Relatório 3 - Enzimas

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EXTRAÇÃO DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS E EFEITO SOBRE PROTEÍNAS DE ALIMENTO
Eduardo Santos
João Pedro Mattiello
Matheus Spagiari
Ricardo Cavalheiro
Departamento de Ciências dos Alimentos, Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av Bento Gonçalves nº 9500, CEP 91540-000,
Porto Alegre-RS, Brasil.
Porto Alegre, 13 de Setembro de 2013.
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Objetivo
Este trabalho tem por objetivo extrair enzimas proteolíticas encontradas no mamão e no abacaxi sendo estas a papaína e a bromelina respectivamente, e verificar o efeito da temperatura sobre a hidrólise das mesmas nas proteínas da carne verificando assim a eficiência de enzimas proteolíticas provenientes de diferentes alimentos.
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 Introdução
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As reações enzimáticas são muito importantes em alimentos e ocorrem não só no alimento in natura, mas também durante o seu processamento e armazenamento. O aroma da cebola, por exemplo, deve-se à ação da alinase, enzima que age sobre os compostos que contêm enxofre, presentes nesse alimento. Enzimas proteolíticas (que "quebram" proteínas) como a bromelina  e a papaína presentes no abacaxi e no mamão, são muito empregadas no amaciamento da carne. Asamilases são enzimas importantes principalmente na produção de xaropes de milho pela sua capacidade de romper as ligações glicosídicas do amido.
Como toda planta da família Bromeliáceae o abacaxi apresenta como constituinte a enzima bromelina que possui alto valor comercial e ampla aplicação na industria farmacêutica alimentícia e cosmética. A bromalina é uma enzima proteolítica da classe das hidrolases. As proteases são hidrolases capazes de romper ligações peptídicas das proteínas e peptídeos. A bromelina tem diversos usos, todos baseados na sua atividade proteolítica. A sua importância econômica está relacionada com a produção de fármacos e a utilização na industria alimentícia (na clarificação de cervejas, na fabricação de queijos, no amaciamento de carnes, no preparo de alimentos infantis e dietéticos, entre outros) no tratamento de distúrbios, digestivos, feridas e inflamações, preparo de colágenos hidrolisados, nas industrias têxteis, para amaciamento de fibras e também na produção de detergentes.
Da mesma forma a papaína é uma enzima proteolíticas, sendo esta obtida da Carica papaya. A enzima papaína também possui amplo espectro de especificidade, os peptídeos, amidas, ésteres e tioésteres são todos susceptíveis para hidrólise catalítica da papaína. Assim como sua importância econômica está relacionada com a produção de fármacos, com a industria alimentícia e têxtil.
A atividade de uma enzima pode ser determinada com base na velocidade de conversão de um reagente adequado (substrato) e está estritamente vinculada aos reagentes desnaturantes, pelo fato de sua função catalítica depender da conformação na qual a enzima se apresenta. A temperatura é um dos agentes críticos sobre a atividade das enzimas. Quando se eleva a temperatura, a atividade aumenta o processo de desnaturação cresce em decorrência da ação do calor. O pH é outro parâmetro que exerce grande influência na manutenção da atividade enzimática. O efeito desse fator se dá devido às alterações no estado de ionização dos componentes do sistema, em conseqüência da variação da concentração.
Procedimento Experimental
	Inicialmente preparam-se os extratos enzimático a partir das frutas abacaxi e mamão.
Extração da enzima bromelina do abacaxi:
Retirou-se completamente a casca e o talo do abacaxi, em seguida preparou-se um extrato 1:1 de polpa de abacaxi e água destilada gelada. Então o extrato foi batido no liquidificador até a completa homogeneização, após esta etapa o extrato foi filtrado em gaze e o filtrado recolhido em um Erlenmeyer o qual foi mantido gelado.
Extração da enzima papaína do mamão:
Retirou-se completamente a casca e o talo do mamão, em seguida preparou-se um extrato 1:1 de polpa de mamão e água destilada gelada. Então o extrato foi batido no liquidificador até a completa homogeneização, após esta etapa o extrato foi filtrado em gaze e o filtrado recolhido em um Erlenmeyer para utilização na proteólise.
Reações enzimáticas:
As reações enzimáticas foram preparadas em 9 tubos de ensaio da forma como segue abaixo.
Tubo 1. 0,50g de carne moída mais 5ml de água destilada. Deixado a temperatura ambiente por 30 minutos.
Tubo 2. 0,55g de carne moída mais 5ml de água destilada. Deixado a temperatura de 50°C por 30 minutos.
Tubo 3. 0,53g de carne moída mais 5ml de água destilada. Deixado a temperatura de 80°C por 30 minutos.
Tubo 4. 0,50g de carne moída mais 5ml de extrato de abacaxi. Deixado a temperatura ambiente por 30 minutos.
Tubo 5. 0,51g de carne moída mais 5ml de extrato de abacaxi. Deixado a temperatura de 50°C por 30 minutos.
Tubo 6. 0,54g de carne moída mais 5ml de extrato de abacaxi. Deixado a temperatura de 80°C por 30 minutos.
Tubo 7. 0,50g de carne moída mais 5ml de extrato de mamão. Deixado a temperatura ambiente por 30 minutos.
Tubo 8. 0,50g de carne moída mais 5ml de extrato de mamão. Deixado a temperatura de 50°C por 30 minutos.
Tubo 9. 0,53g de carne moída mais 5ml de extrato de mamão. Deixado a temperatura de 80°C por 30 minutos.
Após o período de 30 minutos para todos os tubos foi adicionado 2ml de solução de ácido acético 5% em cada tubo os quais foram agitados e imediatamente filtrados em papel filtros. Foi então transferido 2ml de cada filtrado para tubos devidamente identificados e adicionados 5ml de reagente de Biureto a solução foi agitada e colocada em banho por 5 minutos a 45°C para acelerar a reação.
Na seqüência foi medido a absorvância de cada tubo. 
Resultados
Cada um dos 9 tubos de ensaio tiveram suas absorvâncias medidas no comprimento de onda de 545nm sendo o zero ajustado com água destilada. Os resultados são apresentados na tabela 1. 
Tabela 1. Absorvâncias obtidas no teste de Biureto
	Branco (Água destilada)
	1 Temp. Ambiente
	2
(50°C)
	3
(80°C)
	0,325
	0,239
	0,121
	Extrato de Abacaxi
	4 Temp. Ambiente
	5
(50°C)
	6
(80°C)
	0,252
	0,180
	0,129
	Extrato de Mamão
	7 Temp. Ambiente
	8
(50°C)
	9
(80°C)
	x
	0,336
	0,364
	Não foi possível realizar a leitura de absorbância do tubo de ensaio número 7, pois a solução apresentou uma espécie de condensado impossibilitando a leitura.
	Para os demais tubos fazendo-se uso da curva padrão (figura 1) obtida na aula prática de reações em proteínas os valores de absorbância foram convertidos para concentração de proteína em mg/ml e os valores são apresentados na tabela 2.
Figura 1. Curva de calibração das reações de proteína.
Tabela 2. Concentração de proteína.
	Concentração mg/ml
	Tubo 1
	1,22
	Tubo 2
	0,89
	Tubo 3
	0,42
	Tubo 4
	0,94
	Tubo 5
	0,65
	Tubo 6
	0,45
	Tubo 7
	x
	Tubo 8
	1,27
	Tubo 9
	1,38
Conclusões
	
	Os resultados obtidos na prática divergiram com relação aos resultados esperados conforme a literatura. As proteínas da carne são em grande parte insolúveis em água; as enzimas agem quebrando as moléculas da proteína em substâncias menores mais solúveis e quanto maior a temperatura maior a ação da enzima, mais proteína solubilizada até uma determinada temperatura que inative a enzima. O mesmo não foi observado para a enzima bromelina as concentrações de proteína decaíram com o aumento da temperatura. Para a papaína não vou possível medir a concentração a temperatura ambiente e as concentrações aumentaram com a temperatura, porém na temperatura de 80°C a concentração deveria ser menor do que a 50°C pois a esta temperatura a enzima é desativada.
Referências
Ferreira F., Sbruzzi D., barros K., Extração e caracterização de uma enzimaproteolítica do curauá. Exacta, Vol. 8, num. 2, 2010, pp 179-184.
Experimentos de Bioquímica, Disponível em: <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/enzimas.htm>.Acesso em 15/09/2013