MIMCROBIOLOGIA- Aula caracterização dos microrganismos

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CARACTERIZAÇÃO 
DOS 
MICRORGANISMOS 
 
 
¤ Natureza (bactérias, fungos,algas e protozoários). 
 
¤ Estudo das propriedades - cultura pura, ou seja, uma cultura 
isenta de todos os demais tipos de organismos, onde todas as 
células na população sejam idênticas (originárias de uma 
mesma célula parenteral) 
Cultura mista 
 
 
¤ MEIOS DE CULTURAS 
¤ TIPO UTILIZADO DEPENDERÁ: 
¤ MATERIAL A SER ANALISADO 
¤ ESPÉCIE PESQUISADA 
¤ NECESSIDADES NUTRICIONAIS 
¤ MEIOS ESPECÍFICOS – COMPOSTOS QUÍMICOS 
 
 
¤ INÓCULO 
 
¤ INOCULAÇÃO – ESGOTAMENTO EM ESTRIAS 
 
¤ TÉCNICA SEMEADURA EM SUPERFÍCIE 
SPREAD PLATE 
 
 
¤ MÉTODO DE POUR-PLATE 
 
 
¤ INCUBAÇÃO – variação de aeração, 
temperatura... 
¤ COLÔNIAS –visível a olho nu, cada colônia 
é uma cultura pura com um ancestral único 
¤ Morfologicamente as colônias não são 
iguais para todas as espécies. 
 
 
¤ ISOLADO – MANUTENÇÃO DA CULTURA VIVA – ESTUDOS 
¤ curto prazo 
× repique contínuo 
¤ médio prazo 
× preservação em óleo mineral 
× preservação em água 
× congelamento a -20°C 
× secagem em sílica, solo e papel de filtro 
¤ longo-termo 
× liofilização 
× congelamento a -80°C 
× criopreservação em nitrogênio líquido 
Repique contínuo 
Preservação em óleo mineral 
Preservação em óleo 
armazenamento em geladeira 
vantagens 
- ↓ custo de equipamento 
- evita contaminação por ácaros 
 
desvantagens 
- necessidade de mais transferências 
 até que a cultura revigore 
- requer espaço para amazenamento 
 
Preservação em água (Castellani) 
Geladeira 
Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada 
Preservação em água 
vantagens 
- boa taxa de viabilidade 
- evita contaminação por ácaros 
 
desvantagens 
- limitado a organismos que 
 aderem ao ágar (Castellani) 
- dificuldade da retirada dos cubos 
 na reativação (Castellani) 
- crescimento durante a estocagem 
- requer espaço p/ amazenamento 
- riscos de contaminação 
 
 
Preservação em água 
armazenamento em geladeira 
Secagem em sílica e em solo 
Secagem em papel de filtro 
Liofilização 
3 mL 
Skim Milk 
Cultura pura 0,2 mL 
 na ampola 
Maçaric
o 
Liofilizador 
Maçaric
o 
Liofilização – congelamento a seco - as amostras são congeladas, desidratadas e 
fechadas à vácuo, o que possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos. Esta 
técnica permite a obtenção de uma coleção de microrganismos como referência, por 
exemplo. Para o isolamento dos microrganismos em laboratório deve ser observada 
a atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada célula microbiana em 
particular. 
300 nm a 1 µm 
Bactérias e Arqueas 
Fungos Protozoários Algas 
10 µm a 100 µm 
Pox vius Herpes vius 
27 nm a 300nm 
0,2 mm 
Bactérias e Arqueas 
Fungos Protozoários Algas 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
MICROSCÓPIO – SISTEMA DE LENTES E FONTE DE ILUMINAÇÃO 
 
Ampliação: jogo de lentes, campo magnético 
 
Resolução: depende do comprimento de onda utilizado para enxergar 
 
Há dois tipos: 
Óptico: 
Contraste de Fase, campo escuro, fluorescência 
Jogo de lentes (2000x) 
Luz visível (400-700nm) 
 
Eletrônico: 
Transmissão, varredura 
Campo magnético (até 100 000 x) 
Feixe de elétrons 
 
 
 
Decímetro 
(dm) 
 
Centímetro 
(cm) 
 
Milímetro 
(mm) 
 
Micrômetro 
(µm) 
 
Nanômetro 
(nm) 
 
Angstrom 
(Å) 
 
Metro 
(m) 
10 
(10-1m) 
100 
(10-2m) 
1000 
(10-3m) 
1.000.000 
 (10-6m) 
1.000.000.
000 (10-
9m) 
10.000.000.
000 
(10-10m) 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
 
 
 
Θ Lentes para direcionar o caminho que o feixe de luz percorre 
entre o objeto a ser estudado e o olho. COMPONENTES 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
 
 
 
Θ PARTES INTEGRANTES DE UM MICROSCÓPIO 
 
Θ PARTE MECÂNICA 
 
 
 
 
Θ SISTEMA ÓPTICO: 
 
Θ SISTEMA ÓPTICO DE OBSERVAÇÃO 
Θ SISTEMA ÓPTICO DE ILUMINAÇÃO 
Θ OBJETIVAS: 
 
Θ BAIXO PODER 
Θ ALTO PODER 
Θ IMERSÃO 
DESIGNAÇÃO 
DA OBJETIVA 
AMPLIAÇÃO DA 
OBJETIVA 
AMPLIAÇÃO DA 
OCULAR 
AMPLIAÇÃO 
TOTAL 
BAIXO PODER 05; 10; 20 10 100 
ALTO PODER (A 
SECO) 
40 10 400 
IMERSÃO 100 10 1000 
 O óleo ajuda a manter os raios juntos (índice de refração do óleo e 
do vidro são iguais). Se não for usado óleo de imersão com uma 
lente objetiva de imersão, a imagem torna-se borrada e com baixa 
resolução. 
PODER DE RESOLUÇÃO – HABILIDADE DE DISTINGUIR IMGENS 
DE DOIS OBJETOS MUITO PRÓXIMOS, MAS SEPARADOS COMO 
ENTIDADES DIFERENTES – APROX. 0,25um 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
 
 
 
Θ Características morfológicas grosseiras de bactérias, 
leveduras, bolores, algas e protozoários; 
 
Θ Utilização de corantes 
 
Θ Espécies coradas ou descoradas; 
 
Θ Bactérias coradas aparecem com a cor do corante. 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
 
 
 
Θ Condensador especial com disco opaco que elimina a luz 
no centro da objetiva. 
 
Θ A luz atinge a amostra em ângulo. 
 
Θ Luz refletida pela amostra entra na objetiva e o objeto 
aparece iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. 
 
Θ Utilizada na observação de microrganismos vivos, não 
corados, ou que não se coram facilmente, suspensos em 
líquidos, preparações a fresco. 
 
Θ Treponema pallidum → Sífilis 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
 
 
 
Θ Detalhes de células vivas não são detectados no microscópio de 
campo luminoso → estruturas celulares transparentes e 
incolores não apresentam contraste suficiente. 
 
Θ Sistema óptico especial que torna possível a distinção de 
materiais biológicos que diferem ligeiramente no que se refere 
aos seus índices de refração. 
 
Θ Materiais mais densos aparecem 
claros enquanto partes das 
células que têm densidade 
próxima da água (por exemplo, o citoplasma) aparecem 
escuras. 
 
 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
 
 
 
Θ Utiliza condensador especial com diafragma anular 
 
Θ Há 2 conjuntos de raios: os refletidos pela amostra e os 
inalterados que se combinam para a formação da imagem. 
 
Θ Usa uma placa de difração 
 
Θ Observar células e tecidos vivos 
 
Θ Ver detalhadamente as estruturas internas 
 
Θ Estudo da mitose em células cultivadas in vitro. 
 
Θ Vantagem: capacidade de mostrar a estrutura celular 
sem utilizar corantes e matar o organismo. 
CAMPO BRILHANTE CAMPO ESCURO CONTRASTE DE FASE 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades¤ Zn 
 
 
 
Θ Técnica usada em hospitais e laboratórios clínicos, pois 
podem ser adaptadas a testes rápidos que identificam os 
microrganismos patogênicos, 
 
Θ Fluorescência → algumas substâncias após serem excitadas 
com radiação de baixo comprimento de onda (ultravioleta), 
emitem radiação de maior comprimento de 
 onda. 
 
Θ Absorvem a energia da radiação 
ultravioleta emitindo radiação dentro do 
espectro de luz visível. 
 
¤ Os 4 elementos mais abundantes na composição dos 
organismos são: H, C, N, O 
 
¤ S, P, Na, Mg, Cl, K, Fe, Ca: elementos essenciais 
em pequenas quantidades 
 
¤ Zn 
 
 
 
Θ Microrganismos corados por um corante fluorescente 
aparecem como objetos luminosos quando observados com 
luz ultravioleta. 
 
Θ Microrganismos com fluorocromos (corantes fluorescentes) 
são examinados com microscópio de fluorescência, com uma 
fonte de luz ultravioleta, aparecem luminosos, brilhantes 
contra um fundo escuro. 
 
Θ Flurocromos X anticorpos. 
 
Obs.: (a) um tipo de fluorocromo é 
combinado a anticorpos contra um tipo 
específico de bactéria. Quando a 
preparação é adicionada às células 
bacterianas e uma lâmina, os anticorpos 
fixam-se às células bacterianas, e as 
células fluorescem quando iluminadas 
com luz ultravioleta. (b) no teste a 
absorção de anticorpo treponêmico 
fluorescente (FTA-ABS) para a sífilis 
mostrado aqui, o Treponema pallidum é 
evidenciado com células brilhantes 
contra o fundo escuro 
 
 
 
 
Θ Controlado por um sistema de campo magnético. 
 
Θ Visualização de vírus e estruturas diminutas 
 
 
 
Θ Os principais tipos são: Microscopia eletrônica de 
transmissão (TEM); Microscopia eletrônica de varredura 
(MEV) 
 
 
 
 
 
Θ Cortes ultra-finos, são colocados sobre uma pequena tela 
metálica 
 
Θ Imagem final → modificações que os elétrons experimentam 
ao atravessar esses cortes, isto é, a dispersão que sofrem. 
 
Θ A dispersão dos elétrons ocorre em função da espessura e 
da densidade molecular do objeto e depende, em especial, do 
número atômico dos átomos que entram na sua composição. 
Quanto maior for o número atômico, maior é a dispersão. 
 
 
 
 
 
Θ Grande parte dos átomos que constituem as estruturas 
biológicas têm número atômico baixo e contribuem pouco 
para a formação da imagem, adicionam-se átomos pesados à 
estrutura molecular, para aumentar o contraste. 
 
Θ Como o olho humano não é sensível aos elétrons, a imagem é 
registrada em placa fotográfica. 
 
 
 
 
 
Θ Semelhante ao microscópio óptico → imagem bidimensional 
Θ Coluna do microscópio eletrônico → alto vácuo para impedir 
a colisão dos elétrons com os átomos do ar. 
Θ Aumentos de 10.000 a 100.000 X 
 
 
 
 
Θ Feixe de elétrons extremamente fino é utilizado para varrer 
o objeto. Resultam daí vários efeitos, nomeadamente a 
emissão de elétrons secundários, isto é, elétrons livres do 
objeto são ejetados em consequência do impacto dos 
elétrons do feixe. 
Θ Elétrons secundários emitidos pelo objeto são recolhidos 
por um tubo fotomultiplicador e a imagem é formada numa 
tela ou chapa fotográfica. 
 
 
 
 
 
Θ Feixe de elétrons extremamente fino é utilizado para varrer 
o objeto. Resultam daí vários efeitos, nomeadamente a 
emissão de elétrons secundários, isto é, elétrons livres do 
objeto são ejetados em consequência do impacto dos 
elétrons do feixe. 
Θ Elétrons secundários emitidos pelo objeto são recolhidos 
por um tubo fotomultiplicador e a imagem é formada numa 
tela ou chapa fotográfica. 
 
 
 
 
 
Estudo de superfícies intactas ou vírus; 
 
Θ Supera o óptico na questão do corte; 
 
Θ No MEV pode ser ampliado de 1.000 a 10.000 X 
 
Θ Estudar a topografia da superfície de objetos sólidos e 
obter imagens tridimensionais 
TRANSMISSÃO VARREDURA 
Θ Esfregaço 
Θ Fixação 
Θ Coloração 
Θ Corantes ácidos X corantes básicos 
PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA 
MICROSCOPIA ÓPTICA 
Esfregaço 
PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA 
MICROSCOPIA ÓPTICA 
fixação por calor 
 
PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 
PARA MICROSCOPIA ÓPTICA 
COLORAÇÃO 
 
PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA 
• Significa corar os microrganismos com um corante que enfatize 
certas estruturas. 
 
• Corantes – sais compostos por íons positivos e íon negativo; 
 
• Corante básicos – íon positivo; corantes ácidos – íon negativo 
 
• Bactérias – levemente carregadas negativamente – corante 
básico se adere a sua célula; 
 
• Corantes básicos – cristal violeta, o azul de metileno, o verde 
malaquita e a safarina 
 
• Corantes ácidos (eosina, fucsina) – cora o fundo – coloração 
negativa. 
Coloração 
• Preparações a fresco 
– motilidade bacteriana 
• Preparações coradas 
– Simples 
• Coloração com único corante 
– Diferenciais 
• Coloração de Gram 
 
Visualização Bacteriana 
Preparações coradas 
• Coloração simples 
positiva : usa um 
único corante 
• Princípio:baseado na 
utilização de corantes 
carregados + que se 
ligam às cargas 
negativas da 
superfície da célula 
• Azul de metileno, 
cristal violeta 
• São empregados dois corantes 
contrastantes que vão gerar colorações 
diferentes em grupos distintos de 
bactérias. 
– Separar diferentes grupos de bactérias 
– Visualização de estruturas de algumas 
bactérias : flagelos 
– Visualização de esporos 
COLORAÇÃO DIFERENCIAL 
• método utilizado para a 
visualização microscópica de 
bactérias a partir de diferentes 
materiais. 
 
 
• 1878, Hans Christian Joachim Gram 
 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
• Cobrir o esfregaço com violeta de 
genciana 
Lavar com água 
• Cobrir o esfregaço com iodo (mordente – 
intensifica a coloração) 
Lavar com água 
• Cobrir com álcool – tempo rápido 
Lavar com água 
• Cobrir o esfregaço com safranina 
Lavar com água 
COLORAÇÃO DE GRAM 
ETAPAS 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
ETAPAS 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
 
• GRAM positivas • GRAM negativas 
Bactéria Gram-positiva 
Bactéria Gram-negativa 
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	TÉCNICAS DE CULTURA PURA
	ISOLAMENTO E CULTIVO DE CULTURAS PURAS
	ISOLAMENTO E CULTIVO DE CULTURAS PURAS
	ISOLAMENTO E CULTIVO DE CULTURAS PURAS
	ISOLAMENTO E CULTIVO DE CULTURAS PURAS
	CONSERVAÇÃO DAS CULTURAS PURAS
	Repique contínuo
	Preservação em óleo mineral
	Preservação em água (Castellani)
	Preservação em água
	Secagem em sílica e em solo
	Secagem em papel de filtro
	Liofilização
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	Slide Number 16
	MICROSCOPIA 
	MICROSCOPIA LUMINOSA OU ÓPTICA 
	MICROSCOPIA LUMINOSA OU ÓPTICA 
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	Slide Number 21
	Slide Number 22
	Slide Number 23
	Slide Number 24
	Slide Number 25
	MICROSCOPIA de campo claro
	MICROSCOPIA de campo escuro 
	MICROSCOPIA de CONTRASTE DE FASE
	MICROSCOPIA de CONTRASTE DE FASE
	Slide Number 30
	MICROSCOPIA de FLUORESCÊNCIA
	MICROSCOPIA de FLUORESCÊNCIA
	Slide Number 33
	Slide Number 34
	Slide Number 35
	Slide Number 36
	Slide Number 37
	Slide Number 38
	Slide Number 39
	Slide Number 40
	Slide Number 41
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	Slide Number 43
	Slide Number 44
	Slide Number 45
	Coloração
	Visualização Bacteriana
	Preparações coradas
	COLORAÇÃO DIFERENCIAL
	COLORAÇÃO DE GRAM
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	COLORAÇÃO DE GRAM�ETAPAS�
	COLORAÇÃO DE GRAM�ETAPAS�
	COLORAÇÃO DE GRAM��
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