Eletroforese em determinação de protéinas

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Eletroforese 
Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. Esta técnica é normalmente utilizada para separar proteínas, moléculas de DNA e moléculas de RNA. As moléculas são separadas de acordo com a massa molecular, carga e conformação (BROETTO, et al., 2014). 
O gel (suporte para a migração eletroforética) pode ser de acetato de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida, entre outros. Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie (corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilmente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.
Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bis-acrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônia e tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou riboflavina e TEMED sob luz ultravioleta ou fluorescente (BROETTO, et al., 2014). O TEMED catalisa a liberação de radicais livres de persulfato SO4- que, por sua vez, iniciam a polimerização. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto a Bis-acrilamida tem forma de “T”. Ao misturar-se essas duas moléculas, tem-se a formação de uma “rede” onde diferentes relações entre as concentrações dessas moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. 
De acordo com Esteves (2012) existem variantes da técnica de eletroforese, que podem ser divididas em: eletroforese nativa (em que as proteínas migram de acordo com os três fatores mencionados anteriormente: carga, massa molecular e conformação), zimografia (em que as condições de corrida e de detecção permitem que se detecte uma determinada atividade enzimática) e eletroforese em condições desnaturantes (mais conhecida por SDS-PAGE, em que as proteínas são desnaturadas previamente, sendo separadas apenas de acordo com a sua massa molecular).
Eletroforese de proteínas SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 
SDS-PAGE é o método mais utilizado para análises qualitativas de proteínas. É um método particularmente útil para acompanhar a purificação de proteínas. Sendo um método em que proteínas são separadas segundo o tamanho, a análise de proteínas por SDS-PAGE também é útil para a determinação da massa molecular relativa da proteína. O SDS é um detergente aniônico. Amostras aplicadas no SDS-PAGE são previamente --mercaptoetanol. O fervidas por 5 min em tampão de amostra contendo SDS e mercaptoetanol reduz as pontes de disulfeto que mantém a estrutura terciária de proteínas e o SDS liga-se fortemente à proteína desnaturando-a. As proteínas presentes nas amostras são totalmente desnaturadas através deste tratamento adquirindo uma forma alongada em forma de tubo cercada de várias moléculas de SDS ao longo da cadeia. Em média, uma molécula de SDS liga-se a dois resíduos de aminoácidos.
A estrutura nativa original da molécula é, portanto, completamente rodeada por moléculas de SDS carregadas negativamente. As estruturas alongadas em forma de tubo são mantidas graças às repulsões entre as cargas negativas que recobrem a cadeia polipeptídica, o que impede qualquer dobramento da proteína de volta à sua estrutura tridimensional. O tampão de amostra também contem um corante, o azul de bromofenol, que permite a visualização da corrida eletroforética, e o glicerol, que aumenta a densidade final da amostra, fazendo com que ela permaneça no fundo do pocinho de aplicação.
Uma vez aplicadas todas as amostras, liga-se a fonte de tensão. É importante observar que a amostra não é aplicada diretamente no gel de separação (normalmente em torno de 5 cm) e sim sob uma camada de gel mais poroso (em geral em torno de 0.8-1 cm) conhecido como gel de empilhamento. É neste gel de empilhamento que se produz as cavidades onde são injetadas as amostras. O objetivo do gel de empilhamento é concentrar a amostra da proteína para formar bandas finas antes de entrar no gel de separação. Este objetivo é alcançado utilizando diferenças na força iônica e no pH entre o tampão de eletroforese e o tampão do gel de empilhamento.
O gel de empilhamento possui um poro bem grande (4 % de acrilamida), o qual permite que as proteínas migrem livremente e se concentre sob o efeito do campo elétrico. O efeito de afinamento da banda baseia-se no fato de que íons glicinato ([glicina]-) presentes no tampão de eletroforese possuem uma mobilidade eletroforética menor do que o complexo proteína-SDS ([proteína-SDS] -) o qual por sua vez, possui mobilidade menor que íons cloreto (Cl-) presentes no tampão (loading buffer) e no tampão do gel de empilhamento. Quando a corrente é ligada, todas as espécies iônicas precisam migrar com a mesma velocidade, do contrário elas funcionariam como breque no circuito elétrico.
O complexo proteína-SDS carregado negativamente migra para o ânodo, e como todas as proteínas possuem a mesma carga líquida por unidade de comprimento, elas migram no gel de separação com a mesma mobilidade. No entanto, à medida que eles passam no gel de separação as proteínas de tamanhos diferentes se separam devido às propriedades “peneirantes” do gel. De forma simples, quanto menor a proteína mais facilmente ela passa através dos poros do gel, enquanto proteínas maiores tem sua migração retardada pela força friccional (resistência) resultante do efeito peneira do gel. Sendo uma molécula pequena, o azul de bromofenol é o que migra com mais facilidade indicando a localização da frente da eletroforese.
Quando o corante atinge a extremidade do gel, desliga-se a corrente (fonte de tensão) e o gel então é removido e colocado em uma solução de coloração (normalmente utiliza-se o Coomassie Blue) e depois descolorido utilizando-se uma solução de descoloração. A solução de descoloração remove o corante que não se ligou ao gel, deixando visíveis 6 as bandas de proteínas coradas em azul em um gel transparente. Um minigel leva em torno de 1 h para o preparo, 40 min para a corrida em 200 V e 1 h para coloração em azul de coomassie. Fazendo-se uma descoloração rápida é possível visualizar as bandas em 20 min, porém as bandas são melhor visualizadas após descoloração por uma noite. A massa molecular relativa (Mr ou PM, peso molecular) de uma proteína pode ser determinada comparando-se a mobilidade da proteína com o de padrões de Mr conhecido. Plotando-se um gráfico de log Mr x migração relativa, constrói-se uma curva de calibração (curva padrão) que permite a determinação da Mr da proteína de interesse. A análise por SDS-PAGE é utilizada para acompanhar a purificação de proteína em cada etapa de purificação. Uma proteína pura aparece como uma banda única no gel, a não ser que a proteína seja constituída por duas subunidades de tamanhos distintos. Neste último caso, aparecerão duas bandas no gel, cada uma correspondendo a uma subunidade da proteína.
Detecção de proteínas no gel 
O corante mais comumente utilizado para detectar proteínas em um gel é o Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB). A coloração normalmente é feita com uma solução a 0.1 % de CBB em metanol:água:ácido acético glacial (45:45:10). A mistura ácido-metanol serve como um agente desnaturante que precipita e fixa as proteínas no gel, evitando que as proteínas sejam perdidas no processo de lavagem do gel. A coloração por CBB requer em torno de 0.1 ug (100 ng) de proteína. Quando se requer uma coloração mais sensível que detecte concentrações mais baixas de proteína, utiliza-se a coloração por prata. No processo de coloração o íon de prata (Ag+ ) é reduzido à prata metálica na proteína, onde a prata se deposita formando uma banda de cor marrom. A coloração por prata pode ser utilizada imediatamente após a eletroforese ou depois da coloração com CBB. A coloração por prata é pelo menos 100 vezes mais sensívelque o CBB detectando proteínas em torno de 0.001 ug (1 ng). Outros corantes utilizados são o Sypro Orange (30 ng) e Sypro Ruby (10 ng). 7 Análises quantitativas da proteína podem ser feitas realizando-se um escaneamento por densitometria. Existem vários equipamentos comerciais (Densitômetros, Scanners) que detectam as bandas através do uso de um laser e medindo-se a transmitância. Embora a análise por eletroforese em gel seja um método analítico, em algumas situações ela pode ser utilizada para separar ou purificar proteínas. Neste caso corta-se a banda contendo a proteína de interesse. Em geral esse procedimento é feito para análises que requerem quantidade muito pequena de amostra como, por exemplo, para análises por espectrometria de massas.
CROMATOGRAFIA 
A Cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. 
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando -se diversos critérios, sendo alguns deles listados abaixo: 
Classificação pela forma física do sistema cromatográfico 
 Em relação à forma física do sistema, a cromatografia pode ser subdividi da em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), à cromatografia por centrifugação (Chromatotron) e à cromatografia em camada delgada (CCD), são diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais serão mais bem compreendidos quando classificados por outro critério.
Classificação pela fase móvel empregada 
Em se tratando da fase móvel, são três os tipos de cromato grafia: a cromatografia gasosa, a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC), usando-se na última um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica. A cromatografia líquida apresenta uma importante subdivisão: a cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade, e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na qual se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel. A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia líquida de alta pressão, mas sua atual designação mostra-se mais adequada. No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (C G) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os dois tipos está na coluna. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária. 
Classificação pela fase estacionária utilizada 
Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquida e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente, com fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação. 
 Classificação pelo modo de separação 
 Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos. Dentre os vários tipos de cromatografia, especial ênfase será dada à cromatografia em camada delgada (CCD), à cromatografia líquida clássica e de alta eficiência (C LAE) e à cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).
I CROMATOGRAFIA PLANA 
 Na cromatografia plana, a fase estacionária é suportada sobre uma placa plana ou nos poros de um papel. Nesse caso, a fase móvel desloca-se através da fase estacionária por ação da capilaridade ou sob a influência da gravidade. Útil em separação de compostos polares. Encontra-se bastante difundida devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo. 
 1. Cromatografia em Papel 
 Esta técnica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura a migração diferencial sobre a superfície de um papel de filtro de qualidade especial (fase estacionária). A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de solventes. Este método é muito útil para separar substâncias muito polares, como açúcares e aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se cromatografar poucas quantidades de substância de cada vez. 
Manipula-se o papel com cuidado e pelas pontas, e cortam-se tiras em tamanhos que possam ser contidos nas cubas. É importante cortar o papel seguindo o eixo das fibras, pois a celulose está orientada neste sentido, o que facilitará a passagem da fase móvel. Os líquidos polares terão grande afinidade pelas hidroxilas da molécula de celulose, formando pontes de hidrogênio, ficando retido e funcionando como fase estacionária, e os líquidos menos polares serão repelidos por esta estrutura, funcionado como fase móvel. 
As cubas deverão ser perfeitamente fechadas para permitir a saturação interna. A cromatografia pode ser ascendente ou descendente, sendo que esta última é mais rápida e consome menos eluente. 2cm de altura de eluente na cuba é suficiente para a cromatografia ascendente. Coloca-se a amostra a ser analisada um pouco acima da extremidade inferior do papel seco, que após ter esta extremidade inferior mergulhada numa mistura de solventes, terão os seus constituintes arrastados, juntamente com esta mistura que tende a subir por capilaridade. Os diferentes constituintes apresentarão variação na velocidade de deslocamento, de acordo com os seus coeficientes de partição. Os componentes menos solúveis na fase estacionária (água) terão uma movimentação mais rápida. Pode ser utilizado para análise de mistura de aminoácidos ou misturas de açúcares. A cromatografia em papel pode ser também no sentido descendente e bidimensional, este último realizado em duas etapas com solventes apresentando diferentes propriedades.
2 Cromatografia em Camada Delgada 
A cromatografia em camada fina (ou delgada) é uma técnica simples, barata e muito importante para a separação rápida e análise quantitativa de pequenas quantidades de material. Ela é usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura comparando-os com padrões; acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura.
3. Cromatografia Centrífuga
Cromatografia centrifuga é uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. Baseia-se no principio da operação onde a amostra a ser separada é aplicada como uma solução no centro do disco giratório umedecido com o solvente. A eluição com solvente gera bandas circulares de separação dos componentes que são removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepção. 
III. CROMATOGRAFIA EM COLUNA 
A cromatografia em coluna costuma ser cita da como o mais antigo procedimento cromatográfico. Foi utilizada primeiramente para o isolamento dos pigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais. Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, preenchida com um adsorvente adequado. É uma técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na capacidade de adsorção e solubilidade. O sólido deve ser um material insolúvel na fase líquida associada, sendo que os mais utilizados são a sílicagel (Si O2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó. 
IV. CROMATOGRAFIA GASOSA 
Cromatografia data de 1903 no trabalho do cientista russo Mikhail Semenovich Tswett. O estudante graduado alemão Fritz Prior desenvolveu a cromatografia gasosa de estado sólido em 1947. Archer John Porter Martin, quem foi vencedor do Prêmio Nobel por seu trabalho no desenvolvimento das cromatografias líquido-líquido (1941) e em papel (1944), estabeleceu os fundamentos para o desenvolvimento da cromatografia gasosa e posteriormente produziu a cromatografia gás-líquido (1950). Técnica de separação e análise de misturas por interação dos seus componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel.
Técnica utilizada na Cromatografia Gasosa: 
Uma cromatografia gasosa é um a técnica que se baseia na análise química instrumental por separação de compostos químicos e uma amostra complexa. Uma cromatografia gasosa usa um tubo estreito através do qual se dá o fluxo conhecido como coluna, através do qual diferentes constituintes de uma amostra passam em uma corrente de gás (gás condutor, ou transportador, a fase móvel) em diferentes taxas dependendo de várias propriedades físicas e químicas e suas interações com um específico recheio da coluna, chamada fase estacionária. Como os composto químicos saem no final da coluna, são detectados e identificados eletronicamente. 
A função da fase estacionária na coluna é seperar componentes diferentes, causando a cada um saída da coluna em um tempo diferente (tempo de retenção). Outros parâmetros que podem ser usados para alterar a ordem ou tempo de retenção são a taxa de fluxo do gás condutor e a temperatura. 
Em uma análise CG, um volume conhecido de analito gasoso ou líquido é injetado na entrada da coluna, geralmente com o uso de uma microseringa (ou com fibras de microextração de fase sólida, ou). Conforme o gás carreador leva as moléculas do analito através da coluna, essa movimentação é inibida pela adsorção das moléculas do analito nas paredes da coluna ou no material do empacotamento da mesma. A taxa com que as moléculas progridem ao longo da coluna depende da força da adsorção que, por sua vez, depende do tipo de molécula e do material da fase estacionária. Uma vez que cada tipo de molécula tem uma taxa de progressão diferente, os vários componentes da mistura de analito são separados conforme progridem ao longo da coluna, chegado ao fim dela em momentos diferentes (tempos de retenção). 
Um detector é empregado para monitorar o fluxo de saída da coluna. Assim, o momento em que cada componente sai da coluna, e a quantidade deles, pode ser determinada. Geralmente, as substâncias são identificadas (qualitativamente) pela ordem com que emerger (eluem) da coluna e pelo tempo de retenção do analito na coluna.
As partes de um Cromatógrafo Gasoso: 
A cromatografia é um método físico de separação, no qual componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases: a fase estacionária, e a fase móvel. A amostra é transportada por uma corrente de gás através de uma coluna empacotada com um sólido recoberta com uma película de um líquido. Devido a sua simplicidade, sensibilidade e efetividade para separar os componentes de misturas, a cromatografia de gás é uma das ferramentas mais importantes em química. É amplamente usada para análises quantitativos e qualitativos de espécies químicas e para a determinar constantes termoquímicas tais como, calores de solução e vaporização, pressão de vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de gás é também usada para monitorar os processos industriais de forma automática: analisam-se as correntes de gás periodicamente e realizam-se reações de forma manual ou automática para compensar variações não desejadas.
V. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA 
A cromatografia líquida (HPLC) é um processo de análise de separação físico cuja aplicação permite a análise qualitativa mais comumente e quantitativa de uma amostra. Esse método analítico vem sendo amplamente empregado graças ao rápido tempo de análise. Permite separar constituintes de uma mistura através de sua distribuição em duas fases: fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido. A cromatografia liquida é utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações. 
alto poder de resolução; 
 separações rápidas; 
 monitoramento contínuo do eluente; 
 medidas quantitativas acuradas; 
 análises repetitivas e reprodutíveis com a mesma coluna;
alto poder de resolução; 
 separações rápidas; 
 monitoramento contínuo do eluente; 
 medidas quantitativas acuradas; 
 análises repetitivas e reprodutíveis com a mesma coluna;
 alto poder de resolução; 
 separações rápidas; 
 monitoramento contínuo do eluente; 
 medidas quantitativas acuradas; 
 análises repetitivas e reprodutíveis com a mesma coluna;