Aula prática -Desenho de Primers

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AULA PRÁTICA: DESENHO DE PRIMERS 
 
 
Introdução: 
 
 Durante a replicação, a enzima DNA polimerase necessita de uma extremidade 3´- OH 
livre para poder adicionar os nucleotídeos e, consequentemente, formar a fita-filha. Por isso, 
nos mecanismos de duplicação do DNA in vivo, a ação da RNA primase é fundamental, pois, 
ao sintetizar um curto segmento de RNA, este é capaz de fornecer tal condição química. Já 
nos processos que ocorrem in vitro, estes componentes são substituídos por segmentos curtos 
de DNA (oligonucleotídeo), conhecidos por primers ou iniciadores, os quais flanqueiam a 
região do DNA a ser amplificada. 
 PCRs específicas empregam um par de primers, conhecidos como forward (amplifica 
fragmentos na mesma direção da transcrição) e reverse (amplifica fragmentos na direção 
inversa a transcrição). Atualmente, estão disponíveis diversos softwares para o desenho de 
primers. Contudo, certas recomendações devem ser seguidas e a análise visual detalhada é 
primordial para a escolha do par correto. 
 Abaixo são listadas algumas regras essenciais para o desenho de primers: 
 
1) Presença de uma extremidade –OH livre no carbono 3’. 
2) Conteúdo GC bem distribuído em todo o primer (35% a 60%). 
3) Complementaridade com a fita molde (é tolerável algum mau-pareamento ou 
mismatch, exceto na extremidade 3’). 
4) Temperatura de pareamento (52 a 58ºC, e não passar a diferença de 5ºC entre eles). 
5) Tamanho do primer (10 a 30 nt). 
6) Distância máxima e mínima entre os primers (20 pb a 20 Kb; média: 100 pb e 5 Kb). 
7) Concentração iônica ideal da solução (50 mM de MgCl2). 
8) Evitar self-anealing (auto-pareamento) e dimers (dímeros). 
 
 
 
Procedimentos: 
 
1) Vá ao site do NCBI (< http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ >), procure a sequência 
AY649326.1 e faça o download do arquivo em formato FASTA (Send > File > 
FASTA > Create File). 
2) Na coluna à direita, clique em Pick Primers. 
Em Primer Parameters, altere PCR product size (300-500 pb). Em Primer melting 
temperatures (Tm), altere para 55ºC (min), 57ºC (médio) e 60ºC (máx). 5 ºC de 
diferença entre eles. 
Em Primer Pair Specificity Checking Parameters, altere Database para “nr”. 
Clique em Get primers. 
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA 
ÁREA DE GENÉTICA 
3) Cheque seus resultados e eleja a melhor opção, justificando. 
4) Desenhe novos primers alterando os parâmetros. 
 
Exercícios: 
 
1) A qual organismo pertence a sequência trabalhada? A que tipo de produto ela 
corresponde? 
2) Quem seria melhor: um primer com tamanho igual a 15 ou 23 b (considere condições 
ideais iguais para os demais parâmetros)? Justifique. 
3) Por que a temperatura de pareamento não deve estar acima nem abaixo do intervalo 
entre 52ºC e 58ºC?