elas se multipliquem por aproximadamente 14 horas. Desta forma, teremos 
uma quantidade de células suficiente para extrairmos o DNA. Um das vantagens 
de utilizar bactérias como células hospedeiras para propagação de DNA é o fato do 
ciclo de vida delas ser curto, aproximadamente 20 minutos. Logo, após 14 horas de 
crescimento, a quantidade de célula é muito superior em relação a quantidade inicial.
6. Já temos o DNA recombinante em quantidade suficiente para ser analisado, então, 
agora, partiremos para confirmar a clonagem, ou seja, confirmar que este DNA que 
extraímos é formado pelo plasmídeo pET28a + SEPT3. Para fazer a confirmação 
utilizaremos duas técnicas, digestão com enzima de restrição e sequencimento de DNA: 
Clivagem do DNA extraído da bactéria com as enzimas BamHI e XhoI, as mesmas 
que nós utilizamos para preparar o plasmídeo e o inserto. Quando os DNAs foram 
unidos pela ação da ligase os sítios das enzimas de restrição foram restituídos, logo 
ficando disponíveis para serem reconhecidos e clivados pelas respectivas enzimas 
(Figura 24). Vamos, então, realizar a eletroforese em gel de agarose para analisarmos 
o resultado esperado para esta clivagem (Figura 26).
Figura 26. Confirmação da inserção de SEPT3 no plasmídeo pET28a. 1, 2, 3, correspondem aos DNAs extraídos de 3 
colônias de bactérias transformantes. M corresponde aos fragmentos de DNA de tamanho conhecido, marcador de pares de 
bases. As setas indicam as bandas correspondentes ao plasmídeo pET28a (aproximadamente 5.400 pb) 
e ao inserto SEPT3 (1014 pb).
Como desejávamos, o inserto foi inserido dentro do plasmídeo e isso é confirmado pela presença dos 
fragmentos de DNA no gel correspondente ao pET28a e o inserto após a ação das enzimas de restrição. 
Quando realizamos este tipo de análise, dizemos que estamos avaliando o padrão de restrição do DNA.
Como isolamos nosso gene de uma biblioteca de cDNA, ou seja de uma mistura de cDNAs, é importante 
que confirmemos que a sequência do fragmento de DNA amplificado corresponde a SEPT3. 
Então, como segunda estratégia de confirmação da clonagem, vamos sequenciar o DNA recombinante. 
Geralmente, nos laboratórios que possuem o equipamento sequenciador de DNA automático, há uma 
Manipulação do dna | UNIDADE II
58
pessoa responsável por manuseá-lo. Logo, passamos o nosso DNA e o oligonucleotídeo para essa pessoa 
e ela nos dará o resultado do sequenciamento. 
E agora, como vamos saber se a sequência corresponde a SEPT3? Para isso fazemos o uso de ferramentas 
da bioinformática que estão disponíveis na web. Além das ferramentas que estão disponíveis no site NCBI, 
que já foram vistas na disciplina “Dogma Central da Biologia Molecular e Introdução à Bioinformática, há 
um conjunto de ferramentas de busca de similaridade chamada BLAST, que tem por finalidade procurar 
similaridade entre sequências. Entre as ferramentas de busca, a que nos interessa é chamada de BLASTx. 
No BLASTx, coloca-se uma sequência de nucleotídeo para ser analisada e o programa irá traduzir 
para sequência de aminoácidos, que será comparada com sequências presentes em bancos de dados 
de proteínas.
Na figura 27, é apresentada a página principal do site, para que todos possam acompanhar como proceder 
para fazer a busca com esta ferramenta da bioinformática. 
Figura 27. Página principal da ferramenta para busca de similaridades entre sequências. BLASTx <http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&BLAST_PROGRAMS=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_
LOC=blasthome>.
Inserimos a sequência que recebemos após o sequenciamento no Box indicado pela seta 1 e, em seguida, 
clicamos o botão BLAST indicado pela seta 2. Ao chegar o resultado da busca, caminhe pela página 
até identificar uma lista, como mostrado na Figura 28. No topo desta lista, já identificamos a septina 3, 
confirmando que nossa sequência corresponde a septina 3 de Homo sapiens, ou seja humana. Clicando 
o ícone ao lado do nome, como indicado pela seta, teremos mais informações sobre o alinhamento 
das sequências.
Parabéns a todos os estagiários, pois concluíram o objetivo proposto pelo Dr. X. Mas, agora, vocês poderiam 
perguntar o que será feito com esse DNA recombinante? Como o interesse do Dr. X é caracterizar a proteína 
SEPT3, este DNA recombinante será introduzido em uma bactéria que contém algumas características 
que favorecem a expressão de genes exógenos que se encontram em um plasmídeo de expressão. Logo, 
UNIDADE II | Manipulação do dna
59
a SEPT3 será expressa por essa bactéria que, em etapas seguintes, serão purificada e passará por várias 
análises para, então, ser caracterizada estruturalmente e funcionalmente. Os procedimentos de expressão, 
de purificação e de caracterização estrutural de proteínas serão vistos nas próximas disciplinas.
Figura 28. Resultado da busca por similaridade de sequências com a ferramenta BLASTx. 
Fonte:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Veja as animações e textos sobre clonagem:
<http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::595::600:: /
sites/dl/free/00725529>
<80/115875/micro10.swf::Steps%20in%20Cloning%20a%20Gene>
<http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/plasmid 
cloning.html>
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21696/>
<http://www.blackwellpublishing.com/allison/docs/sample_ch8.pdf>
Manipulação do dna | UNIDADE II
60
CAPíTUlO 10
Biblioteca de dNa genômico e de cdNa
Em humanos, existem aproximadamente 35 mil genes distribuídos entre bilhões de pares de bases 
do complexo genoma. Os genes podem originar um ou mais tipos de mRNA, cuja informação neles 
contidas será traduzida em proteínas. Além disso, alguns genes podem representar uma pequena fração 
do DNA total, como, por exemplo, os genes que possuem apenas uma cópia dentro do genoma. Para 
estudar qualquer um desses genes, é necessário identificá-lo e isolá-lo dos demais genes do organismo. As 
bibliotecas de DNA e cDNA surgiram para solucionar este problema.
As bibliotecas são coleções de fragmentos de DNA de um organismo clonados num vetor e propagados 
em células hospedeiras, e devem ser representativas para aquele organismo ou tecido. De acordo com a 
origem do DNA, essas bibliotecas recebem nomes distintos.
1. Biblioteca de DNA genômico – como o próprio nome indica, os fragmentos de 
DNA são oriundos do DNA genômico do organismo.
2. Biblioteca de cDNA – o DNA origina-se do mRNA (por meio da transcriptase 
reversa), geralmente de tecidos do organismo, assim, representativa para aquele 
tecido. 
Um gene pode representar apenas um pequeno fragmento de 3000 pb dentro de um genoma de 
aproximadamente 3 x 109 pb e, por outro lado, um mRNA raro podeconstituir apenas 1 entre 106 mRNAs. 
Assim o maior problema na criação de uma biblioteca é gerar uma população enorme de clones, suficiente 
para garantir a representabilidade destas espécies raras. Abaixo, abordaremos pontos importantes no 
preparo das bibliotecas que garantam essa representabilidade.
biblioteca genômica
É uma coleção de clones que representa a totalidade do genoma de um organismo. Como os genomas, 
em geral, são muito grandes, essas bibliotecas são montadas em vetores que permitam a clonagem de 
fragmentos grandes de DNA, por exemplo fago, cosmídeo, YAc e BAC. Espera-se que uma biblioteca 
genômica contenha todas, ou quase todas, as sequências do genoma-alvo. Logo, essas bibliotecas são 
preparadas pela fragmentação do DNA-alvo e pela inserção dos fragmentos em um vetor de clonagem. 
A fragmentação do DNA genômico foi a solução encontrada para resolver o problema de como estudar e 
montar genomas tão grandes. Mesmo os mais simples possuem um tamanho incompatível com qualquer 
vetor de clonagem.
61
A fragmentação do DNA tem algumas características.
 » É aleatória
 » Contém cópias representativas de todo o genoma
 » Gera fragmentos sobrepostos
As regiões que se sobrepõem dos fragmentos determinam a posição deles dentro do genoma, 
consequentemente, permitindo a montagem do genoma. 
Figura 29. Fragmentação do DNA gerando fragmentos sobrepostos.
Basicamente, são dois os métodos de fragmentação do DNA:
 » Quebra mecânica: 
 › Sonicação: o DNA é quebrado pela ação de ondas sonoras de alta frequência
 › Nebulização: a quebra do DNA é realizada pela ação do gás de nitrogênio.
 » Quebra enzimática: quebra do DNA pela ação de enzimas de restrição. A fragmentação 
geralmente é parcial, de forma que nem todos os sítios para uma determinada enzima 
sejam cortados. Isso é possível controlando a quantidade da enzima e o tempo da 
reação. A digestão parcial é importante para gerar os fragmentos sobrepostos, o que 
não acontece se a digestão for completa (Figura 30).
 Figura 30. Digestão completa e parcial do DNA genômico.
Manipulação do dna | UNIDADE II
62
Uma biblioteca genômica de boa qualidade tem que conter essencialmente todas as sequências do DNA 
genômico. Para garantir a representabilidade de um determinado gene de interesse, é necessário produzir 
milhares de clones. Mas como determinar a quantidade de clones suficiente?
Supondo que todas as sequências de DNA têm chances iguais de serem inseridas em um vetor de clonagem, 
após a fragmentação do DNA, a probabilidade (P) de uma sequência específica estar presente é dada por:
onde:
N: número necessário de clones 
I: tamanho médio dos fragmentos clonados (pares de bases)
G: tamanho do genoma do organismo (pares de bases)
Logo, para uma probabilidade de 99% de isolar um gene do genoma de um mamífero que possui 3 x 109 
pares de bases usando um vetor fago (capacidade para fragmentos de até 2 x 104), será necessário 690 mil 
clones. 
Em geral, essa equação mostra que para alcançar 99% de chance de isolar uma sequência específica, o 
número total de clones deverá corresponder em pares de bases a um total de 4,6 vezes o tamanho do 
genoma. Esta corresponde a cobertura mínima do genoma para se identificar uma sequência específica.
Basicamente, os passos para montagem de uma biblioteca são 4:
 » Purificação do DNA genômico.
 » Fragmentação do DNA genômico.
 » Ligação dos fragmentos em vetor de clonagem (fago ou cosmídeo ou BAC ou YAC).
 » Propagação dos DNAs recombinantes em células de bactéria.
Finalmente, vocês podem se perguntar: Qual a utilidade prática para a montagem de bibliotecas 
genômicas?
As bibliotecas genômicas são as fontes das informações dos projetos genomas. Nestes projetos, monta-
se a biblioteca e, após a propagação em bactéria, extraem-se os DNAs recombinantes das células 
UNIDADE II | Manipulação do dna
63
transformantes para então serem sequenciados. Em seguida, com o uso da bioinformática, monta-se o 
genoma identificando todos os genes que o constitui, incluindo as regiões não codificantes. A sobreposição 
dos fragmentos permite a montagem do genoma.
Quando se quer estudar uma região não codificante do DNA, mas importante para a regulação da 
transcrição, por exemplo, essas bibliotecas são a fonte para o material de estudo. Pois, a partir deste tipo 
de biblioteca, pode-se identificar e isolar sequências de interesse por meio de técnicas de hibridização e 
PCR.
biblioteca de cdna
As bibliotecas de cDNA, diferentemante das genômicas, são constituídas apenas das regiões codificantes 
do genoma. Como já vimos anteriormente, o cDNA é o DNA complementar a molécula de mRNA, que 
é obtido por meio da reação com a enzima transcriptase reversa. Essas bibliotecas representam apenas a 
parte do DNA genômico que codifica proteínas, que normalmente corresponde a muito pouco do DNA 
total do organismo.
Em humanos, por exemplo, apenas aproximadamente 1,5% do genoma 
corresponde a sequências codificantes.
Essas bibliotecas, geralmente são montadas de partes do organismo, por exemplo, de humanos há 
bibliotecas de cDNA de coração, de cérebro, de leucócitos, entre outras que são vendidas comercialmente. 
Assim, essas bibliotecas não representam todo o DNA codificante do organismo. Lembrando que a 
transcrição dos genes é específica para cada tipo celular, já que, em cada célula serão expressas apenas as 
proteínas que são fundamentais para seu metabolismo. Cada biblioteca representa apenas uma pequena 
parte da região codificante do genoma. Mas qual a vantagem nisso?
Estas bibliotecas individuais facilitam o isolamento de genes quando já se conhece seu padrão de expressão, 
ou seja, em que tecido ou célula o gene é expresso. E quando não se conhece, para então identificar em 
quais tecidos o gene de interesse é expresso.
Essas bibliotecas também podem ser montadas de um mesmo tipo celular em diferentes estágios de 
desenvolvimento ou sob diferentes condições ambientais, sendo assim úteis para isolar e determinar o 
padrão de expressão de um gene nestas condições distintas. Por exemplo, pode-se identificar um gene 
que é altamente expresso quando determinado tipo celular sofre o ataque de uma bactéria ou um vírus, 
desta forma, essa identificação resultará num gene que, muito provavelmente, está envolvido na resposta 
de defesa da célula para aquele organismo. Análises desse tipo contribuem muito para elucidar funções 
de genes na célula.
Manipulação do dna | UNIDADE II
64
As etapas para a síntese de uma biblioteca de cDNA são as seguintes.
 » Extração dos mRNAs do material de interesse (célula, tecido, órgão).
 » Síntese do cDNA fita dupla.
 » Preparo dos cDNAs e do vetor de clonagem para a reação de ligação.
 » Inserção do cDNA no vetor de clonagem.
 » Propagação dos DNAs recombinantes em células de bactéria.
Após a obtenção da biblioteca de cDNA, técnicas de hibridização e PCR são realizadas para identificar 
genes de interesse.
As bibliotecas de DNA genômico e de cDNA são formadas por coleções de 
sequências de DNA, sendo as maiores fontes de informações em nível de ácidos 
nucleicos. Com essas bibliotecas, os cientistas começaram a entender como as 
informações genéticas são organizadas dentro dos genomas. 
UNIDADE II | Manipulação do dna
UNIDADE IIITécnicas de HibridiZaÇÃo 
67
UNIDADE
Técnicas de HibridiZaÇÃo
Primeiro, vamos fazer algumas definições.
Hibridização: a palavra vem do grego hybris, que quer dizer mistura. Para nós, na Biologia Molecular 
essa mistura pode ocorrer entre:
1. DNA/DNA – moléculas de DNA fita simples podem formar uma molécula fita dupla 
pelo pareamento com outra molécula de DNA;
2. DNA/RNA – Molécula de DNA fita simples podem parear com uma molécula de 
RNA com sequência complementar a sua. Recordando que as moléculas de RNA já 
são naturalmente fita simples;3. Proteína/Proteína – Um anticorpo (recordando – anticorpos são proteínas do sistema 
imune) pode reconhecer e formar um complexo com uma proteína-alvo (antígeno). 
Neste caso, o híbrido formado é chamado de complexo antígeno-anticorpo.
Sonda: é um termo que geralmente se refere a um ácido nucleico que tem a mesma ou uma sequência 
semelhante ao de um gene ou fragmento de DNA específico, de tal forma que a sonda possa hibridizar com 
a molécula-alvo. A sonda deve oferecer ao pesquisador uma forma de ser detectada após a hibridização. 
Assim, a sonda é marcada, ou seja, é quimicamente modificada de alguma maneira a permitir sua 
identificação. Geralmente, enzimas específicas são utilizadas para adicionar nucleotídeos marcados 
durante a síntese da sonda. A sonda pode ser radioativa ou fluorescente. 
Tradicionalmente os ácidos nucleicos são marcados com radioisótopos, que são os isótopos instáveis de 
um elemento. Os isótopos de um dado elemento contêm o mesmo número de prótons, mas diferente 
número de nêutrons. Ácidos nucleicos geralmente são marcados com isótopo P32 (Fósforo 32).
As sondas podem ser de dois tipos:
Heterólogas: é uma sonda similar, mas não exatamente a mesma sequência de nucleotídeos do DNA-alvo. 
Por exemplo, se o gene-alvo tem uma sequência semelhante para um segundo gene que já foi clonado, 
então, esse segundo gene pode ser usado como uma sonda. Uma sonda de camundongo poderia ser usada 
para procurar um gene em uma biblioteca genômica humana.
Homólogas: sondas em que a sequência é exatamente complementar à sequência do DNA-alvo. 
O termo “blotting”: é comumente usado para a transferência de amostras biológicas de um gel para uma 
membrana e a subsequente detecção na superfície de uma membrana.
III
68
CAPíTUlO 11
Southern blot, northern blot e western blot
southern blot
O método de Southern blot é um método clássico de identificação de fragmentos de DNA por hibridização. 
Ele foi descrito, em 1975, pelo biólogo e bioquímico britânico E. M. Southern, e, em sua homenagem, o 
método recebeu seu nome. 
No método de Southern blot o DNA é o alvo, podendo ser hibridizado com outra molécula de DNA ou 
RNA. Abaixo descreveremos as etapas do procedimento (Figura 31).
1. O DNA a ser analisado é digerido com uma ou mais enzimas de restrição e, em 
seguida, os fragmentos de DNA são separado por eletroforese em gel de agarose.
2. O DNA que se encontra na malha do gel é desnaturado na presença de uma solução 
de hidróxido de sódio (alcalina – pH alto), consequentemente, as cadeias do DNA se 
separam gerando assim moléculas de DNA fita simples.
3. A característica fundamental desta técnica, introduzida por Southern, é a transferência 
dos fragmentos de DNA fita simples do gel para um suporte que normalmente é uma 
membrana de nylon ou nitrocelulose. A desnaturação do DNA pode ocorrer antes ou 
durante a transferência. O DNA migra para a membrana por capilaridade na presença 
de uma solução com alta concentração de sal. Como a migração do DNA ocorre 
apenas na direção gel – membrana, a membrana passa a ser uma cópia do gel. O DNA, 
em seguida, é imobilizado na membrana pela ação de luz ultravioleta ou calor.
4. Identificação do DNA de interesse. Nesta etapa, utiliza-se uma sonda de ácido nucleico 
que pode ser DNA fita simples ou RNA marcado radioativamente pela adição de um 
átomo radioativo ou pode ser marcada pela adição de uma molécula fluorescente ou 
cromogênica. Essa sonda contém uma sequência específica que permite identificar o 
gene de interesse após a hibridização entre as moléculas. A membrana será incubada 
com uma solução contendo a sonda para favorecer a hibridização com o fragmento 
de DNA que contenha a sequência de nucleotídeo complementar a sequência da 
sonda. As moléculas da sonda que não hibridizaram são retiradas com lavagens.
5. Identificação da hibridização. Por exemplo, sondas radioativas são identificadas 
com a exposição da membrana a um filme fotográfico. Após a revelação do filme, as 
69
bandas escuras indicam a posição do fragmento de DNA, que pode ser comparado 
com o gel.
Figura 31. Etapas da técnica de Southern blot. Na eletroforese, 1 corresponde ao padrão de DNA de tamanho conhecido e 2, 
3 e 4 são amostras de DNA a serem analisadas. A presença do padrão no gel permite identificar o tamanho do fragmento de 
DNA identificado pela sonda. 
Figura adaptada do site: <http://blog-images.microscopesblog.com/uploaded_images/southern-blot-702630.gif>, retirada em 17/9/2011.
O Southern blot pode ser usado para analisar diferenças estruturais entre genomas, ou para estudar 
sequências de DNA relacionadas, como, por exemplo, para determinar quantas cópias de um mesmo 
gene tem em um determinado genoma. No caso de plantas e animais transgênicos pode ser usado para 
determinar se o DNA exógeno faz parte do genoma do organismo receptor. É utilizado como diagnóstico 
de algumas doenças genéticas. Por exemplo, essa técnica permite identificar alelos mutantes responsáveis 
por doenças herdadas, como a fibrose cística.
É importante mencionar que a técnica de PCR substitui o Southern blot para diagnóstico de doenças 
principalmente quando o gene relacionado à doença já está bem caracterizado, pois já se conhecem sua 
sequência e as mutações relacionadas à enfermidade já são bem definidas. As principais vantagens da 
PCR em relação ao Southern blot para diagnóstico de doenças são: primeiro a quantidade de DNA para 
análise é na faixa de nanogramas enquanto para o Southern é 5 a 10 µg; segundo, a detecção do resultado 
Técnicas de hibridização | UNIDADE III
70
da análise é muito mais simples, e, por fim, o tempo de realização das análises e liberação dos resultados 
pode variar de dois dias para a PCR e uma semana para o Southern blot.
Conheça animações sobre a técnica de Southern blot:
<http://www.dnatube.com/video/1512/Southern-blot>
<http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072552980/student_view0/chapter10/
animation_quiz_ 6_.html>
<http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/elelectro 
phoresis.html>
Northern blot
Da mesma forma que moléculas de DNA são transferidas de géis para membranas de nitrocelulose ou 
nylon, as moléculas de RNA, que possuem uma composição muito similar ao DNA, também podem 
igualmente serem transferidas. A essa técnica foi dado o nome de Northern blot, fazendo-se uma analogia 
aos pontos cardeais. 
Northern blot tem os mesmos princípios do Southern blot. Inicialmente, prepara-se uma amostra de 
mRNA , em seguida, a amostra é submetida a uma eletroforese para separar as moléculas por tamanho. 
Da mesma forma que ocorre no Southern blot, as moléculas de RNA precisam ser desnaturadas, só que 
agora o agente desnaturante é o formaldeído. 
Mas vocês poderiam perguntar: “Por que desnaturar o RNA se ele é formado por uma única cadeia? 
Assim, já está disponível para o pareamento.” O processo de desnaturação, além de separar as cadeias, 
também destrói a estrutura secundária presente na molécula. Assim como o DNA, o RNA também 
possui estruturas secundárias que precisam ser destruídas para, assim, ficar disponível para possíveis 
pareamentos.
O restante do procedimento é idêntico ao Southern blot, sendo, então, os RNAs transferidos para uma 
membrana, para, em seguida, serem sondados com uma sonda que pode ser de DNA ou RNA marcado, 
por exemplo, radioativamente.
O Northern blot não é frequentemente usado com a finalidade de diagnóstico, ele é comumente usado em 
pesquisas. Esse método é padrão para detecção e quantificação de níveis de mRNA. Análises de Northern 
blot fornecem informações sobre o tamanho do transcrito, sua abundância, e permitem detectar splicing 
alternativo em transcritos. Além disso, pode identificar-se o padrão de expressão tecido-específico para 
genes. Um exemplo prático do uso dessa técnica é a identificação de muitos oncogenes que sãoexpressos 
em alguns tumores humano.
Em um experimento típico, a proposta do Northern blot é identificar e indicar o tamanho e a abundância 
do mRNA transcrito de um gene. Para comparar a expressão de um gene sob várias condições ou em 
diferentes tecidos, extratos de mRNA celulares são preparados a partir de diferentes amostras de células ou 
UNIDADE III | Técnicas de hibridização
71
de tecidos para, então, serem analisados por Northern blot. As análises quantitativas do nível de expressão 
do gene são realizadas pela comparação entre as intensidades das bandas na membrana. A quantidade de 
radioatividade capturada por cada amostra na membrana é uma leitura do nível de expressão relativa do 
gene de interesse entre as diferentes amostras (Figura 32). 
Embora esse processo seja robusto, a maior limitação dele é que se pode analisar apenas um alvo por vez, 
ou seja, não dá para avaliar o nível de expressão de vários genes em um único experimento. Para analisar 
um segundo gene, a membrana tem de ser lavada sob condições que disfarça a hibridização, para que a 
sonda seja retirada da membrana, para, então, iniciar outra sondagem com outra sonda. Assim, as análises 
de diferentes genes tornam-se dispendiosa. Para resolver este problema surgiram novas tecnologias que 
veremos nos próximos capítulos.
Figura 32. Experimento típico de Northern blot. mRNAs de diferentes plantas (1 a 8) foram transferidos para uma membrana 
e hibridizados com uma sonda para o gene CyD3. Observa-se a presença da banda correspondente a CyD3 em todas as 
colunas, mas com diferentes intensidades, que indicam diferentes níveis de expressão do gene entre as plantas. 
Figura adaptada do site: <http://www.sciencemag.org/site/feature/data/985481.xhtml>, retirada em 17/9/2011.
Assista uma animação sobre a técnica de Northern blot:
<http://www.youtube.com/watch?v=zfvihIzYyAc&feature=related>
Western blot
Western blot, também conhecida como imunoblotting, é uma técnica de rotina para a análise de proteínas 
que permite a identificação de um antígeno através de um anticorpo. A especificidade da interação 
antígeno-anticorpo permite que uma proteína-alvo possa ser identificada numa mistura de proteínas. 
Western blot pode produzir dados qualitativos e semiquantitativos da proteína-alvo. 
O primeiro passo do procedimento é obter o extrato de proteínas para análise e, em seguida, é realizada a 
eletroforese em gel de poliacrilamida na presença do detergente sódio dodecil sulfato (SDS) que desnatura 
as proteínas. As proteínas separadas são, então, transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou 
PVDC para, então, serem incubadas com o anticorpo marcado (ligado a uma molécula que permitirá a 
identificação do anticorpo). 
Na técnica de Western blot, além da detecção direta da proteína-alvo pela interação com um anticorpo 
marcado, há também a detecção indireta. Neste tipo de detecção a membrana é primeiramente incubada 
com um anticorpo e, em seguida, incubada com um segundo anticorpo marcado. Neste caso, o complexo 
proteína-alvo – anticorpo será reconhecido pelo segundo anticorpo para, então, ser detectada. O segundo 
anticorpo reconhece uma porção do primeiro anticorpo comum a anticorpos produzidos no mesmo 
Técnicas de hibridização | UNIDADE III
72
organismo, chamada de imunoglobulina (Figura 33). O sistema de detecção indireta é comumente mais 
usado por apresentar inúmeras vantagens sobre o sistema direto.
Figura 33. Sistema de detecção indireta no western blot. 
Figura adaptada do site: <http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm>, retirada em 17/9/2011.
Na técnica de Western blot, dizemos que o anticorpo marcado é um anticorpo conjugado. O anticorpo 
pode ser ligado covalentemente (conjugado) a corantes fluorescentes ou enzimas que facilitam a detecção 
do sinal. Por exemplo, muitos anticorpos são conjugados à enzima alcalina fosfatase, que, quando entra em 
contato com um substrato específico, catalisa uma reação química que gera um precipitado cromogênico.
A técnica de Western blot tem uma aplicação muito importante em diagnósticos médicos, ela auxilia 
na detecção de anticorpos produzidos, por exemplo, pelo homem em resposta ao vírus HIV. Como a 
técnica de Northern blot, o Western blot permite comparar o nível de expressão de um único gene em 
diferentes amostras. 
UNIDADE III | Técnicas de hibridização
73
CAPíTUlO 12
Microarranjo de dNa e de proteínas
microarranjo de dna ou dna microarray
A proposta do microarray é examinar a expressão de múltiplos genes simultaneamente em resposta a 
alguma perturbação biológica. Mas genericamente, um microarray indica a abundância dos genes em uma 
mistura complexa, portanto sendo uma ferramenta analítica poderosa para traçar o perfil de expressão 
gênica ou para análise prévia da composição genômica de um determinando organismo.
Microarranjo é uma técnica que veio para solucionar o principal problema do Northern blot e Western 
blot na análise do nível de expressão gênica. Como já comentado anteriormente, essas técnicas permitem 
a análise da expressão de um único gene por experimento. Já com o , é possivel analisar a expressão de 
milhares de genes em um único experimento. O princípio do microarray é o mesmo do Northern blot, 
com algumas diferenças essenciais que tornaram essa técnica a principal para o estudo da expressão 
gênica em grande escala.
tabela 4 – diferenças entre Northern blot e microarray
northern Blot miCroarray
Apenas um gene-alvo pode ser identificado por experimento. Milhares de genes-alvo podem ser identificados em um único 
experimento.
A mistura de mRNA, que é o alvo da varredura, encontra-se fixa 
em um suporte: membrana.
A mistura de cDNA, que é o alvo da varredura, encontra-se em 
solução e marcado com fluorescência ou radioatividade.
Uma sonda é marcada com radioatividade ou fluorescência e se 
encontra em solução.
Milhares de sondas não marcadas e encontra-se fixadas em um 
suporte: microchip.
Visto que no microarray a montagem do experimento é o contrário do Northern blot, pois as sondas 
não são marcadas e se encontram fixadas no suporte, e as moléculas a serem analisadas estão marcadas; 
podemos dizer que o microarray é o reverso do Northern blot.
Primeiro, vamos entender o que é um microchip de DNA, também conhecido biochip.
É uma coleção microscópica de pequenos pontos de DNA (conhecido como spots) aderidos a uma 
superfície sólida. Ou seja, são pequenos suportes sólidos (vidro ou quartzo) com alguns centímetros 
quadrados nos quais são distribuídos mais de 10 mil sondas de oligonucleotídeos ou de cDNAs que 
podem cobrir todo o genoma de um determinado organismo. 
A microdisposição das sondas sob o suporte pode ser de várias formas.
74
 » Microssíntese de oligonuclotídeos in situ (no chip).
 » Distribuição de sondas de oligonucleotídeos pré-fabricadas em suportes sólidos
 » Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA nos suportes.
Mas vocês poderiam perguntar: “Como se pode montar um chip tão pequeno com milhares de fragmentos 
de DNA diferentes? E, além disso, cada fragmento de DNA de sequência conhecida tem sua posição 
identificada dentro do microchip. Logo, o fragmento X que corresponde ao gene Y está na posição Z 
dentro do microchip.” A resposta é: isso é possível só mesmo com a ajuda de robôs! Isso mesmo, os robôs 
auxiliam na montagem dos microchips. São “braços automáticos” que depositam as amostras de DNA 
sobre o suporte. Todo o processo é robotizado. São aplicados, aproximadamente, 100 picolitros (1 picolitro 
corresponde a 10-12 litros) de cada sonda sobre à superfície e o procedimento é de alta reprodutibilidade.
Só para se ter ideia do quanto a tecnologia favoreceu os estudos de análises de expressão gênica, no início, 
os chamados microchips da atualidade, eram distribuições de aproximadamente 100sondas sobre uma 
membrana de nylon, cuja posição era identificada. Essa tecnologia é conhecida como dot blot. Com a 
ajuda da tecnologia, o salto foi de varreduras com 100 sondas para dezenas de milhares cobrindo todo o 
genoma. Atualmente, vários microchips são comercializados (Figura 34).
Figura 34. Microchips de DNA. (A) Dois microchips comercializados pela empresa Affymetrix um do genoma humano 
(esquerda) e o outro do genoma de camundongo (direita). (B) Microchip que pode ser comparado com as dimensões de 
um dedo (tamanho aproximado de uma lâmina de microscópio óptico). (C) Braço do robô depositando as amostras de DNA 
(sondas) sobre uma superfície de vidro. É possível observar as agulhas próximas à superfície do vidro. 
Figura adaptada dos sites: <http://themedicalbiochemistrypage.org/molecular-medicine.html>; <http://www.science photo.com/ media/211651/
enlarge>;<http://www.sciencephoto.com/media/211637/enlarge>, retirada em 17/09/2011.
Agora, vamos abordar as etapas de um experimento com microarray (Figura 35).
 » Inicia-se com a extração de mRNA das amostras, geralmente utiliza-se duas 
amostras, por exemplo, uma controle (mRNA de tecido de mama saudável) e a 
amostra experimental (mRNA de tecido de mama com câncer). Assim, seremos 
capazes de identificar os genes que são expressos diferencialmente no tecido com 
câncer. Os mRNAS serão submetidos a reação com a transcriptase reversa para 
UNIDADE III | Técnicas de hibridização
75
gerarem os cDNAs. Cada amostra de mRNA será, então, marcada com um sonda 
fluorescente, geralmente são usadas cianinas, Cy3 e Cy5. 
 » Hibridização do chip, neste caso, usaremos um do genoma humano. As duas amostras 
de cDNAs marcadas são então misturadas, desnaturadas e, por fim, hibridizadas 
com o microchip. Os cDNAs presentes nas amostras pareiam com a sequência 
complementar presente no microchip.
 » Os cDNAs que não hibridizaram são retirados do microchip com lavagens
 » As sondas são excitadas com laser e cada uma emite uma fluorescência específica 
que será registrada por um scanner e registrada em um computador.
 » Análises dos dados com ferramentas da bioinformática. 
Figura 35. Etapas de um experimento de microarray.
Figura adaptada do site: <http://bme240. eng.uci.edu/students/08s/jentel/Diagnose-hereditary-disease.htm>, retirada em 17/9/2011.
Os dados gerados indicar-nos-ão quais os genes são expressos, exclusivamente, no tecido saudável, 
detectados pela fluorescência emitida pela sonda que foi associada ao cDNAs desta amostra, por exemplo, 
a cor verde.
Da mesma forma, os genes expressos apenas no tecido com câncer são identificados, mas agora, com 
uma cor diferente, por exemplo, vermelho, que é determinada pela sonda adicionada aos cDNAs 
desta amostra.
Mas como serão identificados os genes expressos nas duas amostras? 
Nesse caso, teremos uma mistura das duas cores, visto que as duas fluorescências estarão presentes no 
mesmo local no microchip. 
Outra característica importante é que as intensidades das fluorescências são diretamente relacionadas 
com o nível de expressão dos genes.
Técnicas de hibridização | UNIDADE III
76
Aplicações da técnica de microarray:
 » Análise do padrão de expressão gênica.
 » Genotipagem e determinação de variações genéticas.
 » Identificação de alvos moleculares apropriados para intervenção terapêutica.
 » Classificação e prognóstico de doenças.
 » Identificação de mutações e deleções no DNA.
 » Proteômica.
Os s geram tantas informações que vários bancos de dados foram criados para 
armazená-las. Há bancos de dados privados e públicos. Nestes últimos, as 
informações encontram-se disponíveis para busca, análises e interpretações. 
Podemos fazer uma analogia da importância desses dados aos gerados pelos 
projetos genomas?
Amplie seus conhecimentos. Conheça a animação sobre a técnica de DNA 
microarray:
<http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072552980/student_view0/chapter10/
animation_quiz_8 _.html>
microarranjos de proteína ou protein microarray
Microarranjos de proteína ou protein microarray têm-se revelado valiosos na pesquisa genômica 
fornecendo informações sobre os genes. No entanto, pouca informação é obtida sobre as proteínas 
codificadas pelos genes. Nas últimas décadas, procura-se compreender como as proteínas atuam nas 
células para que todos os processos celulares funcionem em harmonia. Com essas novas abordagens de 
pesquisas, promove-se o desenvolvimento de técnicas para ajudar a compreender o complexo mundo 
das proteínas. No início deste século, surgiram as primeiras pesquisas utilizando arranjos de proteína, 
semelhantes aos microarranjos de DNA.
São dois os principais tipos de arranjos utilizados para estudos bioquímicos de proteínas: microarranjos 
analíticos e os funcionais (Figura 36).
 » Microarranjos analíticos de captura: diferentes tipos de ligantes como anticorpos, 
antígenos, aptâmeros de DNA ou RNA, carboidratos, substratos enzimáticos, entre 
outros, são fixados em microchips. Estes microchips podem ser usados para monitorar 
o nível de expressão de proteínas, além de medir a afinidade de ligação. Semelhante 
aos experimentos de DNA, amostras de proteínas, por exemplo, de dois estados 
biológicos diferentes são marcados com sondas fluorescentes diferentes (Cy3 e Cy5), 
UNIDADE III | Técnicas de hibridização
77
misturados e incubados com os chips. As interações são então identificadas após 
excitação das sondas. Os microarranjos com anticorpos são os mais utilizados, por 
causa da sua capacidade de ligar a proteínas-alvo com alta especificidade e afinidade.
 » Microarranjos funcionais: são diferentes dos analíticos por serem formados por 
inúmeras proteínas inteiras ou domínios funcionais de proteínas, ligados a superfície 
do chip. São usados para investigar interações como, proteína-proteína, proteína-
DNA, proteína-fosfolipídeo, para detectar anticorpos e sua especificidade, e analisar 
atividade enzimática. As análises dependem do tipo de amostra que será incubada 
com os chips.
Figura 36. Aplicações de microarranjos de proteínas. Figura adaptada de: Zhu, H. and Snyder, M. Protein chip technology. 
Current Opinion in Chemical Biology, 2003, 7:55-63.
Técnicas de hibridização | UNIDADE III
78
Os microarranjos de proteínas são uma ferramenta importante para identificação de interação proteína-
proteína e proteína com outras moléculas como DNA, fosfolípidios e DNA. Eles auxiliam na identificação 
de biomarcadores para doenças, principalmente para cânceres. São eficientes em análises de modificações 
pós-traducionais como a fosforilação de proteínas. Em alguns trabalhos, microchips de proteínas foram 
usados para realizar diagnósticos de doenças.
UNIDADE III | Técnicas de hibridização
79
CAPíTUlO 13
Hibridização de colônias: triagem de bibliotecas
Após obter uma biblioteca genômica ou de cDNA, um ponto importante é identificar e isolar genes de 
interesse. Uma das técnicas de varredura de bibliotecas mais comun é a hibridização de colônias. 
A triagem de biblioteca corresponde a um ensaio de Southern blot com colônias de bactérias. Veremos, 
agora, as etapas do procedimento (Figura 37).
 » No final do processo de construção de uma biblioteca, temos placas de Petri 
contendo inúmeras colônias de bactérias, que serão transferidas para membranas 
de nitrocelulose ou nylon, pressionadas suavemente sobre o meio de cultura. As 
colônias são, assim, transferidas e a membrana corresponde a uma réplica da placa.
 » As colônias fixadas na membrana são tratadas com hidróxido de sódio e o conjunto 
de DNA de todas as colônias é liberado e desnaturado. O DNA é fixado na membrana 
por tratamento com calor ou por radiação ultravioleta.
 » A membrana, então, é incubada com solução contendo a sonda de DNA fita simples 
marcada, para promover a hibridização. As sondas quenão hibridizaram são 
retiradas por meio de lavagens.
 » Finaliza-se o procedimento fazendo a revelação para detectar o sinal da radioatividade 
ou da fluorescência presente na sonda. Como a placa original é mantida guardada, 
ela será, então, usada para obter a colônia de bactéria cujo sinal foi detectado na 
membrana. Em seguida, extrai-se o DNA desta colônia para futuras análises. Esse 
DNA poderá ser sequenciado e inserido em vetores de expressão para estudos de 
caracterização do produto gênico.
80
Figura 37. Triagem de uma biblioteca de cDNA ou genômica propagada em bactéria. 
Figura modificada do site: <http://www.ufpe.br/biolmol/aula5_clonagem1.htm>, retirda em 17/9/2011.
Outra técnica utilizada para fazer a varredura de bibliotecas é a PCR.
UNIDADE III | Técnicas de hibridização
UNIDADE IVidenTiFicaÇÃo de Parceiros ProTeicos
83
UNIDADE
idenTiFicaÇÃo de 
 Parceiros ProTeicos
Muitos, se não todos os processos biológicos requerem interações seletivas entre proteínas. Proteínas 
interagem umas com as outras de uma maneira específica, e essas interações desempenham papel 
fundamental em vários processos celulares. Um passo crucial para entender esses processos é determinar 
as atividades bioquímicas das proteínas e como essas atividades são controladas e modificadas por outras 
proteínas. Para compreender os complexos sistemas celulares, é necessário identificar e analisar cada um 
de seus componentes, para assim determinar como eles funcionam juntos e como são regulados. 
Com este propósito, várias técnicas têm sido desenvolvidas para identificação de interação entre proteínas, 
algumas caracterizam interações individuais, ou seja, apenas duas proteínas são analisadas. Outras mais 
avançadas permitem fazer uma varredura em escala genômica, para assim identificar parceiros proteicos, 
como, por exemplo, os microarranjos de proteína. 
Nesta unidade, discutiremos sobre a técnica do duplo híbrido em leveduras que permite identificar entre 
milhares de proteínas, parceiros de interação para uma proteína-alvo in vivo, ou seja, dentro da célula 
onde está sendo expressa. 
IV
84
CAPíTUlO 14
duplo híbrido em leveduras
Muitos fatores de transcrição de eucariotos são formados estruturalmente por dois domínios com funções 
distintas: um domínio na região amino-terminal, que em leveduras se liga a sequências específicas do 
DNA, domínio de ligação ao DNA (BD), e um domínio carboxi-terminal que ativa a transcrição do gene, 
domínio de ativação (AD), através do recrutamento do complexo da RNA polimerase II (Figura 38). 
Figura 38. Esquema de um fator de transcrição. AD – domínio ativação da transcrição; BD – domínio de ligação ao DNA; UAS 
– (Upstream Activating Sequence) sequência onde domínio de ligação ao DNA se liga.
1. Em eucariotos, as RNA polimerases (enzimas que sintetizam o RNA) 
necessitam do auxílio de várias proteínas para iniciar a transcrição, entre 
elas estão os fatores de transcrição.
2. Os fatores de transcrição são responsáveis pelo posicionamento correto 
da RNA polimerase no promotor. Eles auxiliam na separação das fitas do 
DNA para iniciar a transcrição e liberam a RNA polimerase do promotor 
quando a transcrição se inicia.
Alguns pesquisadores observaram que a ativação da transcrição pode ocorrer por montagem de um 
fator de transcrição quimérico, como foi demonstrado para o domínio de ativação da transcrição 
GAL4 (ADGAL4) de leveduras que foi fusionado ao domínio de ligação ao DNA LexA (BDLexA) de 
bactéria, reconstituindo um fator de transcrição funcional em leveduras. Estas observações, mais o fato 
que os domínios de ligação e o de ativação da transcrição quando estão estruturalmente separados são 
ineficazes na ativação da transcrição, serviram como fundamentos para Fields e colaboradores, em 1989, 
estabelecerem uma nova ferramenta genética para o estudo de interação proteína-proteína. 
Eles demonstraram que a fusão de uma proteína X (aqui chamaremos de isca) ao domínio BD (BD-isca) 
e a fusão de uma proteína Y (aqui chamaremos de presa) fundida ao domínio AD (AD-presa) ativaram 
a transcrição de um gene repórter em leveduras, como consequência da interação física entre X e Y que 
promoveu a reconstituição do fator de transcrição funcional. A interação das proteínas foi traduzida 
85
na atividade de um gene repórter que então foi detectada ou medida. Neste sistema, as proteínas são 
direcionadas para o núcleo, onde deve ocorrer a interação e ativação da transcrição do gene repórter.
Por outro lado, se as proteínas fundidas aos domínios AD e BD não interagirem entre si, consequentemente, 
não ocorrerá a remontagem do fator de transcrição e a transcrição do gene repórter não será ativada 
(Figura 39).
Definição: 
1. Gene repórter: são genes cuja expressão é detectada devido alguma característica 
da proteína. Por exemplo, o gene lacZ, da β-galactosidase, cujo produto proteico, 
quando em contato com o substrato adequado, produz uma coloração azul. 
2. Fator de transcrição quimérico: formado pelos domínios BD e AD provindos de 
genes diferentes, por exemplo, BD do gene LexA e AD do gene GAL4.
Figura 39. Fundamentos do duplo híbrido – (A) Esquema da interação entre uma proteína presa fusionada ao domínio de 
ativação (AD) e uma proteína isca fusionada ao domínio de ligação (BD), reconstituindo o fator de transcrição e recrutando 
a RNA polimerase para a transcrição do gene repórter lacZ. A interação é confirmada pela presença da coloração azul 
nas colônias de leveduras após o contato com o substrato. (B) As proteínas presa e isca não interagem entre si, logo, não 
favorecem a remontagem do fator de transcrição e a RNA polimerase não é recrutada, consequentemente, não ocorre a 
transcrição do gene repórter.
No sistema do duplo híbrido em leveduras, temos a proteína de interesse funsionada ao domínio de 
ligação ao DNA (BD-isca) em um plasmídeo de expressão em leveduras. E ao domínio AD, temos uma 
biblioteca de cDNA fusionada, ou seja, temos uma coleção de cDNAs fusionadas ao AD (AD-presa) em 
outro plasmídeo de expressão em leveduras. Simplificadamente, realiza-se uma varredura da biblioteca 
de cDNA com o BD-isca, isso ocorre no interior de células de leveduras, com a expressão das proteínas. 
As interações que ativarem a expressão do gene repórter são alvos de futuras análises.
Vários pontos positivos favorecem o uso do duplo híbrido para o estudo de interação de proteínas. Entre 
eles, a troca de sistemas in vitro por um in vivo, visto que a interação é inicialmente detectada em células 
de leveduras. Interações fracas ou transitórias, que, muitas vezes, não são detectadas por ferramentas 
IdentIfIcação de parceIros proteIcos | UNIDADE IV
86
bioquímicas, são facilmente detectadas no duplo híbrido quando se controla a estringência do sistema e 
se utiliza de estratégias eficientes para detecção da atividade do gene repórter. 
Com experimentos de análise quantitativa da atividade do gene repórter, é possível inferir o quão fortes 
ou fracas são as interações, para assim selecioná-las para estudos futuros. Através de mutações e/ou 
deleções se pode determinar quais resíduos de aminoácidos ou domínios das proteínas são essenciais 
para a interação, mapeando desta forma a interação. Finalmente, o sistema do duplo híbrido pode ser 
usado para varredura de interações em larga escala, utilizando-se bibliotecas de expressão de proteínas 
fusionadas ao domínio de ativação da transcrição. 
Desvantagens também são observadas e assim limitam o uso da técnica do duplo híbrido. Muitos 
questionamentos são feitos em relação ao uso de proteínas quiméricas neste sistema, visto que a fusão das 
proteínas com os respectivos domínios do fator de transcrição pode provocar alterações conformacionais, 
que desfavoreçam a interação ou impeçam a remontagem do fator de transcrição. Outra desvantagemé 
observada em algumas interações proteína-proteína dependentes de modificações pós-transducionais 
que não ocorrem, ou ocorrem de forma inadequada em leveduras.
Desde a sua criação, o sistema do duplo híbrido é utilizado amplamente para estudos de interação de 
proteínas de diversos organismos e novas versões do sistema surgiram com a finalidade de aumentar 
sua aplicabilidade. 
O sistema do duplo híbrido foi criado inicialmente para identificação da interação entre duas proteínas, 
mas muitos processos celulares são dependentes de complexos proteicos constituídos de inúmeras 
proteínas. Pensando nisso, Zhang e Lauthar estenderam o uso deste sistema para a identificação de 
complexos ternários de proteínas, dando nome de triplo híbrido ao sistema. 
O duplo híbrido reverso permite identificar moléculas como peptídeos que promovam a dissociação ou 
impeçam a interação entre duas proteínas, neste sistema a interação entre as proteínas promove a morte 
da cepa de levedura por induzir a expressão de um gene cujo produto é letal à célula. Outra versão do 
duplo híbrido, que recebe o nome de sistema de um híbrido, tem como finalidade detectar a interação 
entre uma proteína e uma sequência específica de DNA.
Quais as vantagens do duplo híbrido em relação ao microarranjo de proteína para 
identificar interação entre proteínas?
UNIDADE IV | IdentIfIcação de parceIros proteIcos
UNIDADE VdePois da duPla Hélice
89
UNIDADE
dePois da 
duPla Hélice
O advento do sequenciamento automático e o desenvolvimento da bioinformática deram origem a era 
da genômica, em que milhões e milhões de dados de sequências de DNA foram gerados oferecendo 
informações que abriram expectativas para várias outras áreas da ciência. Assim, a genômica foi a 
primogênita das eras “ômicas”, ou análises em grande escala.
Com a Genômica, passamos a entender os milhões de pares de bases que compõem os genomas de 
diversos organismos. Aprendemos com o projeto genoma humano isto.
 » O genoma humano é composto de aproximadamente 3,1 bilhões de pares de bases.
 » O genoma é aproximadamente 99,9% o mesmo entre indivíduos de todas as 
nacionalidades.
 » Menos de 2% do genoma codifica genes.
 » Aproximadamente 50% do nosso DNA que não codifica proteína correspondem a 
sequências repetitivas.
 » O genoma possui aproximadamente 20 mil a 25 mil genes.
 » Muitos genes podem gerar mais de uma proteína, permitindo que as células humanas 
possam produzir até 100 mil proteínas.
 » A função de aproximadamente metade dos genes humanos não é conhecida.
A importância da rapidez e da quantidade de dados que foram gerados serviu para que novas ômicas 
surgissem, pois se podiamos obter tanta informação do DNA, porque não desenvolver ferramentas para 
gerarmos informações em grande escala também de outras biomoléculas? Com a genômica, deixamos de 
pensar em um único gene, agora, pensa-se nesse gene, mas dentro do genoma. Desta forma, surgiram as 
“ômicas” que vão além da dupla hélice, transcriptômica, proteômica, metabolômica e fluxômica.
As “ômicas” vão de encontro ao complexo sistema que é o ser vivo, pois os organismos não funcionam como 
um conjunto de pequenas peças que não interagem si, ao contrário disso, essas pequenas peças montam 
uma engrenagem que funciona em harmonia. A única forma de realmente entender os organismos vivos 
é montar esse quebra-cabeça formado pelas pequenas peças. Com este propósito surgiram as ômicas.
A transcriptômica nos permite avaliar apenas as informações dentro do DNA que são transcritas, 
seguindo o fluxo da informação genética. O microarray foi a grande inovação biotecnológica desta área.
V
90
A proteômica analisa o produto final da transmissão da informação gênica, a coleção de proteínas de um 
determinado organismo. Analisamos com a proteômica o nível de expressão das proteínas, mudanças 
pós-traducionais, padrões de interação e localização celular. As proteínas também estão ganhando caras 
com a cristalografia.
A metabolômica é dedicada aos metabólitos celulares. Vamos, agora, entender como atuam os substratos 
e produtos enzimáticos, metabólitos intermediários e secundários, hormônios e moléculas sinalizadoras. 
Já a fluxômica é a análise do fluxo dos metabólitos dentro da célula.
Amplie seus conhecimentos com os textos a seguir.
<http://www.scielo.br/pdf/cr/v40n3/a479cr1680.pdf>
<http://www.gmbahia.ufba.br/index.php/gmbahia/article/viewFile/257/248>
<http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio32/omicas_32.pdf>
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
91
CAPíTUlO 15
Biotecnologia
Iniciamos este capítulo perguntando a você, estimado aluno, “o que é Biotecnologia?”. 
Por mais difícil que parece ser definir Biotecnologia, sempre virá algum fato, alguma informação que nos 
conduza a uma definição para Biotecnologia. Palavras simples estão diretamente associadas a possíveis 
definições por nós elaboradas, como, clonagem, melhorias na qualidade de alimentos, fermentação e 
antibióticos (exemplos clássicos de Biotecnologia), plantas e animais transgênicos, bioremediação, 
biosensores, vacinas, biomaterias, biocombustíveis. 
Definam Biotecnologia utilizando algumas das palavras citadas acima.
Uma definição formal para biotecnologia foi dada na conversão de diversidade biológica (Convention on 
Biological Diversity (CDB)), “qualquer tecnologia que é aplicada a organismos vivos para torná-los mais 
valiosos para as pessoas” (“any technology that is applied to living organisms to make them more valuable 
to people”).
A Biotecnologia é uma ciência multidisciplinar e é impossível estudá-la sem a necessidade de agregar 
informações de diferentes áreas das ciências. Apesar do enfoque inicial da Biotecnologia ter sido a 
Biologia Molecular em aplicações genéticas, hoje, a Biotecnologia necessita de todas as áreas das ciências, 
Biologia, Química, Matemática, Ciências Computacionais, Engenharia, Filosofia E Economia. Economia 
parece estranho, mas a Biotecnologia corresponde a um dos campos da ciência que mais gera capital.
Vamos, rapidamente, exemplificar a interdisciplinaridade da Biotecnologia.
 » Pesquisadores das ciências básicas descobrem um gene em bactéria que é promissor 
como agente para tratamento de uma doença em humano.
 » Biologistas moleculares, bioquímicos, biofísicos utilizam diversas técnicas para 
caracterizar o produto gênico e melhor conhecer as funções deste gene.
 » Os cientistas da bioinformática retiram informações a partir da sequência do gene e 
analisam a estrutura da proteína.
 » Conhecida as características do gene, ele, então, pode ser usado no desenvolvimento 
de fármacos, na agricultura, pode ser aplicado ao meio ambiente etc. Porém 
92
profissionais experientes de cada área estarão envolvidos na produção dos produtos 
biotecnológicos provindos do estudo deste gene.
 » Finalizando, os produtos serão comercializados.
Vamos discutir, agora, sobre algumas das aplicações da Biotecnologia no mundo.
bioprocessamento 
A mais antiga das biotecnologias utiliza células vivas ou componentes moleculares das células para 
produzir o produto desejado. As células mais utilizadas são micro-organismos unicelulares como 
leveduras e bactérias; e os componentes biomoleculares mais utilizados são enzimas, que são proteínas 
que catalizam reações químicas. 
A fermentação é o processo biotecnológico mais antigo que se tem conhecimento, lembrando que 
muito antes de Cristo, na Grécia antiga, já se tomava vinho e se comia pão. Podemos dizer que estes 
dois produtos, que hoje a biotecnologia comanda sua produção, são os mais antigos relatos de produtos 
biotecnológicos. Enzimas produzidas por fermentação microbiana têm papel essencial na indústria de 
alimentos. Na atualidade, boa parte das enzimas envolvidas em fermentação durante a fabricação de 
alimentos é produzida em bactérias.
O primeiro produto alimentarque foi produzido por biotecnonologica é uma enzima usada na fabricação 
de queijo. Esta enzima é a quimosina que inicialmente era purificada de bezerro, cabra e cordeiros, mas 
agora 80% da produção desta enzima é produzida por micro-organismos geneticamente modificados. 
Outros exemplos de produtos em que a fermentação faz parte de seu processo de fabricação: cerveja, 
cidra, vinagre, iogurte e tofu.
O bioprocessamento também está presente dentro do seu guarda-roupa. Por mais de um século, enzimas 
são usadas nas fases de fiação, tingimento e acabamento dos tecidos, tais como o clareamento e o 
amaciamento. Enzimas como celulases e amilases tornam os tecidos mais limpos e macios, auxiliam em 
processos de desbotamento e retiram a goma dos tecidos.
Enzimas também atuam na limpeza da sua casa, quando são adicionadas em detergentes aumentando o 
poder de limpeza destes e os tornando mais biodegradáveis. Nos detergentes, são adicionados proteases, 
amilases e lipases para eliminar proteínas, amido e gordura, respectivamente. Celulases são adicionadas 
em detergentes para remover manchas.
Hoje em dia, produzem-se em grandes quantidades muitos produtos de valor, entre os quais as enzimas, 
pela cultura de micro-organismos específicos, sob condições limpas e altamente controladas em recipientes 
chamados fermentadores. 
Por que a levedura é importante na produção de pão? E por que a massa do 
pão cresce?
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
93
a biotecnologia na produção de 
anticorpos monoclonais
Os anticorpos são proteínas produzidas pelo organismo como resposta às infecções. Uma das características 
mais importantes dos anticorpos é a sua alta especificidade. 
Os anticorpos monoclonais são produzidos em células do sistema imunológico e correspondem a um 
grande avanço no tratamento de cânceres (Figura 40).
As células possuem marcadores de proteína na sua superfície conhecidos como antígenos. Os anticorpos 
monoclonais são produzidos em laboratório para reconhecer marcadores proteicos específicos de células 
cancerosas. Ao reconhecer esses marcadores, os anticorpos ficam sobre essas proteínas e essa ação 
desencadeia um processo de autodestruição da célula ou então comunica o sistema imune do corpo para 
destruir a célula cancerosa.
Estes anticorpos geralmente aumentam a eficácia de outros tratamentos, como a quimioterapia. Os 
anticorpos monoclonais também são usados para detectar poluentes ambientais e micro-organismos 
nocivos em alimentos; para distinguir células cancerosas de células normais, para diagnosticar doenças 
infecciosas em seres humanos, animais e plantas, e, por fim, são usados em testes de gravidez. É a 
biotecnologia de mãos-dadas com a busca da cura para as mais diversas enfermidades.
Figura 40. Produção de anticorpos monoclonais. 
Figura retirada do site: <http://apuradabiologia. blogspot.com/2011/04/anticorpos-monoclonais.html>, retirada em 17/9/2011.
Depois Da Dupla Hélice | UNIDADE V
94
a biotecnologia e as proteínas 
A insulina recombinante foi o primeiro produto biotecnológico para benefício do homem. Este foi o 
primeiro grande passo da biotecnologia, a produção de uma proteína recombinante essencial para o 
tratamento de uma doença, a diabetes.
Antes da tecnologia do DNA recombinante, a insulina usada no tratamento de diabetes era purificada 
de pâncreas de porcos e vacas, e, então, injetada em diabéticos. O processo de purificação era lento, 
difícil, caro e geralmente a insulina continha impurezas. Além disso, a insulina purificada não era eficaz 
em todos os pacientes e, em alguns, provocava reações alérgicas. Em 1978, o gene da insulina humana 
foi clonado em plasmídeo, expresso em bactéria e, assim, a proteína foi purificada. Em 1982, a insulina 
humana produzida em bactérias foi aprovada para uso em humanos.
Logo após a insulina, o hormônio do crescimento usado para tratamento de crianças com problemas de 
crescimento específicos foi também expresso em bactéria e purificado, tornando-se disponível para o uso 
no homem. Em pouco tempo, uma grande variedade de proteínas recombinantes para uso terapêutico 
foram disponibilizadas como resultado da tecnologia do DNA recombinante (Tabela 5).
tabela 5 – proteínas recombinantes para uso terapêutico produzidas em bactérias
proteína hospeDeiro para proDução apliCação méDiCa
Eritropoietina
Estimula a produção de células 
vermelhas do sangue.
Tratamento de pessoas com anemia.
Fator VIII Fator de coagulação sanguínea. Tratamento de certos tipos de hemofilia.
Hormônio de crescimento humano (HGH) Estimula o crescimento ósseo e muscular.
Usado no tratamento de pessoas com 
alguns tipos de nanismo.
Insulina
Hormônio necessário para absorção de 
glicose pelas células do corpo.
Tratamento de pessoas com diabetes.
Interferons e interleucinas
Fatores de crescimento que estimulam 
o crescimento e produção de células 
sanguíneas.
Usado no tratamento de cânceres de 
células sanguíneas, como leucemia.
Vacinas
Estimula o sistema imune para prevenir 
de infecções virais e bacterianas.
Usado para imunizar humanos e animais 
contra o ataque de patógenos.
Atualmente, a maior parte da insulina humana recombinante consumida por 
diabéticos é produzida por bactérias. Lembrando que o genoma humano contém 
íntrons e que as bactérias não são capazes de removê-los, qual o procedimento 
necessário para que a insulina possa ser produzida em bactéria?
Leia textos e sites de pesquisa em:
<http://www.biotecnologia.com.br/>
<http://www.sbbiotec.org.br/portal/>
<http://www.freebooks4doctors.com/fb/BIOTE.HTM>
<http://learn.genetics.utah.edu/>
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
95
CAPíTUlO 16
células-tronco, clonagem terapêutica 
e terapia gênica
células-tronco e clonagem terapêutica
Células-tronco são células capazes de dar origem a outros tipos celulares. Elas são classificadas como 
pluripotentes ou multipontentes.
Células-tronco multipotentes também conhecidas como células-tronco adultas, podem ser encontradas 
no feto, no sangue do cordão umbilical e em vários tecidos adultos. Tais células são parcialmente 
diferenciadas, mas podem formar um limitado número de tecidos e são também conhecidas como 
células-tronco adultas. 
Algumas pesquisas demonstram que células-tronco adultas podem ser usadas pelo organismo para repor 
tecidos, por exemplo, células hematopoiéticas já estão sendo transplantadas para medula óssea com o 
propósito de estimular a produção dos vários tipos de células sanguíneas. Essas células-tronco podem ser 
obtidas em grande quantidade do cordão umbilical, mas são difíceis de isolar e purificar.
Células-tronco pluripotentes são capazes de formar praticamente todos os tipos de tecido encontrados 
em seres humanos (sangue, fígado, músculos, cérebro, ossos etc.). Essas células só podem ser encontradas 
em uma fase do embrião humano, blastócito, e são também chamadas de células-tronco embrionárias.
As células-tronco embrionárias são derivadas de embriões, específicamente aquelas que se desenvolveram 
a partir de óvulos que foram fertilizados in vitro e depois doados por consentimento para fins de pesquisa. 
Os embriões são geralmente de quatro a cinco dias.
A clonagem terapêutica tem como objetivo gerar células-tronco embrionárias in vitro com a finalidade 
de produzir diferentes tecidos. Este procedimento consiste na transferência do núcleo de uma célula 
somática (célula diferenciada) por meio de injeção para um ovócito sem núcleo. Em seguida, inicia-se 
a diferenciação celular e depois de 4 a 5 dias as células-tronco embrionárias podem ser removidas e 
mantidas em meio de cultura. Estas células são geneticamente idênticas a célula que doou o DNA, ou seja, 
a célula da qual o núcleo foi retirado (Figura 41).
Estas células-tronco embrionárias poderiam ser introduzidas no homem para reparar danos causados, 
por exemplo,por doenças neurodegenerativas. Pensando mais além, elas poderiam ser induzidas a 
diferenciar-se formando tecidos e órgãos que poderiam ser usados em transplantes. Além disso, estas 
96
células poderiam ser aplicadas também no combate de doenças cardiovasculares, diabetes do tipo 1, 
acidentes vasculares cerebrais, doenças hematológicas e em traumas na médula espinhal.
Figura 41. Clonagem terapêutica para produção de células-tronco embrionárias. 
Figura adaptada do site: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-40142004000200016&script=sci_arttext>, retirada em 17/9/2011.
O grande potencial deste tipo de terapia pode ser melhor compreendido se as células-tronco e os tecidos 
originados dela forem geneticamente idênticos ao paciente que recebê-los, pois, desta forma, evitaria a rejeição. 
A busca desesperada de pacientes com leucemia por medula óssea poderia ser resolvida com a clonagem 
terapêutica, os médicos criariam medula óssea usando o núcleo de células da pele do próprio paciente.
É importante mencionar que as pesquisas com células-tronco ainda estão engatinhando, mas parecem ser 
promissoras para o tratamento de várias doenças. 
Várias questões fazem com que a clonagem terapêutica seja um tema 
muito polêmico.
1. Após a retirada das células o embrião seria descartado. Estaria o homem 
eliminando uma vida para salvar outra?
2. Algumas pessoas acreditam que uma pessoa é formada no momento que o 
óvulo é fertilizado, então elas consideram a clonagem terapêutica equivalente 
a matar uma criança deliberadamente para beneficiar outra pessoa.
3. De outro lado, fica a questão, os embriões independentemente de serem 
usados para a retirada das células-tronco, quando não são introduzidos em 
um útero, são eliminados após um período nas clínicas de fertilização. Não 
seria mais apreciável utilizá-los para salvar vidas?
4. Podemos considerar violação da vida humana a retirada das células-tronco 
destes embriões que ainda são aglomerados de células?
5. Há a preocupação com o fato que para este tipo de pesquisa será necessário 
grande quantidade de óvulos humanos. É aceitável pagar mulheres para 
coletar seus óvulos? 
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
97
Um país que proíbe pesquisas com células-tronco embrionárias está fadado ao 
atraso científico e até ao progresso humano. 
Terapia gênica
A terapia gênica envolve a inserção de uma cópia de um gene terapêutico (normal) ao genoma de uma 
pessoa para reparar o gene defeituoso. Várias doenças são causadas por genes defeituosos (com mutação), 
como, por exemplo, fibrose cística, hemofilia e susceptibilidade a alguns cânceres. Essa terapia tem como 
objetivo substituir os genes causadores destas enfermidades por um gene normal, sem mutação. 
A terapia gênica é uma forma experimental de tratamento que ainda está na sua infância, mas tem o 
potencial de revolucionar o tratamento de todas as doenças genéticas.
A maioria dos ensaios clínicos de terapia gênica ocorre nos Estados Unidos e na Europa, tendo 
principalmente como foco cânceres. 
Os desafios para desenvolver a terapia gênica são muitos, entre eles estão os seguintes.
1. Conhecer bem o gene defeituoso, causador da enfermidade.
2. Identificar as células específicas para o tratamento.
3. Ter um mecanismo eficiente de entrega do gene.
O ponto mais desafiador da terapia gênica é o mecanismo de entrega do gene o qual depende de vetores 
eficientes. O mais promissor dos vetores é o uso de vírus inofensivos que tem a maioria dos seus genes 
retirados. Esses vírus podem ser usados para transportar o gene até as células e expressá-lo durante seu 
processo de divisão, ou promover a inserção do gene na posição correta dentro do genoma da célula. Uma 
vez dentro da célula, os genes são “ligados” restituindo a função do gene defeituoso.
A terapia gênica tem como alvo apenas células somáticas, pois estas não transmitem a informação 
genética para seus descendentes (filhos). Qualquer impacto da terapia gênica sobre o corpo não deve ser 
transmitido para os filhos, ela deve tratar o indivíduo sem alterar a herança genética para futuras gerações.
Outra técnica de terapia gênica envolve o uso de células-tronco que são manipuladas em laboratório 
para receber o gene exógeno. Esse gene, ao ser expresso, poderia, por exemplo, tornar as células mais 
resistentes à quimioterapia. Logo, as células poderiam ser transplantadas em um paciente, para auxiliar 
no tratamento quimioterápico.
A terapia gênica tem alguns riscos, que conduzem as polêmicas quanto ao uso desse tipo de tratamento.
1. O sistema imunológico pode reagir ao gene exógeno.
2. O gene exógeno pode ser introduzido em lugar errado.
Depois Da Dupla Hélice | UNIDADE V
98
3. Outros genes podem ser entregues acidentalmente para a célula.
4. O vírus pode infectar outras células além da célula-alvo.
Do mesmo modo que a clonagem terapêutica, a terapia gênica ainda necessita de muita pesquisa para 
mostrar o seu potencial. Ela se encontra no centro de várias discussões éticas que envolvem a manipulação 
de células, a transgenia, questões quanto à acessibilidade dessa terapia para a população, entre outras.
Amplie seus conhecimentos. Visite os sites com mais informações a respeito da 
terapia gênica:
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1413-81232002000100010&script= 
sci_arttext>
<http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio12/terapia.pdf>
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
99
CAPíTUlO 17
clonagem reprodutiva – dolly
Até a ovelha Dolly surgir, o meio científico questionava: durante o crescimento e a diferenciação de um 
embrião, ocorrem modificações irreversíveis no genoma de células somáticas?
Ao contrário do que muitas pessoas acreditam, Dolly não é o primeiro clone de mamífero, a clonagem 
tem sido realizada desde a década de 1980 em ovelhas, gado e outros animais. O que faz da clonagem 
de Dolly ser um fato histórico é que os clones que a antecederam receberam o material genético de uma 
célula embrionária, ou seja, uma célula capaz de dar origem a todas as células do organismo. Já a famosa 
ovelha Dolly teve como doador do material genético uma célula somática, ou seja, uma célula que não 
está mais programada para se diferenciar em outros tipos celulares.
Agora, sim, podemos esclarecer, Dolly é o primeiro clone de mamífero que teve como origem o DNA de 
células somáticas.
Os criadores de Dolly, comandados pelo pesquisador Dr. Ian Wilmut, mostraram que as modificações no 
genoma das células somáticas não são irreversíveis e que o DNA pode ser reprogramado. Este foi o grande 
ganho da ciência com a clonagem da ovelha Dolly.
A clonagem de Dolly foi realizada com um procedimento chamado de clonagem reprodutiva, cujas etapas 
estão descritas a seguir (Figura 42).
100
Figura 42. Clonagem reprodutiva – Dolly. 
Figura adaptada do site: <http://www.ghente.org/ temas/clonagem/index_dolly.htm>, retirada em 17/9/2011.
1. Células mamárias de uma ovelha da raça Finn Dorset foram as doadoras do núcleo. 
Neste ponto que está centrada a grande descoberta da ciência, células mamárias são 
células somáticas, ou seja, células diferenciadas, que até o momento eram conhecidas 
como células que não possuem a capacidade de se reprogramar e voltar aos estágios 
iniciais de desenvolvimento. Para que isso aconteça, é necessário que a célula volte 
a ter características de células embrionárias e as informações contidas no DNA 
deveriam ser reprogramadas. Devemos lembrar que, por ser uma célula somática, 
apenas os genes necessários para a manutenção deste tipo celular estão ativos.
2. Essa foi a grande diferença de Dolly para os outros animais que foram clonados 
antes dela, no lugar de células somáticas como as mamárias, utilizava-se células 
embrionárias.
3. Essas células foram cultivadas, cresceram e se dividiram produzindo cópias idênticas 
a elas. Nesteprocesso, isolaram-se células que estivessem na fase G0 do ciclo celular, 
e isso foi obtido submetendo as células a uma condição com poucos nutrientes, 
esse estado é chamado de quiêsciencia (estado de latência onde as células param de 
crescer). Essas células quiescentes foram, então, as doadoras do núcleo, ou seja, do 
material genético.
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
101
4. Uma ovelha da raça Scottish Blackface foi a doadora do óvulo, cujo ovócito foi 
isolado e o núcleo retirado. 
5. O ovócito anucleado e o núcleo da célula mamária foram, então, fundidos por meio 
de uma descarga elétrica. De alguma forma, que ainda não sabemos, o ovócito 
após a fecundação reprogramou o material genético da célula mamária, de modo 
a tornar todos os seus genes novamente ativos, resultando no desenvolvimento de 
um embrião de ovelha. As células se diferenciaram até o 6º dia, quando o embrião é 
chamado de blastócito.
6. Uma terceira ovelha da raça Scottish Blackface entra no cenário como uma barriga 
de aluguel, pois no seu útero foi colocado o blastócito. Após a gestação, essa ovelha 
deu origem a uma ovelha da raça Finn Dorset, idêntica a ovelha que doou o 
material genético.
Para nós, simples mortais, a criação de Dolly parece ter dado tudo certo, mas, na verdade, várias questões 
foram levantadas a respeito do procedimento no meio científico.
1. Dolly foi o único embrião que desenvolveu após 277 tentativas de transferência do 
núcleo, dos quais menos de 10% resultaram em embriões e apenas um desenvolveu 
em um animal adulto. A eficiência do procedimento foi muita baixa.
2. A ovelha Dolly não era tão idêntica a ovelha que doou o material genético, como se 
esperava.
3. Dolly possuia as extremidades dos telômeros 20% menores do que dos animais de 
sua idade, resultando no envelhecimento precoce.
4. Dolly sofria de artrite e doença pulmonar que levaram a sua morte aos 6 anos. A 
pergunta que ficou: essas enfermidades foram fruto do envelhecimento precoce ou 
consequência do estilo de vida imposto a ela?
5. A ovelha que doou o material genético tinha seis anos, como foi observado o 
envelhecimento precoce em Dolly, mais uma questão surgiu: Teria Dolly já nascido 
com idade biológica de 6 anos?
Dolly foi uma experiência com sucesso ou não? 
O que realmente sabemos é que a clonagem de animais, na maioria das vezes, é uma experiência desastrosa, 
pois para cada feto que se desenvolve, vários outros são gerados com anomalias. Poderia o homem já 
estar pensando na clonagem humana, ele está preparado para lidar com “produtos” da clonagem com 
anomalias? O que fazer? 
Depois Da Dupla Hélice | UNIDADE V
102
Na comunidade científica mundial é um consenso que não deve ser realizada clonagem reprodutiva em 
humanos. A clonagem de Dolly deixou claro que há muitos riscos associados a esse procedimento.
É importante sabermos que a clonagem para fins reprodutivos é distinta da 
clonagem para fins terapêuticos. Muitas pessoas confundem esses conceitos 
criando polêmicas em relação às pesquisas com células-tronco. Uma coisa é o 
homem almejar fazer cópias de si mesmo, outra coisa é usar a clonagem para 
produzir tecidos com a finalidade de salvar vidas.
Veja sites com mais informações a respeito da clonagem:
<http://www.revistapesquisa.fapesp.br/Suplemento_Clonagem.pdf>
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-40142004000200016&script= 
sci_arttext>
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
103
CAPíTUlO 18
impressão digital do dNa – Medicina forense
Se existe algumas coisas no mundo que o ser humano pode realmente dizer que são suas, são o corpo, a 
face e as impressões digitais.
Quando pensamos em impressões digitais, a primeira coisa que vem à cabeça são as impressões digitais 
presente nos nossos dedos, que são marcas valiosas para nossa identificação.
Mas será que essas são as únicas marcas que nos diferenciam dos demais seres humanos? Não, temos no 
DNA a melhor forma para identificar uma pessoa. 
Eu faço a vocês mais uma pergunta: “Como, então, podemos usar o DNA para este fim?” A primeira 
resposta que virá à cabeça de vocês é o sequenciamento, a determinação da sequência do DNA. 
.
Não resistirei e farei mais uma pergunta: “É viável sequenciar o genoma de uma 
pessoa para identificá-la?” Pensem, quantos anos levou para sequenciar o genoma 
humano em um esforço conjunto de vários grupos.
Todos os seres vivos são geneticamente diferentes, com exceção dos gêmeos idênticos. Cada indivíduo 
contém uma sequência de DNA que é específica para aquele ser. Ao contrário de impressões digitais 
tradicionais que podem ser cirurgicamente alteradas ou automutiladas, a sequência de DNA não pode 
ser facilmente mudada. 
Nos testes de determinação de identidade genética são estudadas regiões do DNA em que há variações 
entre pessoas. Essas regiões são chamadas de “polimorfismo do DNA” ou “marcadores do DNA”.
Baseada na característica da individualidade do DNA, as análises dessa molécula têm muita aplicação 
na sociedade. Os médicos usam testes genéticos para detectar tipos específicos de doenças hereditárias, 
como a doença de Huntington e a fibrose cística. Alguns testes têm sido desenvolvidos para avaliar a 
predisposição hereditária a certos tipos de câncer de mama e doença de Alzheimer.
A análise do DNA não é restrita a pesquisas genéticas e medicinais, na atualidade, a medicina forense 
depende muito da capacidade do DNA, provindo de amostras biológicas na cena do crime, para determinar 
qual dos suspeitos é o mais provável de ter cometido o crime. Essa capacidade de identificar um indivíduo 
é reforçada pela variedade de substâncias que contém DNA, como sangue, sêmen, saliva, cabelo, unhas, 
ossos, dentes, fezes etc. A análise do DNA é capaz de absolver pessoas injustamente acusadas de crimes, 
como em casos de estupro e assassinatos. 
104
A análise do DNA é a ferramenta principal para os testes de paternidade, na identificação de restos 
mortais. Antropologos usam esse tipo de análise para estudar a migração de seres humanos por todos os 
continentes. A variação de sequências de DNA entre espécies e entre indivíduos também é útil para os 
biólogos que estudam espécies ameaçadas de extinção. 
Vamos analisar algumas características do DNA que permitem utilizá-lo como impressão digital. Cada 
célula humana contém, aproximadamente, 3 bilhões de pares de bases de DNA organizados em 23 pares 
de cromossomos. Cada pessoa herda um conjunto de 23 cromossomos da mãe e um conjunto de 23 
cromossomos do pai. Os dois conjuntos de cromossomos são muito semelhantes entre si. Por exemplo, a 
sequência das bases do cromossomo 1 é quase a mesma em cada ser humano. No entanto, existem regiões 
específicas nos cromossomos onde as sequências podem variar, na média de 1 base em cada 700-1000 
bases serão diferentes entre dois indivíduos. Como o genoma contém dois conjuntos de cromossomos 
com 3 bilhões de pares de bases, em cada conjunto aproximadamente 2 milhões de base (ou 0,1%) serão 
diferentes. Somente gêmeos idênticos irão compartilhar de sequências de DNA idênticas. É essa pequena 
variabilidade na sequência do DNA em locais específicos que permite a identificação de um indivíduo. A 
variabilidade presente na sequência do DNA recebe o nome de polimorfismo. 
A seguir, discorreremos sobre algumas técnicas utilizadas para fazer a tipagem do DNA (determinar a 
impressão digital).
rFlP (restriction fragment length polymorphism) – 
Polimorfismo de comprimento de fragmentos 
de restrição
As enzimas de restrição têm sequências específicas de reconhecimento no DNA, em que as mesmas cortam 
o DNA gerando fragmentos. Quando uma enzima gera fragmentos de DNA de diferentes tamanhos na 
mesma região do genoma de diferentes pessoas, dizemos que ocorre RFLP.
Um RFLP pode surgir em uma região do cromossomo com várias alterações na sequência de bases,gerando ou eliminando sítios de reconhecimento para enzimas de restrição, alterando, assim, o tamanho 
dos fragmentos de DNA. Os fragmentos de DNA são ditos polimórficos quando há variações no tamanho 
entre os indivíduos.
Os RFLPs são analisados em regiões do genoma não codificantes e altamente variáveis. 
O primeiro passo para esse tipo de análise é obter as amostras de DNA que podem vir de qualquer tipo 
celular. Em seguida, o DNA é submetido a digestão com enzimas de restrição. Os fragmentos de DNA, 
então, são separados por eletroforese em gel de agarose. A segunda etapa é a realização de Southern blot, 
ou seja, os fragmentos de DNA serão transferidos para membrana para serem sondados com uma sonda 
específica para regiões altamente variáveis do DNA. O Southern blot revela o padrão de bandas que será 
comparado entre as amostras. A Figura 43 ilustra as etapas do procedimento de análise de polimorfismo 
por RFLP, na qual comparando o padrão de bandas entre a amostra e as plantas A e B, observa-se que a 
amostra e a planta A possuem o mesmo padrão, logo, a amostra corresponde a planta A.
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
105
Figura 43. RFLP. Etapas da análise de polimorfismo por RFLP. 
Figura adaptada do site: <http://www.scq.ubc.ca/dna-fingerprinting-in-the-standardization-of-herbs-and-nutraceuticals/>, retirada em 30/9/2011.
Geralmente, a análise é feita com múltiplas sondas que revelam RFLPs de diferentes regiões variáveis do 
DNA. Logo, se diferentes perfis de RFLPs são avaliados em cada amostra, é muito improvável que dois 
perfis de amostras que não tenham parentesco sejam iguais. 
Uma região do DNA analisada por RFLP são os loci de VNTRs.
VNTR (variable number tanden repeats), também conhecida como minissatélites: são sequências de 
DNA que podem variar de 1.000 a 20 mil pares de bases. Os VNTRs são formados por pequenas sequências 
de DNA de 9 a 80 pares de bases que se repetem em quantidades diferentes entre indivíduos (Figura 
44). Um exemplo de VNTR encontrado em seres humanos é um locus cromossômico conhecido como 
D1S80, na qual a sequência repetitiva é de 16 pares de bases. O D1S80 está localizado no cromossomo 1 
e, geralmente, é repetido entre 14 a 40 vezes no cromossomo.
Agora, imaginem uma enzima de restrição que corte nas extremidades de um VNTR, os fragmentos 
de DNA gerados pela clivagem do DNA com essa enzima dependerá do número de repetições da 
sequência repetitiva dentro do VNTR. Como essas repetições variam entre indivíduos, teremos padrões 
de fragmentos diferentes. 
Depois Da Dupla Hélice | UNIDADE V
106
Vamos trabalhar mais um pouco com nossa imaginação, agora imaginem que além das variações no 
número de repetições podem ocorrer também mutações que eliminem ou criem o sítio da enzima no 
VNTR. Outro padrão diferente de fragmentos será gerado. Essas variações no padrão de tamanho dos 
fragmentos é que são analisadas por RFLP.
 
Figura 44. VNTR em cromossomo humano. Em destaque VNTRs com diferentes tamanhos. 
Figura adaptada do site: <http://www.biology.arizona.edu/human_bio/problem_sets/DNA_forensics _1/ 05t.html>, retirada em 30/9/2011.
No caso do RFLP, as sondas reconhecem sequências repetidas do VNTR e, geralmente, utilizam-se sondas 
para 4 a 6 diferentes loci de VNTRs. Estes loci são particularmente convenientes como marcadores para 
a identificação humana, pois possuem um número muito grande de alelos diferentes e, assim, é provável 
que não existam dois indivíduos não aparentados que compartilhem o mesmo genótipo.
Vantagens deste tipo de análise da impressão digital do DNA.
 » A estabilidade e reprodutibilidade – característica importante para fazer a relação 
entre uma amostra de DNA e uma pessoa.
 » Mais fácil de evitar contaminação, pois a mostra de DNA é maior do que com outros 
métodos de análises, e pequenas contaminações não alteram o resultado.
Desvantagens:
 » Análise é demorada justamente por ter como base o Southern blot.
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
107
 » Quantidade de DNA relativamente grande para se ter uma boa amostra.
 » O custo é muito alto devido o tempo e o trabalho requerido.
sTr e Pcr
STR (short tandem repeats), também conhecida como microssatélites – regiões do DNA com sequências 
repetidas de 2 a 6 pares de bases. Os STRs são encontrados em torno do centrômero do cromossomo e, 
como os VNTRs, possuem tamanhos variados que geralmente não ultrapassa 300 pares de bases (Figura 
45). Os STRs demonstraram ter vários benefícios que os tornaram especialmente adequados para a 
identificação humana.
STRs tornaram-se marcadores de DNA populares porque são facilmente amplificados por reação em cadeia 
da polimerase. O número de repetições em STRs pode ser altamente variável entre os indivíduos, o que os 
tornam eficazes para fins de identificação humana. Quando se pensa em identificar pessoas, é importante ter 
marcadores de DNA que exibem variação mais alta possível, a fim de discriminar entre as amostras.
Quanto menor o tamanho dos alelos STR, melhores candidatos serão para o uso em aplicações forenses. 
Em muitos casos, a amostra de DNA está degradada, logo a PCR será mais efetiva quanto menor for o 
fragmento a ser amplificado.
STR alelos também tem menores taxas de mutação, o que torna os dados mais estáveis e previsíveis.
Devido a essas características, STRs com maior poder de discriminação são escolhidos em banco de 
dados para a identificação humana. 
Figura 45. Esquema de um STR. Em destaque a sequência repetitiva de quatro pares de bases. 
Figura adaptada do site: <http://statistics.arizona.edu/courses/EEB208-2008/Lecture08/Lecture 08.html>, retirada em 30/9/2011.
Os STRs são os polimorfismos genéticos mais analisados na genética forense. Eles foram introduzidos 
nos laboratórios forenses por volta de 1995, atualmente, é a principal ferramenta nestes laboratórios.
Depois Da Dupla Hélice | UNIDADE V
108
Existem milhares de loci de STR que podem ser analisados. Eles são distribuídos em todo o genoma, nos 
22 cromossomos autossomos e nos cromossomos sexuais X e Y. A maioria dos loci utilizados na genética 
forense são constituídos de repetições de 4 pares de bases.
Os STRs satisfazem a todos os requisitos para um bom marcador forense: são robustos, diferentes 
amostras são analisadas com sucesso com a utilização deles; os resultados gerados em vários laboratórios 
são facilmente comparados; eles são discriminatórios, em especial, quando se analisam vários loci ao 
mesmo tempo e requerem poucas células para sucessivas análises. 
Uma forma de análise usada para STR é o PCR multiplex, que corresponde a amplificação de vários STR 
em uma única reação. Corresponde a técnica de PCR, só que no lugar de um par de oligonúcleotídeos 
utilizam-se vários pares específicos para diferentes STRs. Atualmente, são comercializados kits 
que permitem amplificar até 16 loci de STRs e os produtos amplificados podem ser analisados em 
sequenciadores de DNA.
Na Figura 46 temos o resultado da impressão digital do DNA para um crime. Vamos analisá-lo.
Figura 46. Impressão digital de um caso de homícidio. (1) DNA do acusado; (2) amostra de sangue presente no jeans do 
acusado; (3 e 4) amostras de sangue presentes na camisa do acusado, (5) amostra de sangue da vítima. 
Figura adaptada de: Introduction to Biotechnology (William J. Thieman e Michael A. Palladino).
Neste caso, foram analisados amostras de sangue do acusado do crime (coluna 1), amostras de sangue da 
vítima (coluna 5), e, também, amostras de sangue encontradas no jeans (coluna 2) e na camisa do acusado 
(colunas 3 e 4). 
O DNA do acusado (1) apresentou um padrão de bandas totalmente diferente do da vítima (5), como 
esperado, uma vez que, para cada indivíduo, a impressão digital do DNA é única. Mas, comparando o 
padrão das bandas presentes nas amostras da camisa do acusado (3, 4) com o da vítima (5),observamos 
que são idênticos, confirmando que o sangue presente na camisa do acusado é realmente o sangue da 
vítima. Neste caso, as provas do teste de DNA colocam o suspeito no local do crime. A amostra de 
sangue presente no jeans do acusado (2), provavelmente, foi pouca, pois as bandas parecem com baixa 
intensidade, não permitindo a comparação adequada com as demais amostras.
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
109
CAPíTUlO 19
teste de paternidade
Vamos definir o que é teste de paternidade: é o uso da impressão digital genética para determinar se dois 
indivíduos têm uma relação biológica pai-filho.
O teste de paternidade nem sempre foi realizado analisando a impressão digital do DNA, os métodos 
mais antigos incluem tipagem sanguínea e o uso de antígenos leucocitários humanos.
Vamos entender como são estes testes.
1. Tipagem sanguínea: sistema ABO 
 Proteínas presentes na superfície das células vermelhas do sangue, chamadas de 
antígenos, determinam os quatro tipos de sangue: A, B, AB e O. Os antígenos do 
sistema ABO são uma herança dos pais. De forma que, a combinação dos alelos 
recebidos dos pais determina o tipo de sangue do seu descendente. Esse método 
de análise não tem acurácia para determinar a paternidade, mas, sim, para excluir 
candidatos. Ele tem uma força de exclusão de apenas 30%. Logo, não pode ser usado 
para confirmar a paternidade. Em uma disputa de paternidade esse teste pode ser 
usado para excluir um homem de ser pai da criança.
 Além do sistema ABO do sangue o sistema Rh também era utilizado.
2. Antígenos de leucócitos humanos (HLA) 
 São proteínas encontradas na maioria das células do corpo, em maioria nas 
leucocitárias. Os tipos de HLA são compartilhados entre parentes mais próximos. 
Este exame pode excluir até 90% dos supostos pais, mas, do mesmo modo que a 
tipagem ABO, não pode garantir a paternidade a certa pessoa.
 Vocês poderiam perguntar: “Mas 90% é muito alto?” Sim, mas não é suficiente, pois 
se 100 homens são supostos pai de uma determinada criança, este teste permite 
eliminar 90 deles, restando ainda 10 candidatos.
Os testes de paternidade realizados, na atualidade, são os testes de DNA que determinam a impressão 
digital do DNA. 
110
Teste de dna – impressão digital do dna
Sem dúvidas, esse teste é o mais eficaz, porque além de excluir candidatos à paternidade, é o único que 
tem acurácia para determinar quem é o pai. O poder de exclusão deste teste é de 99,99%.
A partir dos anos 1980, houve a grande revolução nos testes de paternidade com o surgimento do RFLP, 
que, por aproximadamente 10 anos, reinou nesta área. Mas com a chegada do PCR, as análises passaram 
a ser feitas utilizando esta técnica, em especial, analisando os loci STR. A acurácia dessas técnicas é igual, 
mas as análises com PCR têm muitas vantagens em relação à RFLP. Por exemplo, a quantidade de material 
para RFLP é bem maior, geralmente o DNA era extraído de sangue. Já para a PCR, utilizam-se células da 
bochecha que são retiradas com um cotonete. Além disso, como já foi mencionado, o tempo de análise 
é muito menor por PCR do que por RFLP. A maior sensibilidade da PCR e sua automação permitem 
realizar testes de DNA em amostras de DNA cada vez menores e, por vezes degradadas, com maior 
rapidez e excelente precisão.
Análises do perfil das bandas produzidas pela PCR ou RFLP são suficientes para excluir um candidato a 
pai, mas não são o bastante para confirmar a paternidade. Quando um candidato é excluído pela análise 
de, pelo menos dois loci, por exemplo de STR, não é necessária a realização de cálculos. Quando as 
análises das bandas indicam que determinado homem é o pai da criança após análise de vários loci, é 
necessária a realização de vários cálculos estatísticos de probabilidade da paternidade. A análise estatística 
leva em consideração a frequência da ocorrência dos alelos compartilhados entre filho-pai na população. 
A maioria dos laboratórios liberam os resultados positivos de paternidade com a probabilidade de 
paternidade mínima de 99,999%.
Agora vamos pensar: “Como, analisando o padrão de bandas em um gel, podemos conferir a paternidade 
a um determinado homem?”.
Vamos relembrar alguns conceitos importantes: como já mencionados. Cada indivíduo recebe um 
conjunto de cromossomos (23) do pai e outro da mãe. Ou seja, metade da nossa informação genética 
veio do pai e a outra metade da mãe. Nós somos o resultado dessa combinação. Dessa forma, a impressão 
digital do nosso DNA é uma combinação da impressão digital do nosso pai com o da nossa mãe. Ou seja, 
na análise comparativa do padrão de bandas, para um determinado locus de STR, teremos bandas que 
vieram da nossa mãe e bandas que vieram do nosso pai. Agora, se analisarmos vários loci e observamos 
sempre a presença de bandas presentes no padrão do nosso pai, então, a paternidade é confirmada. 
Na Figura 47, temos um exemplo de análise da impressão digital para confirmação de paternidade. 
Comparando o padrão de bandas da criança (C) e da mãe (M) observamos que algumas bandas são 
comuns a elas. Agora, comparando o padrão de bandas do suposto pai F1 e da criança (C), vemos que 
nenhuma banda parece ser comum a eles. Vamos, agora, para o suposto pai F2 e a criança (C). As setas 
na Figura 47 indicam a presença de seis bandas que estão presentes apenas nas amostras deles. Por essa 
análise, o candidato F2 é o provável pai da criança (C).
UNIDADE V| Depois Da Dupla Hélice
111
Figura 47. Impressão digital do DNA por RFLP utilizando uma sonda para VNTR 33.1. (M) corresponde a mãe; (C), a criança; 
F1 e F2 correspondem aos supostos pais. 
Figura adaptada de: DNA and Biotechnology (Molly Fitzgerald e Frieda Reichsman Hayes).
Por que o padrão de bandas presente na criança não é a soma do padrão de bandas 
presentes na mãe e no pai (F2)?
Depois Da Dupla Hélice | UNIDADE V
112
CAPíTUlO 20
organismos transgênicos
Um organismo é dito transgênico quando carrega em todas as suas células um gene exógeno, isto é, que 
foi inserido através de técnicas laboratoriais. Cada transgênico é produzido pela introdução de genes 
clonados (fragmentos de DNA originário de microrganismos, animais ou plantas) em suas células. Essas 
novas informações genéticas são introduzidas numa geração sem o comprometimento das informações 
genéticas do organismo. Além disso, o gene transferido é incorporado ao genoma do organismo e pode 
ser expresso em todos os tecidos do animal resultante. 
 A discussão dos transgênicos ganhou força internacionalmente na conferência sobre a fome, realizada 
em Roma no ano de 1967. O evento, apoiado pela Organização das Nações Unidas, foi marcado com 
a declaração da FAO (Food and Agriculture Organization) sobre a futura incapacidade mundial de 
produção de alimentos em nível mundial. A FAO argumentava que a baixa produtividade dos solos, o 
aumento das pragas, a falta de tecnologia de produção de sementes ou a fertilização inadequada seriam 
os principais motivos de escassez alimentar. Aproveitando novas perspectivas de mercado, as empresas 
começaram a patrocinar pesquisas na área da Biotecnologia. Iniciavam-se, assim, as pesquisas sobre os 
alimentos transgênicos.
Em suma, os organismos transgênicos são organismos geneticamente modificados (OGMs). Apesar de 
gerar muita polêmica, o termo geneticamente modificado tem sido utilizado para descrever a aplicação 
da tecnologia do DNA recombinante para a alteração genética de diversos organismos vivos (Figura 48).
Ao longo deste Caderno, vimos um exemplo de transgenia. O processo de inserir um gene em um 
plasmídeo, e, então, fazer a transformação em uma bactéria, é um processo de transgenia. A bactéria 
criada agora passa a ser chamada de bactéria transgênica.
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Figura 48. Exemplo resumido da produção de uma planta transgênica. 
Figura adaptada do site: <http://biocarthagenes.blogspot.com/2011/07/ogm-organismos-geneticamente.html>,retirado em 7/10/2011.
Todos os transgênicos são OGMs, porém nem todos os OGMs são transgênicos. 
Um grupo de pesquisadores desenvolveu uma linhagem de levedura mais eficiente 
no processo de fermentação, por meio de modificações genéticas (tornando-a 
um OGM). Porém nenhum gene exógeno foi adicionado (não sendo considerado 
um transgênico), ao invés disso, houve apenas uma reorganização dos genes da 
própria levedura.
Na pesquisa básica, os transgênicos são excelentes modelos para o estudo da regulação de expressão 
gênica, desenvolvimento e diferenciação celular. Na biotecnologia aplicada, os organismos geneticamente 
modificados pela introdução artificial de características definidas podem funcionar como biorreatores 
para a produção de proteínas valiosas ou para propósitos industriais. 
As grandes vantagens da utilização de organismos transgênicos são estas.
 » Tolerância a insetos – Genes inseridos em plantas, por exemplo, podem conferir 
resistência dessa planta a determinados tipos de insetos. Dessa forma, a planta estará 
livre dos insetos que, em alguns casos, são um grande problema para a lavoura.
 » Tolerância a herbicidas – Da mesma forma que descrito anteriormente, determinados 
genes podem conferir a plantação resistência a determinados herbicidas. Assim, 
esses herbicidas poderiam ser usados, para combater plantas não desejadas, sem 
comprometer a plantação de interesse.
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 » Redução do uso de fertilizantes – Plantas transgênicas necessitam de menores 
quantidades de nutrientes para seu desenvolvimento.
 » Aumento e melhoria na produção de alimentos – Inserindo genes exógenos nas 
plantas podemos aumentar a produção de um determinado nutriente, como a 
vitamina A. É possível também otimizar o processo de fermentação de pão, iogurte 
e cerveja, modificando geneticamente as leveduras.
 » Produção de medicamentos – Podemos produzir vacinas em leite bovino, assim 
como insulina em bactérias (técnica muito utilizada atualmente).
Todas as vantagens descritas acima permitem aumentar e aperfeiçoar a produção de alimentos. Porém, 
para serem comercializados, os OGMs devem ser submetidos a um processo de avaliação muito rigoroso 
e, em seguida, rotulados, respeitando as normas em matéria de rotulagem dos produtos (veremos a fundo 
toda a legislação envolvida na comercialização de produtos transgênicos na última etapa deste Curso).
A primeira aparição da utilização de OGMs na produção de medicamentos foi a 
utilização da bactéria Escherichia coli, que foi modificada para produzir insulina 
humana na década de 1970. Já em 2007, uma equipe de pesquisadores desenvolveu 
mosquitos resistentes ao parasita da malária, através da inserção de um gene que 
previne a infecção destes insetos, diminuindo o alastramento do parasita. 
Apesar de apresentarem inúmeras vantagens, os transgênicos, também, geram muita polêmica, desde seu 
surgimento até os dias atuais. Algumas das desconfianças em relação a eles são as seguintes.
 » Pode ser alergênicos ou tóxicos?
 » Função biológica da proteína expressa apresenta fator de risco para a saúde humana 
ou animal? 
 » Há necessidade de algum processamento prévio ao consumo?
 » A qualidade nutricional do alimento é alterada?
 » Há riscos para o meio ambiente?
 » Em longo prazo, pode ocorrer o aparecimento de organismos “monstros”?
Independentemente das polêmicas envolvidas, os transgênicos são produzidos em larga escala há 
aproximadamente 20 anos. Entre todos os organismos transgênicos existentes, os mais comercializados 
são a soja, o milho, o algodão e arroz.
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Figura 49. Sumário contendo as informações sobre a Transgenia. 
Figura adaptada do site: <http://allnatural.iespalomeras.net/imagenes-web/dibujos/organismos-geneticamente-Modificados.gif> Retirada em 7/10/2011.
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Assista ao link “Montagem ou futuro?” em:
<http://www.youtube.com/watch?v=5yrX2bNBdpw&feature=player_
embedded>
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PARA (NÃO) FINAlIZAR
Durante este Curso, tivemos a oportunidade de apresentar-lhes a história da Biologia Molecular, para 
ilustrar como o conhecimento nesta área foi adquirido. Introduzimos os conceitos e as aplicações das 
técnicas da Biologia Molecular. Começamos com as técnicas que são o alicerce da Biologia Molecular 
e finalizamos com técnicas mais elaboradas. Apresentamos alguns temas polêmicos da aplicação da 
Biologia Molecular. 
Esperamos ter aguçado o interesse de vocês por esta área da Ciência que, hoje, é o ramo da Biologia que 
mais tem se desenvolvido. O estudo das biomoléculas saiu das quatro paredes do laboratório e, hoje, é 
tema de várias discussões referentes a benefícios, questões éticas que estão por trás e até mesmo pela 
importância econômica deste tema. Façam parte dessas discussões, busquem mais informações, procurem 
sempre se atualizar sobre o que está acontecendo nesta área.
Boa Jornada!
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REFERêNCIAS 
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| REFERÊNCIAS