Tecnologia do DNA recombinante BMAF 2013.2

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Tecnologia do DNA Tecnologia do DNA 
Recombinante Recombinante 
Profa. Dra. Nádia Accioly P. Nogueira
Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos – BioMol Lab
CURSO DE FARMÁCIA 
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A FARMÁCIA
O que O que éé Engenharia GenEngenharia Genéética?tica?
�� Termo usado para descrever algumas Termo usado para descrever algumas 
ttéécnicas modernas em biologia molecular cnicas modernas em biologia molecular 
que vêm revolucionado o antigo processo da que vêm revolucionado o antigo processo da 
biotecnologia, apresentado novas biotecnologia, apresentado novas 
possibilidades, principalmente em npossibilidades, principalmente em níível vel 
industrial. industrial. 
O que O que éé biotecnologia?biotecnologia?
�� Tecnologia que envolve a manipulaTecnologia que envolve a manipulaçção do ão do 
processo biolprocesso biolóógico natural de gico natural de 
microrganismos, plantas e animais. microrganismos, plantas e animais. 
A biotecnologia A biotecnologia éé utilizada pelo utilizada pelo 
homem hhomem háá centenas de anoscentenas de anos
�� Processos de fabricaProcessos de fabricaçção ão 
–– Pão Pão 
–– Cerveja Cerveja 
–– Queijo Queijo 
�� Melhoramento Melhoramento 
–– VegetalVegetal
–– AnimalAnimal
Tecnologia do DNA RecombinanteTecnologia do DNA Recombinante
�� Conjunto de tConjunto de téécnicas que permite identificar, cnicas que permite identificar, 
isolar e multiplicar genes de quaisquer isolar e multiplicar genes de quaisquer 
organismosorganismos
DNA RecombinanteDNA Recombinante
�� MolMoléécula hcula hííbrida obtida pela união de DNA brida obtida pela união de DNA 
de fontes biologicamente diferentesde fontes biologicamente diferentes
–– DNA de dois, ou mais, organismos diferentesDNA de dois, ou mais, organismos diferentes
–– PedaPedaçço(s) de DNA de organismo(s) ligado(s) a o(s) de DNA de organismo(s) ligado(s) a 
DNA sintDNA sintééticotico
DNA manipulado experimentalmente no laboratório com enzimas de 
restrição e ligase, de modo a conter genes novos ou modificados 
(Malacinski, 2005. Fundamentos da Biologia Molecular)
AplicaAplicaçções da tecnologia do DNA ões da tecnologia do DNA 
recombinanterecombinante
�� DiagnDiagnóóstico de doenstico de doençças genas genééticas e ticas e 
infecciosas infecciosas 
�� Terapia gênicaTerapia gênica
�� Estudo dos genesEstudo dos genes
–– Estrutura Estrutura 
–– Mecanismos de replicaMecanismos de replicaçção e expressãoão e expressão
–– DeterminaDeterminaçção da seqão da seqüüência de um gene e da ência de um gene e da 
proteproteíína que ele codificana que ele codifica
AplicaAplicaçções da tecnologia do DNA ões da tecnologia do DNA 
recombinanterecombinante
�� Melhoramento animal e vegetalMelhoramento animal e vegetal
�� CriaCriaçção de modelos animaisão de modelos animais
�� Desenvolvimento de culturas microbianas Desenvolvimento de culturas microbianas 
capazes de produzir substâncias capazes de produzir substâncias úúteis teis 
–– Insulina humanaInsulina humana
–– Hormônio de crescimentoHormônio de crescimento
–– Vacinas Vacinas 
–– Enzimas industriaisEnzimas industriais AplicaAplicaçção comercial ou ão comercial ou 
biotecnolbiotecnolóógica parece ter um gica parece ter um 
potencial inesgotpotencial inesgotáávelvel
Como obter um DNA Como obter um DNA 
recombinanterecombinante
Ciência Hoje 203, abril 2004
�� CortarCortar
–– Enzimas de restriEnzimas de restriççãoão
�� Colar Colar 
–– DNA DNA ligaseligase
ConstruConstruçção de uma ão de uma 
molmoléécula de DNA cula de DNA 
recombinanterecombinante
-- ObtenObtençção do gene de interesseão do gene de interesse
-- AdiAdiçção do promotor e ão do promotor e terminador terminador 
(para expressão)(para expressão)
-- Se necessSe necessáário, adirio, adiçção de um ão de um 
gene seletivo gene seletivo (selecionar)(selecionar)
-- InserInserçção em ão em plasmplasmíídeodeo para para 
transformatransformaçção ão bacterianabacteriana
cienciahoje.uol.com.br/852
Enzimas de RestriEnzimas de Restriççãoão
�� Enzimas que reconhecem e clivam uma Enzimas que reconhecem e clivam uma 
seqseqüüência especência especíífica do DNA de fita dupla, fica do DNA de fita dupla, 
gerando extremidades gerando extremidades coezivascoezivas ((stickysticky endsends) ) 
ou abruptas (ou abruptas (bluntblunt endsends))
�� A base da tecnologia do DNA recombinante A base da tecnologia do DNA recombinante 
éé a utilizaa utilizaçção de enzimas de restrião de enzimas de restriçção ão 
Enzimas de RestriEnzimas de Restriççãoão
CLIVAGEM NO EIXO DE SIMETRIA
MOLÉCULAS COM EXTREMIDADES ABRUPTAS
...TC GA...
...AG CT...
3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’
+
MOLÉCULAS COM EXTREMIDADES COESIVAS
CLIVAGEM SIMÉTRICAMENTE AO
REDOR DO EIXO DE SIMETRIA
...GAA TTC...
...CTT AAG...
+
3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’
Enzimas de RestriEnzimas de Restriççãoão
1953: Foi constatada que a eficiência na replicação de um bacteriófago 
dependia da célula hospedeira na qual ele estava inserido
A inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas cepas bacterianas 
↔ nucleases altamente específicas que clivavam o DNA do fago
Sistema de defesa bacteriano que degrada DNA estranho → RESTRIÇÃO
Sistema de proteção bacteriano do seu DNA → MODIFICAÇÃO
FENÔMENO DA RESTRIÇÃO / MODIFICAÇÃO
RestriRestriçção/Modificaão/Modificaççãoão
Clonagem molecular 
� Isolamento e propagação de moléculas 
idênticas de DNA em um organismo
O que O que éé um vetor de clonagem?um vetor de clonagem?
�� Elemento genElemento genéético no qual os genes podem tico no qual os genes podem 
ser inseridos e replicadosser inseridos e replicados
Vetores utilizados em Engenharia Vetores utilizados em Engenharia 
GenGenééticatica
�� PlamPlamíídeosdeos
�� BacteriBacterióófagosfagos
�� CosmCosmíídiosdios
�� Cromossomos artificiaisCromossomos artificiais
�� LipossomosLipossomos
Plasmídeos bacterianos 
� Multiplicam-se em 
bactérias 
� Limitação: tamanho 
máximo do inserto ∼
10Kb
� Seleção por antibióticos 
e/ou substratos 
cromogênicos
www.libertaria.pro.br/tdna_recombinante_intro.htm
BacteriBacterióófagosfagos
� Replica-se em bactéria 
� Insertos utilizados para clonagem de até ∼
25Kb
� Fago sem o inserto não empacotam na 
moléculas virais
Cosmídeos
� Plasmídeos modificados
� Aceitam insertos de 33 a ∼ 47Kb
Mapa genMapa genéético do pBR322tico do pBR322
Madigan et al. 1997
O pBR322 O pBR322 éé construconstruíído a partir de do a partir de 
fragmentos de três fragmentos de três plasmplasmíídeosdeos
naturaisnaturais
FonteFonte DNADNA
PlasmPlasmíídeodeo R1R1 ampampRR
PlasmPlasmíídeodeo R6R6--55 tettetRR
PlasmPlasmíídeodeo pMB1 (pMB1 (≅≅ pColE1)pColE1) Origem de replicaOrigem de replicaççãoão
Um vetor plasmidial típico:
pBluescript
Marcadores selecionáveis 
� Antibióticos
� Marcas auxotróficas 
Onde estão os clones de Onde estão os clones de E. E. colicoli
contendo pBR322 recombinantes?contendo pBR322 recombinantes?
Madigan et al 1997
Inativação por 
inserção
pBR322 
recombinante
pUCpUC: : plasmplasmíídeosdeos de selede seleçção ão LacLac
pBR322
Madigan et al. 1997www.bi.umist.ac.uk/.../ mjfssps/2GEN/Overview.htm
polylinkerpolylinker
Marcador de Marcador de 
seleseleççãoão
Origem de Origem de 
replicareplicaççãoão
lacZlacZ’’
pBR322
Selecionando clones contendo Selecionando clones contendo pUCpUC
recombinanterecombinante
Vetores Vetores CosmCosmíídiosdios
Lipossomos
�� Esferas de membrana sintEsferas de membrana sintéética formadas por tica formadas por 
camadas camadas bilipbilipíídicasdicas preenchidas com DNA preenchidas com DNA 
–– Nunca causam doenNunca causam doenççaa
–– Pouca eficiênciaPouca eficiência 
www.libertaria.pro.br/tdna_recombinante_intro.htm
Vetores que mimetizam um Vetores que mimetizam um 
cromossomocromossomo
�� Cromossomos artificiais para clonagem de Cromossomos artificiais para clonagem de 
grandes pedagrandes pedaçços de DNAos de DNA
–– YACYAC ((yeastyeast artificial artificial chromosomechromosome) ) -- LeveduraLevedura
–– BACBAC ((bacteriabacteria artificial artificial chromosomechromosome) ) -- BactBactéériaria
Componentes fundamentais de Componentes fundamentais de 
vetores que mimetizam um vetores que mimetizam um 
cromossomocromossomo
�� 1 Centrômero1 Centrômero
�� 2 2 TelômerosTelômeros
�� 1 Origem de replica1 Origem de replicaççãoão
YACsYACs –– Cromossomos Artificiais de Cromossomos Artificiais de 
LevedurasLeveduras
EstratEstratéégia de clonagem com pYAC3gia de clonagem com pYAC3
Sítio da SnaBI1
1
1
2
1
Remoção do fragmento BamHI
3 Os dois braços TEL
4
Restrição com 
BamHI + SnaBI
Inserto DNA
Como podem ser obtidos genes de Como podem ser obtidos genes de 
interesse para clonagem molecular?interesse para clonagem molecular?
www.cib.org.br/glossario.php?letra=C
Como podem ser obtidos genes de Como podem ser obtidos genes de 
interesse para clonagem molecular?interesse para clonagem molecular?
�� CriaCriaççãoão de uma de uma bibliotecabiblioteca de genes de genes 
–– SSííntese do ntese do cDNAcDNA
–– SSííntese do genentese do gene
–– DNA obtido por PCRDNA obtido por PCR
Biblioteca de genesBiblioteca de genes
�� ColeColeçção de um grande ão de um grande 
nnúúmero de fragmentos de mero de fragmentos de 
DNA do genomaDNA do genoma
�� Cada fragmento, contendo Cada fragmento, contendo 
apenas um gene apenas um gene éé inserido inserido 
em um vetorem um vetor
www.libertaria.pro.br/tdna_recombinante_intro.htm
SSííntese do gene atravntese do gene atravéés do RNA s do RNA 
mensageiromensageiro
�� RNA mensageiro disponRNA mensageiro disponíívelvel
�� TranscriptaseTranscriptase reversareversa
–– ProduProduçção de DNA a partir do RNAão de DNA a partir do RNA
–– DNA produzido = DNA produzido = cDNAcDNA ou DNA complementarou DNA complementar
SSííntese do gene por adintese do gene por adiçção de ão de 
nucleotnucleotíídeosdeos
�� SSííntese de genes que codificam ntese de genes que codificam 
polipeptpolipeptíídios ou protedios ou proteíínas de pequeno nas de pequeno 
tamanhotamanho
Ligando fragmentos (Ligando fragmentos (insertosinsertos) de ) de 
DNA ao vetorDNA ao vetor
Tamanho mTamanho mááximo o fragmento de ximo o fragmento de 
DNA a ser clonadoDNA a ser clonado
Tipo de vetorTipo de vetor Tamanho do inserto (Kb)Tamanho do inserto (Kb)
PlasmPlasmíídeodeo 2020
Fago Fago λλ 2525
CosmCosmíídeodeo 4545
Fago P1Fago P1 100100
BACBAC 300300
YACYAC 10001000
InserInserçção do vetor com o inserto ão do vetor com o inserto 
em bactem bactéériasrias
�� Contato Contato plasmplasmíídeodeo -- bactbactéériaria
–– Poucas bactPoucas bactéérias transformadasrias transformadas
�� SeleSeleçção das cão das céélulas lulas 
bacterianas com bacterianas com plasmplasmíídeodeo
–– Resistência ao antibiResistência ao antibióóticotico
�� BactBactéérias sem o rias sem o plasmplasmíídeodeo
morremmorrem
�� BactBactéérias com rias com plasmplasmíídeodeo se se 
reproduzem reproduzem 
Clones resultantes 
possuem o 
plasmídeo com o 
gene novo
Introduzindo o Introduzindo o DNA DNA recrec no no 
hospedeirohospedeiro
Detectando e purificando os clones.Detectando e purificando os clones.
Produzindo um grande nProduzindo um grande núúmero mero ccéélulas lulas 
recombinantes.recombinantes.
Clonagem Clonagem 
molecular ou molecular ou 
Clonagem gênicaClonagem gênica
www.libertaria.pro.br/tdna_recombinante_intro.htm
Expressão de genes clonados em Expressão de genes clonados em 
bactbactéériasrias
�� BactBactéérias portadoras do gene de interesserias portadoras do gene de interesse
–– Verdadeiras fVerdadeiras fáábricas de quantidades ilimitadas de bricas de quantidades ilimitadas de 
proteproteíínas que o gene codificanas que o gene codifica
�� 11ªª ssííntese de uma protentese de uma proteíína humana por uma na humana por uma 
bactbactééria transformadaria transformada
–– 1977: 1977: somatotrofinasomatotrofina (hormônio de crescimento)(hormônio de crescimento)
Controle de expressão do sistema Controle de expressão do sistema pETpET
cienciahoje.uol.com.br/852