5 Roteiro Práticas ANTIBIOGRAMA

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ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS
TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS (TSA) MÉTODO KIRBY- BAUER (DIFUSÃO EM DISCO)
CURSO: Biomedicina
DISCIPLINA: Bacteriologia Clínica
INTRODUÇÃO
Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. A proposta primária deste teste é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para a terapia.
A realização do TSA (antibiograma) e sua interpretação não é uma tarefa fácil, por suas limitações e principalmente pela crescente descoberta de novos mecanismos de resistência, o que exige cada vez mais atualização e treinamento dos profissionais. No teste de Kirby-Bauer, uma série de antibióticos impregnados em pequenos discos circulares de papel são colocados sobre uma placa contendo meio de cultura crescido com a bactéria inoculada de forma homogênea, como se fosse um tapete sobre a superfície do meio. As placas são incubadas em temperatura e tempo adequados para permitir o crescimento da bactéria e também a difusão do antibiótico no interior do ágar. Se um micro-organismo é suscetível a um antibiótico, uma zona clara aparece ao redor do disco, onde o crescimento do micro-organismo foi inibido. O tamanho dessa zona de inibição depende da sensibilidade da bactéria a um antibiótico específico e da habilidade de difusão através do ágar do antibiótico contido no disco.
A metodologia de Kirby-Bauer para antibiograma é a mais difundida e utilizada até hoje na rotina de análises clínicas, devido a sua praticidade de execução, baixo custo e confiabilidade de seus resultados. Apesar de sua relativa simplicidade de execução, a técnica de Kirby-Bauer exige que as instruções sejam seguidas rigorosamente de forma que os resultados obtidos correspondam à realidade e possam ser comparados com as tabelas internacionais.
OBJETIVOS
Determinar a sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos a partir da interpretação correta dos halos.
MATERIAL
Estufa bacteriológica; alças bacteriológicas em platina ou descartáveis; agar Mueller Hinton em placas de Petri 90X15mm ou 140X15mm; tubo com escala 0,5 Mac Farland ou tubidímetro; solução salina estéril (NaCl 0,85%); swabs estéreis; antibióticos impregnados em discos de papel de filtro; pinças estéreis; cultura de bactérias; tabelas com os valores esperados de halos inibitórios; bico de Bunsen; régua ou paquímetro; estante para tubos; álcool a 70%; caneta para identificação de placas e tubos
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EXPERIMENTAL
Retirar as placas e os frascos com os discos da geladeira cerca de 20-30 minutos para que adquiram a temperatura ambiente antes da execução da prova;
Com uma alça bacteriológica de platina devidamente flambada e resfriada (ou alça descartável estéril), tocar na colônia recente (18-24h);
Suspender as colônias em solução salina estéril (NaCl 0,85%) até se obter uma turvação compatível com o grau 0,5 da escala Mac Farland (1,5x108 UFC/mL).
Embeber um swab estéril na suspensão bacteriana, comprimindo-o contra as paredes do tubo para retirar o excesso da suspensão, e semear em seguida de forma suave em cinco direções, procurando abranger toda a superfície;
Aguardar (não mais que 15 minutos) a superfície do agar secar;
Com auxílio de uma pinça flambada e resfriada, colocar os discos de forma equidistante sobre a superfície do meio inoculado, exercendo uma leve pressão com a ponta da pinça para uma boa adesão dos discos;
Incubar a placa com os discos em estufa bacteriológica a 37oC por 18 a 48 horas;
Resultados: Com o auxílio de uma régua, paquímetro ou dispositivo semelhante, medir o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco, e consultar uma tabela apropriada para determinar se a bactéria em análise é sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano testado.
Precauções e cuidados especiais
-Deixar que os discos atinjam a temperatura ambiente antes do uso (a abertura precoce dos mesmos causa condensação de água no interior do frasco, aumento da umidade e consequente inativação do antibiótico com queda em sua atividade);
-Usar pinças estéreis para manipulação dos discos, nunca as mãos. Cuidar para não utilizar pinça quente, pois os antimicrobianos são termosensíveis;
-Não deixar o frasco desnecessariamente aberto ou por longos períodos em temperatura ambiente (pode haver inativação do produto);
-Seguir padronização técnica para execução da prova e interpretação dos halos do CLSI, conforme preconiza a Anvisa;
-As placas devem ter espessura média de 4mm, não podendo ser inferiores a 3mm ou superiores a 5mm (respectivamente, provocam resultados falsamente aumentados ou diminuídos);
-Inóculos mais carregados (acima do padrão 0,5 da escala Mac Farland) fornecem resultados falsamente diminuídos, enquanto que inóculos mais fracos geram resultados falsamente aumentados;
- A pré-incubação da placa em estufa por 5 minutos após a inoculação com o swab é importante para remover o excesso de umidade, que pode causar a difusão errática do antibiótico após a implantação dos discos;
-O uso de swabs com base de algodão e haste de madeira não são recomendados. Vários trabalhos mostraram que os ácidos graxos naturais presentes no material interferem no crescimento bacteriano;