Transgênicos Aula

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Aplicações da Biotecnologia na 
Agricultura
Cultura de Células e Tecidos
Anticorpos Monoclonais e Sondas de Ácidos Nucléicos para 
diagnóstico
Engenharia genética de plantas para a introdução de novas 
características
Mapeamento de genes
Genômica
Usos da Transformação de Plantas
A. Testar a função de genes ou partes de genes
B. Modificar a expressão de genes endógenos
- Desligar genes
- Aumentar a expressão
- Modificar a expressão
C. Mover genes entre organismos
Tecnologia Multidisciplinar
•Biologia Celular – cultura de tecidos
•Biologia Molecular – clonagem, estrutura e 
função de genes
•Melhoramento – desenvolvimento e testes de 
produtos
•Direito- temas regulatórios
•Marketing – aceitação pública
Requerimentos para produção de plantas Requerimentos para produção de plantas 
transformadastransformadas 
A. DNA a ser introduzido
1. gene marcador
2. promotor (constitutivo ou induzido), 
região codificadora e sítio de poliadenilação
B. Cultura de células e protocolo de regeneração
C. Método de introdução do DNA na célula
D. Prova da transformação da planta
Produção de Plantas Transgênicas
Isolar e clonar o gene de interesse 
Adicionar segmentos de DNA para iniciar ou 
aumentar expressão do gene 
Introduzir a construção gênica em células de 
plantas (transformação) 
Seleção de células ou tecidos transformados 
Regeneração de plantas 
86 Genomas microbianos: 
Archaea - 16 espécies 
Bacteria - 70 espécies 
42 Genomas de eucariontes: 
Completos - 8 espécies 
Em andamento - 35 espécies
Isolamento de genesIsolamento de genes
GENEBANK já incorporou 
seqüências de mais de 105.000 
organismos
Período de um ano - 4,6 milhões de 
novas seqüências
Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA 
Construíndo vetores: 
genes, promotores, terminadores e marcadores
Enzimas de restrição 
Nathaus, Smith, Arber 1971, 
Engenharia Genética
Berg, Boyer, Cohen 1973
Estrutura molecular do 
gene
Exon Exon Exon
Intron
Região codificadora
Exon Exon ExonGppp Poly AhnRNA
 Gppp Poly A
Translação
mRNA
ORF
Terminador
CCAAT TATA
Região promotora
Específicos Gerais
Construção de vetores para transformação
35S
 promoterACC oxi
35S
 polyA
35S
 promoter
35S
 polyAbar
EcoRIHindIIIT-Border T-Border
pIBI 23
 Hind III KpnI BamHI
EcoRI NcoI 35S e + 35S pr ACC oxi 35S polyA
pIBI 21
Kpn I BamHI
SacI SacI HindIII
pIBI 11
ACC oxi
Promotores constitutivos 
 CaMV 35S : expressão de genes exógenos em dicots. 
 Ubiquitin: promotor constitutivo em monocots. 
Promotores Orgão/ tecido específico
 Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes 
 -amilase: aleurona de cereais 
 Patatin: tubérculos de batata
 RuBisCo: tecido clorofilado
Promotores mais comumente utilizados
Alguns transgenes têm impacto negativo; portanto transcrição somente 
quando necessário.
 
 Indução de macho-esterilidade para produção de híbridos
 Genes de resistência a doenças quando patógeno aparecer
 Atraso na expressão de genes quando interfere com 
desenvolvimento inicial da planta 
Induzido: alcool desidrogenase  Etanol 
Transiente: Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV)
Promotores induzidos e expressão transiente
FATORES INFLUENCIANDO A 
TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
 Protocolo de cultura de tecidos
 Fisiologia do explante
 Método de introdução do DNA
 Genes marcadores e indicadores
 Protocolo de seleção
Cultura de Tecidos
§ Microprogação
§ Cultura de células
§ Variação somaclonal
§ Cultura de haplóides 
§ Transformação 
§ Sementes artificiais
§ Híbridos Interespecíficos
l Resgate de embriões
l Fusão de protoplastos
PROTOCOLOS DE CULTURA DE TECIDOS
Protoplastos
Calos
Meristemas
Brotos adventícios
Embriões somáticos
CULTURA DE CALOS
MERISTEMA
BROTOS ADVENTÍCIOS
BROTOS ADVENTÍCIOS (Citrus spp.)
 
 
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA (C. arabica) 
MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS EM MÉTODOS 
DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
•Reprodutibilidade 
•Eficiência
•Rapidez
•Baixo custo
•Simplicidade
•Ampla aplicação
Transformação via vetor natural
Agrobacterium
tumefaciens
rhizogenes
Agrobacterium 
§ Bactéria de solo
§ Transferência natural 
de DNA para plantas, 
causando doença 
§ Substituição de DNA 
da bactéria (T-DNA) 
por DNA de interesse
§ Agrobacterium 
transferirá novo DNA 
Agrobacterium tumefaciens
Bactéria com o Ti -plasmídio
 Ti -plasmídio 
(responsável pela virulência)
Infecção de plantas feridas e transferência do 
DNA para as células
Planta com agrobactérias 
vivendo em galhas
Indução pelo T-DNA de: 
1 - crescimento independente de hormônios, 
2 - síntese de opinas (compostos de carbono e N
dos quais a bactéria se alimenta
Transformação via vetor natural
Transferência de DNA da Agrobacterium
Transformação via vetor natural
AGROBACTERIUM 
Método bastante 
conhecido e estudado
Eficiente 
Plantas com limitado 
número de transgenes
Vantagens
AGROBACTERIUM
Genótipo-específico (planta-
bactéria)
Monocot X Dicot
Dependência do sistema de 
regeneração
Desvantagens
MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA
PROTOPLASTO
Eletroporação
Transferência de DNA via química
Microinjeção
ELETROPORAÇÃO
Bio-Rad®
Vantagens
Rápido e eficiente
Grande controle das condições 
experimentais
Desvantagens
Necessidade de protoplastos
Custo equipamento
MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA
MICROINJEÇÃO
MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA
MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA
Parede Celular Intacta
Vácuo
Biobalística
Vortex (fibras)
Sonicação 
Embebição de sementes
Eletroforese
Infiltração de DNA à vácuo
Antes Depois
Tubo de aceleração
Disco de ruptura
Macrocarrier
Partículas + DNA
Tela
Tecido vegetal
BIOBALÍSTICA
PDS-1000/He
Bio-Rad
Parâmetros Físicos
Velocidade das partículas
Tipo de partícula
Propelente e vácuo
Precipitação do DNA
Parâmetros Biológicos
Fisiologia do explante
Tamanho e densidade das células
Parede celular
Osmolaridade
Vantagens
Diversos protocolos de cultura de tecidos
Não exige vetores especializados
Transformação de organelas
Rapidez e simplicidade
Desvantagens
Equipamento especializado
Integração múltipla de transgenes
Variabilidade do processo
Agrobacterium
65%
Biolística
21%
Outros
7%Peg + Eletrop.
7%
Métodos utilizados para transformação
Seleção de Plantas Transgênicas
GENES MARCADORES E INDICADORES
-Glucuronidase
Luciferase
GFP
Antocianina
NPT II
bar - glufosinato
BXN - bromoxinil
EPSPS - glifosato
ALS - sulfonilureias, imidazolinonas
Indicadores
Marcadores
Identificação e seleção de explantes
Genes indicadores
gus A
- glucuronidase
gfp
proteína de 
fluorescência verde
Imidazolinonas - AHAS
Genes marcadores
Glifosato - EPSPS
Genes marcadores
Crescimento e enraizamento 
Transferência para solo em condições controladas
Explantes em meio seletivo
Aclimatação
Casa-de-vegetação