Pirogênio - Profa. Elisana Moura

Prévia do material em texto

01/11/2016
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DISCIPLINA : CONTROLE BIOLÓGICO
Elisana A. de Moura Pires
João Pessoa, 2016
Uso parenteral: injeção, infusão, 
implantação.
Produtos oftálmicos.
Produtos Estéreis
Os produtos oftálmicos estéreis não apresentam requisição para 
isenção de pirogênio.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Pirogênio
 Termoestáv el;
 Poucas quantidades é suf iciente para induzir f ebre elev ada
(1,0 ng/kg);
 Porção lipídica do lipopolissacarídeo é responsáv el pelas
reações biológicas.
Qualquer substância capaz de induzir elev ações térmicas, em
resposta a injeções ou inf ecções em animais e humanos.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Pirogênio
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Pirogênio
Pirogênio Endógenos
 Substâncias sintetizadas por diferentes células do hospedeiro -
mediadores primários da febre ;
 Substâncias obtidas a partir de leucócitos polimorfonucleares, Ex. 
Pirogênio granulocítico, substâncias de células tumorais.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Pirogênio
Pirogênio Exógeno
Microbiana: Bacteriana, fungos, vírus, componentes de bactérias 
GRAM (-) e toxinas de bactérias GRAM (+);
 Não microbiana: Alguns fármacos e esteróides.
ENDOTOXINAS
LPS – cadeias 
polissacarídeos e 
fração lipídica-
Lipídeo A
01/11/2016
2
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Atividade biológica
 Ação tóxica (problemas vasculares, hipotensão, colápso, choque 
mortal, diarréia, hemorragias intestinais, necrose da medula óssea;
 Leucopenia, leucocitose, eosinopenia e linfopenia
 Ação febril: dores, calafrios, náuseas, cefaleia e elevação da 
temperatura.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Fontes de contaminação
 Pricípio ativ o, solv entes ou v eículos;
 Equipamentos;
 Material de embalagem;
 Contaminação durante o processo de f abricação
 Água para injetáv eis
Existem 2 grandes classes de Processos de
Despirogenização:
a) Processo de Inativ ação
b) Processo de Remoção
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
1) Hidrólise ácido – básica ou alcalina
- Reduz ou elimina a ativ idade do LPS, pela desativ ação
do lipídeo A ( considerado responsáv el pela ação
biológica)
HCl 0,05N por 30 min a 100ºC ou
Ácido acético glacial 1% por 2 – 3 h a 100ºC
NaOH 0,25N por 1 h a 50ºC
Aplicação: Despirogenização de materiais
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
2) Oxidação
- Inativ ação oxidativ a da endotoxina bacteriana com
peróxido de Hidrogênio (H2O2). É dependente do tempo, pH
e concentração.
Aplicação: Eliminação de pirogênio da água estéril para
injeção USP, solução salina normal, salina dextrose,
lav agem de componentes plásticos na f abricação de
correlatos.
Vantagem : ausência de peróxido no f inal do processo.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
3) Alquilação
Um agente alquilante é o gás óxido de etileno, que, segundo
alguns estudos, pode promov er a redução da ativ idade de
endotoxinas bacterianas, além de promov er a esterilização
de produtos.
Aplicação: produtos médicos - hospitalares
Outro agente alquilantes tratamento com anidrido acéticos
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
01/11/2016
3
4) Processo térmico – Calor seco
- Estuf as
- Túneis por conv ecção, condução ou irradiação
(Inf rav ermelho)
Aplicação: Método de escolha para materiais
temoresistentes, como f rascos de v idro e instrumentos
metálicos
Processo de despirogenização: Exposição do material a 
250ºC , no mínimo por 30 min. Ocorre incineração.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
1) Lav agem
- Método mais simples e um dos mais antigos para remoção
de endotoxinas.
- Ef etiv o
- Lav agem com solv ente apirogênico : Água estéril para
injetáv eis USP.
Aplicação: Vidrarias, dispositiv os médicos, tampas e
superf ícies de materiais.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
2) Destilação
- Método mais antido para remoção de endotoxinas.
Mecanismo: Alteração de fase:
a) L para V – Água ( v apor) e LPS ( Líquido)
LPS ( Alto peso molecular) : tende a cair, dev ido a
grav idade.
b) V para L – Água Condensa, sem as endotoxinas.
Aplicação: Remoção de pirogênio da água
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
3) Ultraf iltração
-Utilização de membranas ultraf iltrantes
Tamanho da subunidade básica do LPS: 10.000 a 20.000
daltons.
Mecanismo: Filtros despirogenantes – exclusão por peso
molecular / tamanho da partícula.
Aplicação: Fármacos (ex. antibióticos) e soluções de baixo
a médio peso molecular.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
4) Osmose rev ersa
- Filtração sobre pressão .
- Membranas constituída de acetato de celulose ou
poliamida, com pequenos poros para exclusão de partículas.
Mecanismo: Exclusão por tamanho - poros pequenos
impedem a passagem de pirogênios.
Aplicação: Produção de água estéril para injeção. Método
reconhecido pela USP, assim como o processo de
Destilação.
- Consegue remov er de 99,5 a 99,9 % da carga pirogênica
do sistema.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Processos de Despirogenização
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Obtenção de Produtos apirogênicos
Boas Práticas de Fabricação , d e forma qu e o produto seja obtido
apirogênico no primeiro processamento.
Deve-se trabalhar durante todo o processo produtivo, em condições
adequad as de higien e, relativo a op eradores e ambiente, empregar
matérias-primas com baixas cargas microbianas, processo validado e
pessoal qualificado.
01/11/2016
4
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
IN VIVO IN VITRO 
Reação fisiológica
Produtos Intratecal
< 50 pg/mL dose de 10 
mL/kg
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
IN VIVO 
Grupo de coelhos -
Nível padrão de 
estado febril.
Aprovação ou 
Rejeição
> 0,5ºC
Inoculação de substância pirogênica
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Animais
Sexo masculino, adultos,
sádios, albinos, peso mínimo
de 1,5kg.
Temperatura: 20 a 23ºC.
 Acondicionamento.
 Variação térmica indiv idual
de 0,2ºCCoelhos em biotério
 Teste Pirogênio – Método in vivo
Controle de Qualidade
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Medir temperatura (Tc):
 T1 (40 min) + T2 (10 min) /2
= < 39,8.
 Dif erença < 1,0 ºC
Coelhos em biotério
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
Condições do Teste in vivo
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Condições do Teste in vivo
Preparar a amostra de
acordo com a monograf ia do
produto;
Aquecer 35 a 39ºC;
 3 animais
Coelhos em biotério
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Condições do Teste in vivo
 0,5 mL a 10mL/kg
 Tempo de 4 min.
Anotar a temperatura em
interv alos de 30min/3h;
 Termopar ou termomêtro
(6cm).
Coelhos em biotério
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
01/11/2016
5
Interpretação do Teste
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
Animais TC TM Diferença
1 39,o 39,5 0,5
2 39,1 39,4 0,3
3 39,1 39,0 0,0
Passa no teste: Dif erença entre as temperaturas máxima 
e controle inf erior a 0,5 ºC.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
Animais TC TM Diferença
1 39,o 39,5 0,5
2 39,1 39,4 0,3
3 39,1 39,0 0,0
4 39,5 39,3 0,3
5 39,6 39,5 0,1
6 39,3 39,0 0,3
7 39,5 39,0 0,5
8 39,5 39,0 0,53 dos 8 com 
temperaturas 
igual ou 
maior que 
0,5ºC. Soma 
dos 
aumentos < 
3,3 ºC.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Teste Pirogênio
Controle de Qualidade
Teste negativ os : os animais podem ser reutilizados após 
48h.
Teste positiv o : os animais podem ser reutilizados após 
duas semanas.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Teste Pirogênio - Desvantagens
Controle de Qualidade
 Método demorado;
 Env olv e número grande de animais;
 Limitado para medicamentos como esteroides e 
quimioterápicos;
 Ensaio qualitativ o.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Teste Endotoxinas - Método LAL (Limulus Amebocyte
Lysate)
Controle de Qualidade
 Sangue f ormav a
coágulo em gel sólido;
 Bactérias Gram (-)
doença f ulminante;
 Lise dos Amebócitos
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Controle de Qualidade
-Extraído o sangue;
-Centrif ugado;
- Amebócitos são lisados;
- Liof ilizados – 3 anos a 4ºC.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
01/11/2016
6
 Teste Endotoxinas - LAL
Controle de Qualidade
Limite baixo de detecção;
 Maior especif icidade;
 Menor custo;
 Menor v ariabilidade dos resultados.
 Quantitativ o.
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Teste Endotoxinas - LAL
Controle de Qualidade
Reação enzimática entre o lisado (LAL) e a endotoxina 
resulta na f ormação de um gel protéico. 
Coagulogênio do limulus em coagulina. 
Método de Coagulação em Gel – Gel CLot
(0,01 – 0,03 EU/mL)
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Microbiologia de Produtos Estéreis
 Teste Endotoxinas - LAL
Controle de Qualidade
Condições do Teste in vitro
 Todos os materiais dev em ser apirogênico;
A água reagente para o LAL dev e ser estéril para
injetáv eis;
 0,1 mL da amostra e 0,1 mL do LAL;
 Temperatura ótima 37 por 1h ºC;
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Controle de Qualidade
Método de Coagulação em Gel
 Teste Endotoxinas - LAL
Controle de Qualidade
Teste in vitro
 Curv a de calibração entre o reagente LAL e
Endotoxina padrão;
E. Coli. LAL
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Teste Endotoxinas - LAL
Controle de Qualidade
Método Fotométrico - Turbidimétrico
 Turbidez após 
conv ersão de 
coagulogênio em 
coagulina (340 nm).
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
01/11/2016
7
 Teste Endotoxinas - LAL
Controle de Qualidade
Método Fotométrico - Cromogênico
 Substrato cromogênico: 
p-nitroanilida – f orma 
coloração amarela (405 
nm);
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
 Pirogênio e Endotoxinas
Controle de Qualidade
Boas Práticas de Fabricação
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
Tempo de manipulação e f ase de esterilização
Matéria-prima – Água para injetáv eis
Produtos que justif icam o processo de despirogenização: 
Biológicos e água para injetáv eis.
Referências
RDC 17, 2010
(BPF)
Pirogênio e Endotoxina Bacteriana