Imunologia Clínica Imunodiagnóstico

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MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS
1- INTRODUÇÃO
POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS?
QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS DOS ENSAIOS QUE UTILIZAM ANTICORPOS?
1- INTRODUÇÃO
1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:
Especificidade
Diversidade
Memória
Especialização
Autolimitação
Não reatividade ao próprio
1- INTRODUÇÃO
1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:
Especificidade – conferida por duas moléculas principais: 
	- TCR – presente na membrana de linfócitos;
	- Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.
1- INTRODUÇÃO
1.2- Principais isotipos de anticorpos
IgM
IgG
IgA
IgE
IgD
1- INTRODUÇÃO
1.2- Principais isotipos de anticorpos:
IgM
IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade
IgA
IgE
IgD
1- INTRODUÇÃO
1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos:
-Especificidade: Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado.
Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas.
OBS: Dependente do tipo de anticorpo e antígeno empregado no teste, e do sistema de detecção da interação Ag-Ac.
1- INTRODUÇÃO
1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos:
-Sensibilidade: Característica inerente ao método, estritamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada
Estritamente ligada ao sistema de amplificação e detecção da interação Ag-Ac.
Métodos: enzimáticos, radioativos, fluorescentes. 
Princípio da detecção Ag x Ac
Ac reconhece antígeno específico e liga-se a partícula insolúvel
Filtração ou Centrifugação
Isolamento das partículas ligadas
Adiciona-se Ac específico marcado (radioativo fluorescente, enzimático)
Detecção das ligações Ag xAc pela ação do anticorpo marcado
1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos:
Ac e Ag em condições EQUIMOLARES
Formam complexos insolúveis que precipitam naturalmente
Pode ser monitorado por dispersão de luz ou turvação
Nestas condições, a concentração relativa de Ag e Ac são os fatores determinantes para a formação dos complexos
Zona de Equivalência: Concentração de Ag e Ac são equivalentes
- Zona de Excesso: Formam-se quantidades decrescentes de precipitado ( ou complexos pequenos) nas zonas de excesso de Ag ou Ac
1- INTRODUÇÃO
Curva de precipitação Ag x Ac
- Pode-se utilizar a formação de imunocomplexos insolúveis para quantificar Ag se for utilizado uma concentração conhecida de Ac. (vice-versa) 
Fenômeno PRÓ-ZONA
Refere-se a formação subótima de imunocomplexos Ag ou Ac estão em excesso.
Fenômeno PRÓ-ZONA
Este fenômeno pode ser o responsável pela interpretação incorreta de testes quando existe grande quantidade de Ac (mieloma múltiplo) ou Ag incorretamente diluídos (reações de aglutinação)
1- INTRODUÇÃO
1.4- Fatores a serem analisados na escolha do método:
Sensibilidade;
Especificidade (confiabilidade de resultados);
Custo;
Disponibilidade de material;
Segurança;
Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada;
Tempo de realização do método.
1- INTRODUÇÃO
1.5 – Aplicações dos métodos:
- Identificação e/ou quantificação de moléculas específicas em fluidos biológicos;
Purificação de proteínas;
Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e hipersensibilidades;
Identificação de genes e seus produtos;
Localização de moléculas específicas em células e tecidos.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
HISTÓRICO
CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS
VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS
de
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.1 - Imunoaglutinação/Imunoprecipitação: Primeiros testes a serem desenvolvidos:
 Realizados em meio líquido;
 Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização – Baixa Especificidade;
 Não possuem metodologias eficazes para a detecção da interação Ag/Ac – Baixa Sensibilidade.
Semiquantitativo
AGLUTINAÇÃO
Método para detecção de Ac: Particula recoberta com Antígeno
Método para detecção de Ag: Particula recoberta com Anticorpo
Aplicações
Detecção de Anticorpos Heterófilos : mononucleose infecciosa
Aglutinação do látex
Teste para detecção de gonadotropina coriônica humana em urina: HCG
Busca de crioaglutininas: IgM produzida pelo paciente em resposta a Mycoplasma pneumoniae. O soro do paciente aglutina eritrócitos a 1% quando a 4oC
 Outros 
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.2- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos.
- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac;
 Variações no método: Inibição da Hemoaglutinação.
Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.2- Hemoaglutinação:
Memória
Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.2- Hemoaglutinação:
 Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido;
 Desvantagens: Baixa sensibilidade e especificidade, devido a mal armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos.
Memória
Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.3- Fixação do Complemento: Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac.
Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.3- Fixação do Complemento:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.3- Fixação do Complemento: 
Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo;
Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer.
1º ESTÁGIO
Ag e Ac reagem na presença do complemento
Complexo Ag-Ac fixam as proteínas do complemento
2º ESTÁGIO
A atividade do complemento restante, é determinada pela adição de eritrócitos de carneiro sensibilizados que fixam o complemento.
Eritrócitos de carneiro sofrem hemólise
Relação entre as reações
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.4- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar).
 Diversos tipos:	
 Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente;
- Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.
2.4 Imunodifusão
Simples:
Ouchterlony:reatividade ao próprio
Aplicação
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor;
Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5- ELISA:
Sanduíche
Competição
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5.1- ELISA Indireto:
Outros componentes do soro
ELISA “SANDWICH”
Antígeno a ser dosado
Anticorpo primário
Anticorpo conjugado
TMB
Enzima Peroxidase
ELISA DE COMPETIÇÃO
Outros componentes do soro
Antígeno a ser dosado
Anticorpo primário
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase
ELISA DE CAPTURA
Anticorpo anti-IgM
IgM a ser detectada
IgM inespecífica
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase
ELISA INDIRETAAntígeno purificado
IgM a ser detectada
IgM inespecífica
Anticorpo conjugado
TMB
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5- ELISA:
 Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio.
 Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos.
 Métodos de alta especificidade e alta especificidade
 Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica).
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
 Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular.
- Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas
 Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido
 Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos
 Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
 Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes;
 Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.
3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
 Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas & Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier Editora
 Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P. Sittes & Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan Editora.
 Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta Edição. Roca Editora.
 Imunologia. David Male, Ivan Roitt & Jonathan Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora.
 Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença. Charles Janeway, Paul Travers & Mark Walport & J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed Editora.
Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray Edwards. Oxford University Press.
Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow & David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press.