Diagnostico Parasitologico Fezes

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INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
DISCIPLINA: DOENÇAS PARASITÁRIAS DOS ANIMAIS DOMÉSTICOS
PROFESSOR: ARTUR KANADANI CAMPOS
AULA PRÁTICA: DIAGNÓSTICO DE HELMINTOSES EM ANIMAIS DOMÉSTICOS
Diagnóstico de helmintoses em ruminantes e equínos
O diagnóstico preciso de parasitoses em ruminantes e equínos é resultado de uma análise cuidadosa de vários fatores relacionados à história clínica, manejo nutricional, estado fisiológico e imunológico dos animais, exames laboratoriais e lesões observadas na necropsia. 
Exame clínico
	Frente a um problema de verminose, o diagnóstico clínico não seria o mais indicado. Os danos causados por grande parte dos helmintos gastrintestinais de ruminantes não resultam em sinais patognomônicos e, muitas vezes, a verminose se apresenta na forma subclínica. Este método diagnóstico pode ser útil quando associado a exames laboratoriais.
EXAMES LABORATORIAIS
Exame Parasitológico de Fezes 
O exame parasitológico de fezes (EPF) tem como objetivo diagnosticar os parasitos intestinais, por meio da pesquisa das diferentes formas parasitárias que são eliminadas nas fezes. A observação microscópica das fezes utilizando diferentes metodologias permite o diagnóstico diferencial de parasitoses do trato gastrintestinal.
Colheita, conservação e envio de amostras
O diagnóstico laboratorial de infecções parasitárias em ruminantes pode ser influenciado por vários fatores, como o método de colheita, conservação, e análise das amostras. 
Colheita
A colheita de fezes de ruminantes é realizada, preferencialmente, diretamente do reto dos animais Para retirar as fezes diretamente do reto, utiliza-se uma luva de procedimento descartável ou um saco plástico massageando-se as paredes retais. A luva ou saco plástico são invertidos, amarrados e, após a retirada do ar, usados como recipientes de transporte. Caso não seja possível a colheita diretamente do reto, colher imediatamente após a defecação a porção do material fecal que não tenha entrado em contato com o solo. Alguns cuidados devem ser observados quando o objetivo é realizar um levantamento de um rebanho:
Amostragem. Deve representar o rebanho quantitativa e qualitativamente. Amostrar diversos animais do plantel, considerando-se sua idade, estado nutricional e possíveis diferenças de manejo.
Quantidade da amostra: 30 a 50 gramas de fezes.
Identificação. Os dados sobre o animal (espécie, nome ou no, data, propriedade, etc.) deverão ser anotados no recipiente de colheita. Estas informações poderão também ser descritas em folha separada, anotando-se apenas o nome ou no do animal correspondente no saco plástico com caneta de retroprojetor.
CONSERVAÇÃO DAS FEZES
Conservação a frio
	Armazenar os sacos plásticos com as amostras de fezes num recipiente de isopor com gelo em escamas ou contendo gelo reciclável, alternando-se o material em camadas. As fezes poderão ser conservadas por 24 a 48 horas. 
Conservação química
Conservantes químicos são utilizados quando o tempo decorrente entre a colheita do material e seu envio ao laboratório for maior que 48 horas, ou quando inexistirem condições de conservação a frio. 
Alternativas:
Para a conservação de ovos e larvas de helmintos pode-se utilizar formol a 10% ou formol-glicerina 5% (na proporção de 1:1).
PRINCÍPIOS DOS EXAMES PARASITOLÓGICOS DE FEZES
As técnicas de EPF têm como objetivo separar os ovos, oocistos e outros estágios parasitários de outros componentes fecais (principalmente fibras). Esta separação pode ser feita por sedimentação ou flutuação ou filtração. Para ovos mais pesados, podem-se utilizar técnicas de sedimentação, ou técnicas de flutuação com soluções que apresentem gravidade específica mais elevada. Para ruminantes, utilizam-se para o diagnóstico da maior parte das parasitoses, técnicas de flutuação para separar os ovos dos parasitos. 
Figura 1. Efeito da gravidade específica na flutuação de ovos
A escolha do método coprológico a ser utilizado depende, entre outros fatores, da espécie animal, aspecto qualitativo ou quantitativo e principalmente da suspeita clínica. Para o diagnóstico de parasitoses causadas por nematóides parasitos gastrintestinais de ruminantes e alguns outros helmintos, a técnica de OPG (contagem de ovos por grama de fezes), complementada pela coprocultura, é a mais utilizada.
CONTAGEM DE OVOS POR GRAMA DE FEZES (GORDON E WITHLOCK – MODIFICADO)
Material:
Balança
Provetas graduadas 
Solução para flutuação
Bastão de vidro ou palito
Gaze ou peneira de chá
Béqueres ou recipientes similares
Pipetas de Pasteur 
Câmara de contagem de McMaster 
Microscópio
A técnica de McMaster é a mais usada para demonstrar a presença de ovos de helmintos e oocistos de coccídios em amostras de fezes.
Este método utiliza uma câmara de contagem que permite examinar microscopicamente um volume conhecido (2 x 0,15 ml) de suspensão fecal. Uma quantidade conhecida de fezes é misturada a um volume conhecido de solução de flutuação e o número de ovos por grama de fezes pode ser calculado. Esse valor é conhecido como o.p.g.
As quantidades de fezes e líquido são escolhidas de forma que a contagem de ovos possa ser facilmente derivada pela multiplicação do número de ovos sob a área delimitada por um simples fator de conversão.
A câmara de McMaster apresenta dois compartimentos de contagem, cada um com um retângulo de 0,15 cm altura e 1 cm2 de área . Quando preenchida com a suspensão de fezes em solução de flutuação, a maior parte dos debris (fibras e resíduos da digestão) se sedimenta no fundo, enquanto os ovos leves e oocistos flutuam, aderindo na superfície. Os ovos presentes abaixo da retícula podem ser facilmente contados.
Os compartimentos de contagem são delimitados por linhas gravadas na superfície de cada um, e são subdivididos por traços para facilitar a contagem. O volume de suspensão fecal encontrado em cada compartimento é obtido pela fórmula área x profundidade = volume
Método
1. Pesar 2 gramas de fezes.
2. Triturar as fezes em um copo com um bastão de vidro
3. Diluir com 29 ml de solução salina saturada ou com sulfato de zinco. 
4. Homogeneizar bem a suspensão e transferir para um béquer ou recipiente similar passando-a através de peneira de chá ou em gaze dupla.
5. Adicionar mais 29 mL de solução hipersaturada no copo onde foi preparada a suspensão inicial e verter a solução sobre a peneira ainda com fezes do passo anterior.
6. Sob homogeneização, retirar uma alíquota com pipeta Pasteur e aplicar com cuidado em cada um dos compartimentos da câmara de McMaster.
7. Deixar a câmara em descanso por 5 minutos e examinar em microscópio. Primeiramente focar as linhas das retículas. Em seguida posicionar em um dos cantos de uma retícula e alterando ligeiramente o foco, focar os ovos/oocistos. 
8. Cada área definida por uma retícula deverá ser inteiramente coberta e os parasitas detectados contados progressivamente. 
9. Para o cálculo de o.p.g., multiplicar a soma dos ovos encontrados nos dois compartimentos por 50 ou 100, dependendo da quantidade de fezes utilizada.. 
Figura 2. Etapas da técnica de OPG (Gordon e Withlock – modificado)
Fundamentos da Técnica
O cálculo do volume contido nem cada compartimento é obtido pela seguinte fórmula: 
1cm2 x 0,15cm = 0,15 cm3 = 0,15 mL.
	Considerando-se os dois compartimentos:
0,15mL x 2= 0,30 mL (volume total).
Figura 3. Vista superior da câmara de Mcmaster para contagem de OPG
Figura 4. Vista lateral da câmara de Mcmaster
Cálculo do fator
Se em 0,30mL contamos x ovos
Em 60mL teremos y ovos
Utilizando 2g de fezes, o caçulo será dividido por 2, pois o resultado é por 1 g de fezes
 x . 60 y = x . 100
Caso utilizarmos 4 gramas de fezes, o valor será dividido por 4:
Assim y= x .50
Identificação do resultado: Dependendodos ovos observados no exame, a contagem deve ser feita separadamente:
Strongylida
Strongyloides
Neoascaris
Trichuris
Nematodirus
Ovos de cestódeos serão colocados em observação, entretanto não deverão ser contados.
Significado do resultado do OPG. 
O resultado do OPG não é indicativo do grau de infecção do hospedeiro, pois a quantidade de ovos nas fezes podem ser influenciados por vários fatores, tais como:
- Hora do dia em que a colheita foi realizada;
- Patogenicidade do parasito;
- Tratamento prévio dos animais;
- Relação machos e fêmeas hospedados pelo parasito;
- Fatores relacionados ao hospedeiro, como, idade, nutrição, imunidade, alterações fisiológicas e patológicas do sistema digestivo do hospedeiro.
COPROCULTURA – TÉCNICA DE ROBERTS E O’ SULLIVAN
Objetivo
Identificação genérica de nematóides gastrintestinais através da morfologia das larvas 
Princípio
Incubação de ovos de helmintos presentes nas fezes até sua eclosão e liberação das larvas dos nematóides e posterior desenvolvimento até o desenvolvimento em L3
Material
20-30g de fezes
serragem de madeira de pinho esterilizada, carvão vegetal ou vermiculita
recipiente de vidro ou plástico (250-300ml)
bastão de vidro
papel alumínio
Preparo da coprocultura
Em um recipiente de vidro, misturar as fezes com a vermiculita, carvão ou serragem, na proporção de cerca de duas partes de vermiculita para uma de fezes. A mistura deve ficar homogênea e solta. 
Borrifar a cultura com água, se necessário.
Identificar o frasco com o número do animal e a data.
Cobrir o frasco com gaze, ou papel alumínio perfurado, ou com a própria tampa do frasco com furos, para entrada de ar.
Incubar em estufa, à temperatura de 25º a 27º C, durante 7 dias ou deixar no ambiente por 10 dias.
Verificar diariamente o grau de umidade da cultura e borrifar água, se necessário.
 
 
Colheita das larvas 
Transcorrido o período de 7 dias na estufa ou 10 dias no meio ambiente, faz-se a colheita das larvas, pelo método de Baermann
 MÉTODO DE BAERMANN, MODIFICADO
Objetivo
Detecção e identificação de larvas de nematóides nas fezes.
Princípio
Baseia-se no termotropismo, hidrotropismo das larvas.
Material
Fezes: 3 - 5g
Gaze cortada e dobrada
Prendedor
Palito de sorvete ou bastão de vidro
Tubo cônico
Técnica
Colocar as fezes da coprocultura no centro da gaze e envolver o material, formando um saquinho.
Prender o saquinho na parede do tubo cônico com o auxílio do prendedor. 
Adicionar água a 45º C pelas paredes do cálice, até encobrir completamente o saquinho com as fezes.
Deixar, de preferência, de um dia para o outro (“overnight”), ou esperar no mínimo 2 a 3 horas. Durante a aula prática esperaremos de 30 minutos a 1 hora. 
Colheitar o material do sedimento do cálice com uma pipeta Pasteur, colocar entre lâmina e lamínula, e examinar ao microscópio com objetiva de 10x.
 
Debris e Ovos
Ovos
Debris 
Debris e Ovos
Gravidade específica muito baixa
Gravidade específica ideal
Gravidade específica muito elevada adaadaada
1 cm
1 cm
1 cm
1 cm
1 cm
1 cm
0,15cm
 0,30 . 2
Y=
7 dias/ 27 oC