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Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 1 CULTIVO DE MICROORGANISMOS A sobrevivência de um microrganismo, tanto na natureza como em laboratório, depende de suas habilidades de crescer sob determinadas condições físicas e químicas. Conhecendo essas condições é possível caracterizar, isolar e diferenciar as bactérias. Esse conhecimento também faz possível o controle do crescimento de microrganismos em condições práticas. Os meios usados em laboratório para o cultivo de bactérias têm que suprir todos os nutrientes necessários ao crescimento e manutenção das bactérias (ver tabela abaixo). Uma grande variedade de meios é usada para o isolamento, manutenção, crescimento e classificação das bactérias. É importante ressaltar que nenhum meio de cultura é capaz de promover o crescimento de todo e qualquer microrganismo.O preparo de um meio de cultura requer que seus componentes sejam dissolvidos e água destilada pura. Isto é necessário porque, como solvente universal, a água é capaz de dissolver os nutrientes e é o meio no qual as reações químicas ocorrem. O uso de uma água que não seja pura pode fazer com que quantidades significativas de solventes sejam adicionadas ao meio de forma que a osmolaridade e a compatibilidade desses solutos não seja adequada ao cultivo de um determinado microrganismo. ELEMENTOS QUÍMICOS PRESENTES EM CÉLULAS BACTERIANAS Elemento Percentual (peso seco) Carbono 50 Oxigênio 20 Nitrogênio 14 Hidrogênio 8 Fósforo 3 Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 2 Enxofre 1 Sódio 1 Potássio 1 Cálcio 0,5 Magnésio 0,5 Cloro 0,5 Ferro 0,25 Cu, Zn, Mo, Bo, Se, Ni, Cr, Co e Wo 0,25 Total 100 Nitrogênio: é um componente integral das aminoácidos, nucleotídeos, lipídeos de membrana e carboidratos de parede celular. Somente algumas bactérias, chamadas diazotróficas, são capazes de fixar o nitrogênio atmosférico. Porém a maioria dos organismos necessitam de N pois não têm essa capacidade. A maioria dos microrganismos assimila amônia do meio, muitos assimilam também nitrato, reduzindo-o a amônia. Por esse motivo, ambos ou um desses dois componentes tem que ser adicionado ao meio de cultura. N orgânico é necessária a bactérias que evoluíram em ambientes ricos em aminoácidos, vitaminas etc. Enxofre: é parte constituinte dos aminoácidos cisteína e metionina, de vitaminas como biotina e tiamina etc. O enxofre costuma ser adicionado aos meios de cultura na forma de sal, como MgSO4. De forma que este sal é fonte tanto de S como de Mg no meio em questão. Fósforo: constituinte de fosfolipídeos de membrana, ácidos nucléicos e de compostos de alta energia como a ATP e o GTP. O fósforo é adicionado nos meios na forma de fosfatos, que além de suprirem as necessidades fisiológicas desse elemento funcionam também como tamponantes dos meios. Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 3 Carbono hidrogênio e oxigênio: São constituintes de quase todas as moléculas biológicas, estando presentes em todos os meios de cultura na forma de seus constituintes como açucares ou ácidos orgânicos. O C é considerado como fonte de energia e também como componente estrutural nos meios de cultura. Um meio destinado ao cultivo de microrganismos fotossintetizantes não precisa conter C. FUNÇÃO DE ALGUMAS VITAMINAS E ELEMENTOS MINERAIS NA NUTRIÇÃO BACTERIANA Ac nicotínico Precursor deo NAD e do NADP Ac. Pantotênico Componente da coenzima-A e da proteína carreadora de acil Piridoxal HCl Coenzima para as transaminases e aminoácido oxidases Tiamina HCl Conzima em transaldolases, transcetolases e decarboxilases Riboflavina Componente da FMN e de FAD. Biotina Coenzima em reações de carboxilação Ac. Fólico Coenzima envolvida na transferência de unidades de um carbono. Potássio Cofator de várias reações enzimáticas, especialmente na síntese de proteínas. Sódio Juntamente com o cloro participa da regulação osmótica. Em muitas espécies participa do transporte de nutrientes importantes como glicose a aminoácidos. Magnésio Componente da clorofila, é fundamental na síntese e hidrólise de ATP. Ferro Componente dos citocromos e de Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 4 outras proteínas. Cobalto Constituinte da vitamina B12 e cofator de algumas proteínas. Cobre, zinco, molibdênio, níquel, tungstênio e selênio. Cofatores para determinadas enzimas. As várias formas de vida existentes podem ser classificadas quanto à fonte de energia utilizada pata a síntese de ATP em quimiotróficas, que obtêm essa energia da oxidação de compostos químicos e fototróficas que obtêm essa energia de radiações eletromagnéticas, especialmente a luz. Estas duas categorias podem ainda ser subdivididas da seguinte forma: TIPOS NUTRICIONAIS DE BACTÉRIAS TIPO NUTRICIONAL FONTE DE ENERGIA FONTE DE CARBONO EXEMPLO Fotoautotroficos Luz CO2 Cianobactérias, bactérias púrpura e bactérias verdes Fotoheterotróficos Luz Compostos orgânicos Algumas bactérias púrpura e verdes Quinioautotróficos, ou Químiolitotróficos Compostos inorgânicos como: H2, NH3, NO2, H2S CO2 Algumas eubactérias e muitas archeas Quimioheterotróficos ou heterotróficos Compostos orgânicos Compostos orgânicos Maioria das eubactérias e algumas archeas Os meios de cultura podem ser classificados quanto à composição em: Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 5 Definidos: quando as concentrações de todos os seus componentes são conhecidas. Complexos: quando as concentrações de seus componentes não é totalmente conhecida. Um meio definido típico para o cultivo de bactérias de vida livre Constituinte Quantidade mg / l H2O Fonte de carbono (entre 0,5 e 2,0%) NH4Cl 500 NaNO3 500 Na2HPO4 210 NaH2HPO4 90 MgSO4 . 7 H2O 200 KCl 40 CaCL2 15 FeSO4 1 Elementos traço µg / l H2O ZnSO4 . 7 H2O 70 H3BO3 10 MnSO4 . 5 H2O 10 MoO3 10 CoSO4 10 CuSO4 . 5 H2O 5 Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 6 Meio definido para cultivo de Streptococcus Componente Concentração final (µg / l) L-alanina 250 -arginina 320 -aspartato 500 DL-asparagina 100 -cistina 600 -cisteína-HCl 600 -glutamato 400 -glicina 200 -glutamina 100 -histidina 320 -leucina 200 -lisina 320 -isoleucina 200 DL-metionina 200 -fenilalanina 200 -prolina 200 -serina 400 -triptofano 200 -tirosina 200 -valina 200 Ac nicotínico 10 Ac. Pantotênico 10 Piridoxal HCl 10 Tiamina HCl 0,6 Riboflavina 1 Biotina 0,2 Ac. Fólico 0,02 Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 7 K2HPO4 1000 KH2PO4 1000 NaHCO3 500 FeSO4 . 7 H2O 10 MnCl2 25 NaCl 10 ZnSO4 . 7 H2O 10 MgSO4 . 7 H2O 80 Glicose 10000 Adenina 10 Guanina 10 Xantina 10 Uracila 10 Quanto á consistência os meios podem ser classificados em: Caldo (broth) Sólidos (gelose ou agar ). Agar e Meios sólidos O Agar, uma substância gelatinosa extraída de algas agarófitas, é o principal agente solidificante dos meios de cultura. Na verdade o Agar se constitui de uma preparação impura de um carboidrato chamado agarose.Ele é adicionado aos meios de cultura na forma de um pó na proporção de 0,5% a 2% p/v ( 1,5% a 2%, para placas e geloses (slants) e 0,5% ou menos para meios semi-sólidos. Uma característica interessante do Agar é que ele se dissolve em água a temperaturas em torno de 100oC e solidifica a menos de 43oC. Uma vez solidificado e só se Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 8 dissolve novamente se a temperatura chegar novamente aos 100oC. Essas propriedades proporcionam utilidades para o uso do Agar em microbiologia tais como: 1-O meio pode ser inoculado em temperaturas entre 50 e 43oC enquanto está líquido, sem que as células morram. 2-Uma vez solidificado o meio permanecerá sólido em um intervalo amplo de temperatura. Além disso, o Agar é resistente à degradação pela maioria dos microrganismos, e é bastante translúcido, quase transparente, o que faz com que o crescimento do microrganismo possa ser observado na placa assim como outras características. Uma desvantagem do uso do Agar é o fato de que é praticamente impossível purifica-lo totalmente das impurezas, o que faz com que o Agar adicionado a um meio definido o torne complexo. No caso de haver necessidade de um meio sólido absolutamente definido, pode-se usar solidificantes à base de silício. Anteriormente ao uso do Agar, ftias de batata e gelatina eram utilizados como solidificantes dos meios, porém, esses materiais são facilmente degradáveis por uma infinidade de microrganismos. Além disso, a gelatina se liquefaz em temperaturas relativamente baixas e as fatias de batata são opacas. Em 1881, Fanny Eilshemius Hesse, um técnico do laboratório de Robert Koch na Alemanha, após uma viagem ao Japão, introduziu o uso do Agar, que já era usado na culinária oriental como agente gelificante, em microbiologia. Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 9 Figura 1- Meios sólidos ou geloses em placa de Petri. Neste caso usadas para a detecção e quantificação de bacteriófagos. Figura 2- Meio líquido em um Erlemeyer. Neste caso contendo bactérias luminescentes (bioluminescência). Classificação dos meios de cultura baseada no uso: Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 10 - Meio mínimo é um meio que contem apenas os constituintes absolutamente essenciais a um determinado microrganismo. O meios mínimos variam em composição conforme as exigências nutricionais de uma determinada espécie de microrganismo. Para E. coli, por exemplo o meio mínimo se constitui de sais e glicose apenas, enquanto que para microrganismos fastidiosos como Lactobacillus, o meio mínimo requer fatores de crescimento como as vitaminas e também uma série de aminoácidos. - Meio de uso amplo é um mio rico em uma grande variedade de nutrientes ( inclusive fatores de crescimento) o que o torna capaz de suportar o crescimento de uma série de microrganismos. Como exemplo podemos citar os meios APT Agar, Agar para contagem em placa (Plate Count Agar), Agar de infusão de coração (Heart Infusion Agar), Agar de infusão de coração e cérebro (Brain Heart Infusion Agar) etc. - Meios seletivos são capazes de promover o crescimento de determinados tipos de microrganismos, inibindo o crescimento de outros. A seletividade pode ser devida à adição de agentes seletivos que funcionarão como uma espécie de “veneno” para os microrganismos indesejáveis, ou devida à omissão de determinados nutrientes que se sabe necessários ao crescimento de microrganismos indesejáveis, como por exemplo os meios: . MacConkey Agar. Neste meio, os agents seletivos são adicionados com o objetivo de inibir ao máximo possível o crescimento de microrganismos indesejáveis. Os agentes seletivos deste meio são os sais biliares e o cristal violeta, que inibem o crescimento de bactérias gram-positivas, permitindo apenas o crescimento das gram- negativas. . Caldo livre de nitrogênio (Nitrogen-Free Broth). Este meio é feito sem a presença de fonte de nitrogênio de espécie alguma. Portanto apenas os microrganismos capazes de fixar o N2 atmosférico (bactérias fixadoras de nitrogênio, ou diazotróficas) poderão crescer nele. Neste caso nenhum componente restritivo ao crescimento é Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 11 adicionado, apenas se omite um elemento essencial a todos os microrganismos que não são diazotróficos. . Caldo de succinato (Succinate Broth) neste exemplo, um nutriente específico é utilizado como limitante, apenas um grupo limitado de microrganismos poderá utilizar o componente limitante como única fonte de carbono. Neste caso, o meio em questão é utilizado como meio de enriquecimento para bactérias fotossintetizantes púrpura. Outros microrganismos não são capazes de utilizar o succinato sob as condições anaeróbicas usadas. Este é outro exemplo de mio restritivo, que não contem agentes restritivos. - Meios diferenciais são meios que permitem o crescimento de um ou mais tipos de microrganismos, porém contêm corantes e/ou outros componentes que permitem a identificação de microrganismos específicos, que agirão sobre esses corantes e outros componentes, alterando sua cor, de forma a detectar sua presença. . MacConkey Agar, neste caso o meio é usado em placas, nas quais os organismos que fermentem a lactose presente acidificarão o meio, o que fará com que o indicado, vermelho neutro, se torne vermelho, dando às respectivas colônias a cor vermelha. No caso de colônias que não tenham esta característica, sua cor será esbranquiçada. Este meio pode ser considerado como um meio seletivo diferencial. . Caldo glicosado para fermentação (Glucose Fermentation Broth). Este meio é usado em tobos, comumente tubos de Durham. Os microrganismos que fermentarem a glicose acidificarão o meio causando alteração na cor do indicador, além disso, de produzirem gases insolúveis como o H2, uma bolha será formada no tubo de Durham invertido . Outros meios doferenciais que não usam indicadores de pH são o meio de motilidade, o meio de gelatina nutriente, o Agar amido, Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 12 o meio Agar Klinger ferro (usado para produção de H2S) e o Agar sangue. CONSTITUINTES COMUNS EM MEIOS DE CULTURA Agar- É usado como solidificante dos meios, é um polissacarídeo impuro obtido de algas agarófitas. Dissolve-se a temperaturas próximas aos 100oC e solififica em torno de 43oC. Normalmente o Agar não é degradado pelos microrganismos. Fluidos corpóreos- O sangue puro ou desfibrinado, plasma, soro ou outros fluidos corpóreos são freqüentemente usados como componentes de meios de cultura para o isolamento e cultivo de microrganismos patogênicos. Os fluidos corpóreos contêm vários fatores de crescimento úteis a esses microrganismos. Figura 3- Placa de Agar sangue, o halo amarelo em torno das colônias indica a excreção de toxinas hemolíticas. Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 13 . Tampões – São usados para a manutenção do pH ótimo. Sais como os fosfatos de sódio ou de potássio e o carbonato de cálcio costumam ser usados com esta função, além de serem fonte dos respectivos íons, proteínas e peptonatambém têm capacidade tamponante. Extratos – Tecidos animais como músculo, coração, fígado e cérebro; produtos vegetais como a batata e o malte e microrganismos como as leveduras são usados no preparo de extratos por fervura, que depois são secos e concentrados na forma de pasta ou pó. Esses extratos são fonte de aminoácidos, vitaminas, minerais, carboidratos e coenzimas, muitas das quais servindo como fatores de crescimento para microrganismos fastidiosos. O termo infusão diz respeito aos estratos aquosos desses materiais, sem secagem ou concentração. Desta forma o termo infusão pode ser considerado sinônimo de extrato. Peptonas – São constituídas de misturas complexas de componentes orgânicos e inorgânicos, sendo obtidas a partir da digestão enzimática de tecidos anomais ou Figura 4- Placa de Agar amido, corada com lugol. A estria a esquerda corresponde a um microrganismo excretor de amilases, já que o halo claro em torna da estria indica a auzencia de amido, que foi hidrolisado pelas amilases excretadas. A estria a direita coresponde a um microrganismo que provavelmente tem uma amilase presa à parede celular, já que é capas ce crescer em amido, mas não há halo em torna da estria. Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 14 vegetais, tais como: carne, gelatina, leite (caseína), soja. O resultado da hidrólise desses materiais é então seco e vendido em pó. Os principais componente das peptonas são peptídeos pequenos e aminoácidos livres. Como são hidrolisados brutos, as peptonas contêm uma gende variedade de outros componentes orgânicos, bem como vários minerais, porém, podem ser deficientes em alguns minerais e vitaminas. Como exemplo de peptonas podemos citar: . Triptona (tryptone ou trypticase) que é um hidrolisado pancreático (trisina e quimiotripsina) de caseína. . Phitona (ou soytone) que é um hidrolisado papaínico de farinha de soja. . Peptone (ou peptone) que é um hidrolisado péptico de tecido muscular. As peptonas costumam ser usadas em conjunto com outros extratos para o cultuvo de microrganismos fastidiosos, ou simplesmente como um caldo de peptona para o cultivo de muitos microrganismos. Indicadores de pH. Normalmente são adicionados a meios diferenciais com o objetivo de se detectar mudanças no pH do meio durante o cultivo de microrganismos fermentadores de carboidratos. Púrpura de bromo-cresol, azul de bromo-timol e vermelho fenol são componentes comuns de meios diferenciais, nos quais a acidificação do meio pode ser detectada pelo aparecimento da cor amarela. INDICADORES DE pH INDICADOR MEIO ÁCIDO MEIO ALCALINO Eosina Y Azul escuro Azul claro Azul de metileno Azul escuro Azul claro Azul de bromo-timol Amarelo Azul Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 15 Fuchsina ácida Vermelho Incolor Vermelho fenol Amarelo Vermelho Vermelho neutro Vermelho Amarelo Púrpura de bromo-cresol Amarelo Púrpura Figura 6 - Purpura de bromo-cresol indicando acidificação e alcalinização (mais ácido ao centro) Figura 5 - Exemplo de uso do indicador de pH vermelho neutro, indicando acidificação do meio na gelose à esquerda. Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 16 Figura 7 - Azul de bromo-timol (o par 2 mostra que houve acidificação moderada do meio, enquanto o par 3 mostra acidificação total do meio) Agentes redutores. Certos compostos químicos favorecem o crescimento de determinados microrganismos através da redução do potencial REDOX do meio. A cisteína e o tioglicolato são os agentes redutores mais comumente usados para o cultivo de anaeróbicos, sendo encontrados no meio de tioglicolato. Agentes seletivos. São substâncias antimicrobianas que podem ser usadas em meios seletivos para inibir o crescimento de determinados grupos de microrganismos como mostrado na tabela abaixo. AGENTE SELETIVO USO Lauril sulfato de sódio Inibição do crescimento de gram-positivos Sais biliares (oxgall) Inibição do crescimento de gram-positivos Verde brilhante Inibição do crescimento de gram-positivos Deoxicolato de sódio Inibição do crescimento de gram-positivos Cristal violeta Inibição do crescimento de gram-positivos Microbiologia 2006/1; Professor Julio C. Ferreira, Aula: Cultivo de Microrganismos 17 Eozina-X Inibição do crescimento de gram-positivos Azul d metileno Inibição do crescimento de gram-positivos Vermelho neutro Inibição do crescimento de gram-positivos Azida sódica Inibição do crescimento de aeróbicos Antibióticos Inibição do crescimento de microrganismos sensíveis a cada tipo As seguintes substâncias são usadas para a inibição do crescimento de bactérias gram negativas: Lauril sulfato de sódio; sais biliares (oxgall); deoxicolato de sódio; verde brilhante; cristal violeta; eozina-X; azul d metileno e vermelho neutro.
