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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA CAMPUS DE VIDEIRA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL Sabrina Pinto Salamoni Controle higiênico-sanitário da água Diversos microrganismos patogênicos veiculados pela água Bactérias Protozoários Helmintos Vírus O monitoramento de TODOS os microrganismos patogênicos é difícil, oneroso FEZES HUMANAS Água de drenagem Esgotos Fossas Oceanos e estuários Rios e Lagos Água Subterrânea Fertilização e irrigação Moluscos Águas recreacionais Suprimento de água potável Produtos agrícolas Aerossóis HOMEM Principais vias de transmissão de patógenos Microrganismo Significância Sanitária Persistência na água Ressitência ao cloro Dose infecciosa relativa Reservatório Animal Campylobacter jejuni, C. coli Elevada Moderada Baixa Moderada Sim Escherichia coli patogênica Elevada Moderada Baixa Moderada Sim Salmonella typhi Elevada Moderada Baixa Elevada Não Outras Salmonella Elevada Prolongada Baixa Elevada Sim Shigella spp. Elevada Curta Baixa Moderada Não Vibrio cholerae Elevada Curta Baixa Elevada Não Pseudmonas aeruginosa Moderada Pode multiplicar-se Moderada Elevada (?) Não Aeromonas spp. Moderada Pode mutiplicar-se Baixa Elevada (?) Não Adenovírus Elevada ? Moderada Baixa Não Enterovírus Elevada Prolongada Moderada Baixa Não Hepatite A Elevada ? Moderada Baixa Não Hepatite E, vírus da hepatite não A, não B, entericamente transmitidos Elevada ? ? Baixa Não Vírus Norwalk Elevada ? ? Baixa Não Pequenos vírus circulantes Moderada ? ? Baixa Não Entamoeba histolytica Elevada Moderada Elevada Baixa Não Cryptosporidium parvum Elevada Prolongada Elevada Baixa Sim Giardia intestinalis Elevada Moderada Elevada Baixa Sim Persistência- Curta até uma semana, moderada de uma semana ate um mês, prolongada, acima de um mês. Normalmente doenças de veiculação hídrica causam problemas no aparelho intestinal do homem Podem ser causadas por: ◦ Bactérias ◦ Fungos ◦ Vírus ◦ Protozoários ◦ Helmintos Dificuldades em detectar os agentes patogênicos diretamente nas amostras Baixas concentrações – necessidade de grandes volumes Em uma população apenas uma pequena faixa apresenta doenças de veiculação hídrica Nas fezes destes habitantes a presença de patogênicos pode não ocorrer em elevada proporção Grande diluição do despejo contaminado NECESSIDADE DE INDICADORES O que é um microrganismo indicador? Qual o indicador ideal ? Organismos indicadores de contaminação fecal Seres vivos que quando presentes na água ou outro material, indicam a presença de resíduos fecais Esses organismos não são patogênicos Indicam uma POTENCIALIDADE DE PRESENÇA DE PATÓGENOS Critérios para definição de um microrganismo ou grupo de microrganismos como indicadores (OMS, 2006) Devem estar ausentes em ambientes não poluídos e presentes quando a fonte de microrganismos de interesse estiver presente Devem estar presentes em número elevado com relação ao patogênicos Devem ser incapazes de multiplicar-se no ambiente aquático ou multiplicar-se menos que as bactérias entéricas Deve reagir de maneira semelhante aos patógenos no ambiente Deve ser de rápida e fácil detecção (isolamento, identificação e enumeração) Os testes de indicadores devem ser acesdsíveis ALGUNS INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO FECAL Coliformes Totais Coliformes Termotolerantes Escherichia coli Clostrídios sulfito-redutores – Clostridium perfringens Enterococcus Bifidobacterium Colifágos – E. coli, Bacterióides Aeróbias Média UFC g Amostras Enterococcus 2X 107 30 Staphylococcus 8X 106 15 Bacillus 3X 104 28 Anaeróbias Bacterióides 1X 1010 30 Lactobacillus 1X 109 30 Clostridium 4X 106 23 E.coli 4X 108 30 Klebsiella 5X 104 14 Enterobacter 1X 105 9 Citrobacter 1X 108 20 BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS TOTAIS COLIFORMES TOTAIS Família Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de ácido, gás e aldeído, quando incubadas a 35-37ºC, por 24-48 horas. São Gram negativas, oxidase negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares ou agentes tensoativos (como lauril sulfato de sódio) e não formadoras de esporos. Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella → presentes nas fezes, vegetais e solo. Presença não indica necessariamente contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos. Também presentes em solos, plantas e quaisquer efluentes contendo matéria orgânica Coliformes totais: todas as bactérias que possuem a enzima β-galactosidase Algumas bactérias β-galactosidase positivas não são capazes de fermentar a lactose A existência de bactérias não-fecais e lactose negativas nesse grupo limita sua aplicação Sua presença em águas tratadas indica tratamento inadequado mas não necessariamente contaminação fecal Coliformes termotolerantes e Escherichia coli Correspondem aos coliformes totais que continuam fermentando lactose com produção de ácido/gás, quando incubadas à temperatura de 44,5ºC Ao redor de 90% das culturas de E. coli são positivas nessas condições O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminação de origem fecal presente em água foi proposto em 1892 Indicador ideal: –Ter como habitat exclusivo o trato intestinal de homens e outros animais –Ocorrer em números muito altos nas fezes –Apresentar alta resistência ao ambiente extraenteral –Existir técnicas rápidas, simples e precisas para sua detecção e/ou contagem Confirmação para E. coli – provas bioquímicas positivas para indol, β-glicuronidase e ausência de urease – Podem ser utilizados meios quimicamente definidos, contendo substratos para detecção de uma enzima a β- glicuronidase Enterococcus Várias espécies ou variedades. Habitam o intestino de seres humanos e outros animais. E. faecalis, E. faecium, E. durans e E. hirae Gram positivos, resistentes a cloreto de sódio e pH alcalino Sobrevivem mais que E. coli em ambientes aquáticos (maior resistência a dessecação e a cloração) TÉCNICAS PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO TUBOS MÚLTIPLOS NMP MEMBRANA FILTRANTE SUBSTRATO CROMOGÊNICO NMP MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL – NMP Técnica estatística Volumes da amostra original em geral 10 mL, 1mL e 0,1 mL ou volumes correspondentes às suas diluições decimais Após incubação (24-48 horas a 37 ºC), conta-se os tubos onde é observado o crescimento Com o número obtido pela combinação dos tubos positivos de cada série pode-se determinar o NMP da amostra a partir de consultas em tabelas específicas Bactérias presentes em uma amostra podem sem separadas uniformemente Inoculação de volume decrescentes da amostra em meio de cultura – fator 10 de diluição Cada volume é inoculado em uma série de tubos Combinação resultados positivos e negativos – estimativa da densidade original das bactérias – cálculos de probabilidadeTUBOS MÚLTIPLOS (SÉRIE DE TRÊS OU CINCO) PRESUNTIVO CONFIRMATIVO COMPLETO PRESUNTIVO Semeaduras de volumes determinados em séries de tubos de CALDO LACTOSADO Incubação a 35oC ± 0,5oC Após 24-48h enriquecimento de organismos fermentadores de lactose Prova presuntiva positiva = Acidificação e produção de gás Caldo lactosado CONFIRMATIVO Transferência de cada cultura com teste presuntivo positivo para VERDE BRILHANTE E BILE A 2% (CLVB) Incubação a 35oC ± 0,5oC Após 48h enriquecimento de organismos fermentadores de lactose Prova confirmativa positiva = Acidificação do meio com produção de gás Esta etapa reduz a possibilidade de falso positivo decorrente da atividade de bactérias Gram + fermentadoras de lactose Teste confirmativo coliformes totais Coliformes Termotolerantes Transferência de cada cultura com resultado presuntivo positivo para tubos contendo meio EC Incubação a 44,5oC ± 0,2oC durante 24 ± 2h Resultado positivo = produção de gás Ágar eosina metileno Transferência de cada cultura com resultado presuntivo positivo para tubos contendo meio EC-MUG Incubação a 44,5oC ± 0,2oC durante 24 ± 2h Resultado positivo = fluorescência causada pela hidrólise do substrato metil-umbeliferil-β-D-glicuronídeo24 Teste confirmativo coliformes totais Teste presuntivo Teste confirmativo – coliformes fecais Filtração, sob vácuo, de um volume adequado da água a analisar através de uma membrana filtrante (com porosidade controlada de 0,22/45 μm), onde ficarão retidas células de possíveis bactérias contaminantes; SUBSTRATO CROMOGÊNICO/FLOOROGENICO Baseado na ativação de enzimas presente nas bactérias por meio de substratos específicos A enzima utilizada pelos coliformes totais é a ß– galactosidase e o indicador é o ONPG que confere cor amarelada. E. coli utiliza ß–glucuronidase, metaboliza o indicador Metil-Umbeliferone Galactopiranosídeo (MUG) Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose (glicopiranosídeos) Específicos para Escherichia coli. • Exemplos: ONPG (Orto Nitrofenil galactopiranosídeo) MUG (Metil-Umbeliferone Galactopiranosídeo) Ferramenta poderosa para identificação de Escherichia coli (teste confirmativo) Mistura o reagente com a amostra e adiciona na cartela Sela e incuba a 35 ºC Contagem de células amarelas e azuis Coliformes Totais Coliformes Termotolerantes E. coli Combinação de positivos NMP mL 0-0-0 < 0.3 0-0-1 0.3 1-0-0 0.4 2-1-1 2 2-2-1 2,8 3-0-1 3.9 3-1-1 6,4 3-3-3 >110 Tabela de NMP (10, 1 e 0,1 mL) Classificação das águas interiores do território nacional Classe Características microbiológicas DBO DO Utilização Coliformes Coliformes Totais Termotolerantes mg/L mg/L 1 < 1 < 1 ----- ------ Potável 2 ≤ 5.000 ≤ 1.000 ≤ 5 > 5 Recreação Irrigação (frutas, hortaliças) 3 ≤ 20.000 ≤4.000 ≤ 10 > 4 Pesca Consumo animal 4 > 20.000 > 4.000 > 10 >0,5 Navegação Indústria Irrigação (grandes culturas)
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