Microrganismos engenharia genética UFV

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Prof.:	
  Cynthia	
  Canedo	
  da	
  Silva	
  
Aula	
  8:	
  Micro-­‐organismos	
  e	
  Engenharia	
  Gené7ca	
  
Tortora	
  et	
  al.,	
  2012	
  	
  
Cap.	
  9:	
  247-­‐272	
  	
  
	
  
Aula:	
  Micro-­‐organismos	
  e	
  Engenharia Genética 
 
Prof. Cynthia Canêdo da Silva 
 
Tortora	
  et	
  al.,	
  2012	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Cap	
  9:	
  247-­‐272	
  
Departamento de Microbiologia 
MBI	
  102	
  
Microbiologia Básica para Engenharias 
Ao final desta aula o estudante deverá ser capaz: 
•  Reconhecer o papel e a importância dos micro-organismos na 
engenharia genética 
•  Identificar as principais etapas e elementos necessários para a 
clonagem de genes 
•  Explicar como as enzimas de restrição e as DNA ligases são 
utilizadas para construir plasmídeos recombinantes 
•  Descrever estratégias que possibilitam a identificação de 
bactérias recombinantes 
•  Reconhecer problemas associados com a clonagem de genes 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
4. Características do vetor ideal MBI 102 
Produtos 
farmacêuticos 
Produtos para 
agricultura e pecuária 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
1. Introdução 
ü  Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA 
Recombinante -1973 
ü  Por que os micro-organismos são importantes 
ferramentas na Engenharia Genética? 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Vantagens da utilização de micro-organismos 
ü  Fácil cultivo – custos relativamente barato 
ü  Obtenção de um grande número de células 
em um curto período de tempo 
ü  Produção de compostos por tempo indefinido 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Cristais de insulina obtidos 
por engenharia genética 
E. coli geneticamente modificada 
Produção de insulina 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Visão Geral 
da Engenharia 
Genética 
1.	
  Vetor	
  
2.	
  Gene	
  
de	
  
interesse	
  
3.	
  Hospedeiro	
  
4.	
  Clonagem	
  
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
3. Características do hospedeiro ideal 
ü  Aceitar o DNA exógeno sem provocar 
modificação no gene 
ü  Permitir a seleção das células que 
apresentarem o DNA exógeno 
ü  Baixo potencial de proliferação no meio 
ambiente 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
4. Características do vetor ideal 
ü  Duplicar o DNA exógeno 
ü  Apresentar marcadores para a seleção 
ü  Apresentar propriedades que facilitem sua 
 ligação ao DNA que vai ser clonado 
Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
3. Características do vetor ideal 
Região em que o DNA 
exógeno pode ser 
inserido 
Plasmídeo 
Vetor de clonagem 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Construção de uma bactéria recombinante 
a) Isolamento do DNA doador 
b) Isolamento do DNA plasmidial 
c) Tratamento com endonucleases de restrição 
 - DNA plasmidial e DNA a ser clonado clivados com as mesmas 
enzimas de restrição -> ligação dos fragmentos de DNA 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
a) Isolamento do 
DNA doador 
Células 
Liberação do DNA 
Purificação do DNA 
Lise das células 
 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
b) Isolamento do DNA plasmidial 
O DNA liberado é 
misturado a uma solução 
de cloreto de césio e 
brometo de etídio 
 
Separação do DNA plasmidial por 
gradiente em cloreto de césio 
O tubo é colocado em um rotor e submetido à 
centrifugação em alta velocidade 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
c) Tratamento com endonucleases de restrição 
ü  Presentes em quase todos os micro-organismos 
ü  Reconhecem sítios específicos na sequência do 
DNA (4-6 pares de bases) 
ü  Função na bactéria: Identificação e destruição 
 de DNA estranho (que não está metilado) 
ü  Produção de terminais coesivos ou cegos 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Clivagem 
Extremidades coesivas 
Enzima de restrição EcoRI 
ü  Extremidades	
  coesivas	
  
ü  Unem	
  uma	
  as	
  outras	
  por	
  
complementaridade	
  
Sítio específico 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Aula	
  8:	
  Micro-­‐organismos	
  e	
  Engenharia	
  Gené7ca	
  
Ação das 
enzimas de 
restrição 
DNA “estranho” não metilado 
Clivado 
DNA do hospedeiro - metilado 
Não clivado 
DNA metilado 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Alguns kits comerciais 
Kit de extração de 
DNA genômico 
Kit de extração de 
DNA plasmidial 
Kit de clonagem 
de DNA 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Transformação 
ü  Transformação com cloreto de cálcio e 
choque térmico 
ü  Transformação por eletroporação 
Método	
  u7lizado	
  para	
  inserir	
  os	
  plasmídeos	
  contendo	
  
o	
  DNA	
  de	
  interesse	
  nas	
  bactérias	
  receptoras	
  
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Plasmídeo 
recombinante 
1) Mistura de E. coli com os 
plasmídeos em presença de CaCl2 
 
2) Aplicado choque térmico 
 
3) Cultivo em ágar nutriente 
contendo Ampicilina 
Células que NÃO 
receberem o plasmídeo 
morrerão em placa com 
ampicilina 
Células transformadas 
sobrevivem em 
placa com ampicilina 
Cromossomo 
 
Plasmideo 
recombinante Transformação 
com cloreto de 
cálcio 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Transformação de E. coli 
Os íons de CaCl2 atuam 
neutralizando as cargas 
negativas da membrana e 
do DNA plasmidial 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Transformação com CaCl2 e Choque Térmico 
Preparo de células competentes 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Transformação por Eletroporação 
Preparo de células competentes 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
f) Identificação das bactérias produtoras da 
 nova proteína 
ü  Uso de plasmídeos com genes que conferem resistência 
 a antibióticos 
ü  Uso de plasmídeos com genes que permitam a 
detecção de bactérias recombinantes 
ü  Hibridização de colônias para identificar bactérias 
 recombinantes 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Detecção da 
bactéria 
recombinante 
ü  Seleção 
branca-azul 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Seleção branca-azul 
 
ü  Inserção do DNA de interesse no gene lacZ 
ü  DNA de interesse 
inserido no meio 
do gene lacZ 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Detecção da 
bactéria 
recombinante 
ü  Seleção 
branca-azul 
Transformação 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenhariagenética MBI 102 
Colônias branca-azul 
ü  Todas as colônias contêm o 
plasmídeo 
ü  Colônias azuis -> transformantes 
ü  Colônias brancas -> transformantes 
recombinantes 
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Hibridização de colônias 
ü  Emprego de sonda de DNA 
para identificar colônias 
contendo o gene de 
interesse 
ü  As sondas de DNA são 
complementares ao gene 
desejado 
4. Características do vetor ideal MBI 102 
Problemas com a clonagem de genes de 
eucariotos em bactérias 
• 	
  Presença	
  de	
  íntrons	
  
• 	
  A	
  bactéria	
  não	
  reconhece	
  as	
  sequências	
  reguladoras	
  de	
  	
  
eucariotos	
  
• 	
  Formação	
  de	
  agregados	
  protéicos	
  insolúveis	
  
• 	
  Síntese	
  em	
  excesso	
  da	
  proteína	
  
• 	
  Destruição	
  da	
  nova	
  proteína	
  
• 	
  Dificuldades	
  na	
  extração	
  e	
  purificação	
  da	
  nova	
  proteína	
  
4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 
Síntese de cDNA 
ü Transcriptase reversa 
ü Fita molde: mRNA 
A primeira fita de DNA 
é sintetizada pela 
transcriptase reversa. 
4. Características do vetor ideal MBI 102