Marcadores Moleculares - LEISHMANIOSES

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Relatório Parcial/PIBIC 2015-2016
MARCADORES MOLECULARES PARA DETECÇÃO E DISTINÇÃO DE ESPÉCIES DE Leishmania POTENCIALMENTE VISCEROTRÓPICAS
Lucas George Assunção Costa
 
 Dra. Lourdes Maria Garcez dos Santos (Orientadora)
Introdução
 O emprego de um tratamento com maior efetividade e rapidez necessita de um diagnóstico laboratorial prático e específico em casos de leishmaniose visceral.
PCR kDNA – RV1,RV2
 
PCR-RFLP Hsp70-234 
 ITS1
 
 “The genetic structure of Leishmania infantum populations in Brazil and Its Possible Association with the transmission Cycle of Visceral Leishmaniasis”
2
Objetivos
Gerais:
- Avaliar a detecção de DNA de Leishmania pela PCR-RFLP Hae III Hsp70-234 e ITS1.
- Detectar de espécies de Leishmania potencialmente viscerotrópicas.
Específicos:
- Analisar o poder discriminatório dos marcadores.
- Investigar variações intraespecíficas em casos de portadores de LV.
Metodologia
Obtenção das amostras
Preparo das amostras
Qualidade do DNA
Quantificação do DNA
Concentrações de DNA para uso nas PCRs
PCRs e Eletroforese dos amplicons
Metodologia
Obtenção e preparo das amostras
Portadores de LV no Pará.
Extração do DNA
Quiagen – QI Amp DNA Mini Kit
13 isolados
Leishmania (L.) infantum 
Leishmania (L.) amazonensis
Leishmania (L.) donovani
Obs: Leishmania (L.) donovani está sendo providenciada
 
Metodologia
Qualidade e Quantificação das amostras
Eletroforese Gel de Agarose 2%
Nanodrop 2000
Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific)
Metodologia
Concentrações de DNA para uso nas PCRs
Ajuste das amostras:
10 ng/µL
1 ng/µL
0,1 ng/µL. 
Verificação com o Qubit 2.0
Metodologia
Primers e Enzimas utilizados
ITS1 LIT SR e L.5.85
Anelamento a 61°C
Hsp70-234 Hsp70-234 R e Hsp70-234 F 
Anelamento a 61°C 
Hae III
Resultados
Qualidade e Quantificação das amostras
Eletroforese
Nanodrop 2000
Relação entre as densidades ópticas (ƛ=260nm e 280nm ).
Entre 1,8 e 2 = solução pura de ácidos nucleicos.
Duas amostras fora do padrão.
Qubit 2.0 
- Duas amostras 
 [ ] < 10 ng/µL
Resultados
PCR ITS1
Amplicons 320pb
 [ ] 10ng/µL 
 
11 isolados
 Leishmania (Leishmania) amazonensis
 
Amostra
[10ng/µL]
H01
H02
H03
X
H04
H06
H13
X
H16
X
H17
X
H21
X
H22
X
H25
H27
H30
X
6445
PH8
X
Resultados
PCR Hsp70-234
Amplicons 234pb
06 isolados
 Leishmania (Leishmania) amazonensis
 Leishmania (Leishmania) infantum
- 04 amostras de 10ng/µL
- 06 amostras de 1ng/µL
Amostra
[]10ng/µL
Amostra
[]1ng/µL
H01
H01
X
H02
H02
H03
H03
X
H04
H04
H06
H06
H13
H13
X
H16
X
H16
X
H17
X
H17
H21
H21
H22
H22
H25
H25
H27
H27
H30
X
H30
6445
6445
X
PH8
PH8
Resultados
PCR-RFLP das regiões ITS1 e Hsp70-234
 PCR-RFLP Amostras [ 10 ng/µL ] ITS1 e Hsp70-234
 
 ITS1 Hsp70-234
 
 
 
PND
Br.
6445
H17
H30
H16
H03
PND
Br.
6445
H17
H30
H16
H03
Cronograma de atividades
Atividade
Mês
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
Revisão bibliográfica e elaboração de POPs
 X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Extração de DNA
 x
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Quantificação de DNA
 
x 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR ITS 1 – DNA conc. 10 ng/µL
 
 
x 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR-RFLP ITS 1
 
 
 
x 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR hsp70-234 – DNA conc. 10 ng/µL
 
 
 
 
x 
 
 
 
 
 
 
 
PCR-RFLP hsp70-234
 
 
 
 
 
x 
 
 
 
 
 
 
Relatório semestral
 
 
 
 
 
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x 
 
 
 
 
 
PCR ITS 1 – DNA conc. 1ng/µL
 
 
 
 
 
 
 x
 
 
 
 
 
PCR ITS 1 – DNA conc. 0,1 ng/µL
 
 
 
 
 
 
 x
 
 
 
 
 
PCR-RFLP ITS1
 
 
 
 
 
 
 
x 
 
 
 
 
PCR hsp70-234 conc. 1 ng/µL
 
 
 
 
 
 
 
 
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PCR hsp70-234 conc. 0,1 ng/µL
 
 
 
 
 
 
 
 
 x
 
 
 
PCR-RFLP hsp70-234
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Relatório final
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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