Unidade 3

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Instrumentação Científica 
e Tratamento de Dados 
Experimentais 
Responsável pelo Conteúdo:
Prof. Dr. Paulo Cezar Frangiosa
Revisão Textual:
Mateus Gonçalves Santos
Métodos Cromatográficos de Análise
Métodos Cromatográficos de Análise
 
 
• Introduzir conceitos fundamentais sobre os métodos de separação cromatográficos;
• Estudar as diversas combinações de fases móveis e estacionárias;
• Demonstrar a importância do tema, seja na identificação de compostos por meio de padrões, 
purificação ou separação dos componentes de uma mistura;
• Analisar detalhadamente os cromatogramas obtidos em determinações quantitativas 
e qualitativas;
• Exemplificar as aplicações de acordo com situações que impactam em nossas vidas.
OBJETIVOS DE APRENDIZADO 
• Introdução aos Métodos de Separação Cromatográficos;
• Mecanismos de Separação em uma Interface;
• Cromatografia em Coluna;
• Cromatogafia Líquida de Alta Eficiência (CLAE);
• Cromatografia Gasosa (CG);
• Cromatografia com Fluído Supercrítico (CFS).
UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Introdução aos Métodos de 
Separação Cromatográficos 
Definição
De acordo com Vogel (2002), a cromatografia é um método físico-químico que pos-
sibilita a separação dos componentes de uma mistura, por meio da distribuição dos mes-
mos em duas fases, que se encontram em contato íntimo: uma fase móvel, que pode ser 
um líquido, gás ou fluido supercrítico – onde a amostra é dissolvida e forçada através de 
uma fase imiscível, a fase estacionária (fixa na coluna ou em uma superfície sólida). Por 
mecanismos de interação diferencial com a fase estacionária, os componentes presentes 
na mistura deslocam-se com mobilidades distintas (diferenças de adsorção, partição, so-
lubilidade, pressão de vapor, tamanho molecular ou densidade de carga iônica). 
A Figura 1 representa a separação dos componentes de uma mistura dissolvida na 
fase móvel, por diferentes interações com a fase estacionária (sólida ou líquida).
Figura 1 – Migração diferencial dos componentes de uma mistura
Fonte: Wikimedia Commons
Como consequência dessas migrações diferenciadas, os vários componentes da mistura se 
separam em bandas discretas, podendo ser analisados qualitativamente ou quantitativamente.
Um Pouco de História
Há relatos do emprego dos métodos de separação durante quase toda a história da hu-
manidade: a Bíblia descreveu atividades como a remoção de contaminantes por filtração 
em areias ou de excesso de sal por contato com certos tipos de folhas; trabalhos antigos, 
tanto gregos como egípcios, retrataram separações de ativos de raízes e folhas de plantas. 
Os alquimistas empregaram uma série de métodos de separação, como destilação, extra-
ção por solvente e amalgamação. Os efeitos resultantes da “adsorção” foram descritos no 
século XVI para um processo de preparação de vinho branco a partir de vinho tinto.
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A partir do século XIX, pesquisadores começaram a utilizar diferentes tipos de mate-
riais sólidos para “filtração”, remoção de alguns componentes ou ainda fracionamento 
de líquidos, enquanto outros fizeram esses fracionamentos em papel.
O químico e físico alemão-suiço Christian F. Schöenbein e o químico suíço Friedrich 
Goppelsroeder introduziram, na metade do século XIX, separações feitas em tiras de 
papel mergulhadas em solventes, aplicando um tipo de desenvolvimento ascendente e 
supuseram que a subida observada seria uma consequência da “ação capilar”, similar à 
ascendência de seiva em uma árvore. 
Estudos independentes de Thompson e Way, publicados em 1850, mostraram uma es-
pécie de troca iônica, na qual amônia era substituída por íons potássio durante a passagem 
de urina de vacas através de um zeólito natural. Em 1893, Reed aplicou colunas contendo 
caulim como fase estacionária e água como fase móvel na separação de sais inorgânicos.
Day, nos Estados Unidos, e Engler e Albrecht, na Alemanha, utilizaram colunas 
preenchidas com um produto natural à base de silicato de alumínio e magnésio para 
fracionar amostras de petróleo. 
Em 1906, os termos cromatografia, cromatograma e método cromatográfico 
foram introduzidos pelo botanista russo Mikhail Semenovich Tswett, quando realizou 
trabalhos descrevendo a separação dos componentes de extratos de folhas e gema de 
ovo. Ele usou colunas de vidro empacotadas com vários sólidos finamente divididos, 
arrastando os componentes com éter de petróleo. Observou que os componentes dos 
materiais analisados surgiam como bandas coloridas na coluna de separação – dando 
origem ao nome da “cromatografia” (do grego chroma = cor, e graphein = escrever) 
– embora, de fato, tal processo de separação seja independente da cor, a não ser para 
visualizar os componentes separados.
Os anos seguintes foram marcados pelo pouco interesse por essa técnica de separação 
de substâncias, até que, na década de 30, a cromatografia ressurgiu em pesquisas de Kuhn e 
Lederer, quando separaram e identificaram xantofilas da gema do ovo, por meio de colunas 
preenchidas com carbonato de cálcio finamente dividido e éter de petróleo como fase móvel.
A década de 40 foi marcada por grandes avanços: em 1941, Archer Martin e Richard 
Synge descreveram a cromatografia por partição (líquido/líquido), antecipando o surgimento 
das cromatografias gasosa e de alta eficiência; Hesse, nesse mesmo ano, foi o pioneiro em 
descrever a cromatografia gás/sólido, ao separar ácidos graxos a 100°C, arrastando-os so-
bre sílica, com CO2; Golay introduziu as colunas capilares, elevando a cromatografia gasosa 
ao patamar de método analítico mais utilizado mundialmente.
Os anos 50 destacam-se pelos trabalhos de Lerman e colaboradores que, em 1951, 
realizaram as primeiras experiências em cromatografia por bioafinidade, separarando 
anticorpos em coluna preenchida com celulose, contendo antígenos específicos. Adams 
e Holmes sintetizaram as primeiras resinas de troca iônica, à base de fenil e formaldei-
do para cátions, enquanto Cohn empregou resinas de poliestireno-divinilbenzeno na 
separação de aminoácidos. Aperfeiçoamento no método foi feito por Moore e Stein, ao 
utilizarem bombas peristálticas para empurrar a fase móvel, além de um fotômetro para 
detectar os componentes eluídos.
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Os desenvolvimentos da década de 60 iniciam-se com a equipe de Nickless, que 
introduziu as fases estacionárias contendo grupos alquila quimicamente ligados ao su-
porte – o que possibilitou a aplicação da cromatografia por fase reversa. Paralelamente, 
Scott e Novotny desenvolveram as colunas capilares. Em 1962, Klesper, Gouw e Jentoft 
obtiveram êxito com fluído supercrítico como fase móvel em cromatografia a gás (mas 
somente em 1983 o primeiro equipamento para cromatografia com fluído supercrítico, 
SCF, foi comercializado!). Porath e Flodin surgem como os precursores da cromatografia 
por exclusão, ao desenvolverem gel de dextrano entrecruzado.
Você Sabia?
Entre os anos de 1937 e 1972 um total de doze Prêmios Nobel foram entregues a pesqui-
sadores pelos seus trabalhos sobre cromatografia!
Classificação dos Métodos Cromatográficos
Diversos critérios são frequentemente utilizados para a classificar as diferentes moda-
lidades de cromatografia. Em geral, relacionam-se com a técnica empregada, o mecanis-
mo de separação e o tipo de fases utilizado.
A forma física do sistema define a técnica: se a fase estacionária for colocada em um 
tubo cilíndrico, temos a cromatografia em coluna; se for disposta sobre uma superfície 
plana, a cromatografia planar. 
A Figura 2 mostra que a cromatografia planar divide-se em Cromatografia em Papel 
(CP) e Cromatografia em Camada Delgada (CCD), enquanto que a cromatografia em 
coluna se divide em Cromatografia Líquida, Cromatografia com Fluído Supercrítico e 
Cromatografia Gasosa. Os critérios de separação definem as subdivisões.
Figura 2 – Representação esquemática dos diferentes tipos de cromatografia
Fonte: usp.br
Vogel (2002) estima que apenas 20% dos produtos químicosconhecidos são suficiente-
mente estáveis e voláteis para serem separados via cromatografia em fase gasosa. Os demais 
80% podem, a princípio, ser separados por cromatografia líquida ou eletroforese. 
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Importância e Aplicações
Via de regra, uma análise cromatográfica é realizada com propósitos analíticos ou 
preparativos. Assim, independentemente da escolha da técnica, separações confiáveis, 
reprodutíveis e eficientes só serão obtidas se o analista for capaz de controlar as con-
dições das fases móvel e estacionária: pequenas mudanças de composição química ou 
temperatura podem gerar grandes mudanças no processo de separação.
Destacam-se quatro macro áreas onde os métodos cromatográficos são frequente-
mente empregados com sucesso:
• Análises: a técnica permite examinar a mistura, seus componentes, bem como 
suas inter-relações;
• Identificação: útil na determinação da identidade de uma mistura ou de seus compo-
nentes, com base na comparação de referências com comportamentos conhecidos;
• Purificação: possibilita a separação dos componentes de uma mistura, com a fina-
lidade de isolar uma determinada substância de interesse para estudos posteriores;
• Quantificação: a técnica possibilita a determinação da concentração de um com-
ponente específico presente na amostra.
Mecanismos de 
Separação em uma Interface
Os processos descritos a seguir estão relacionados à diferença de afinidade dos ana-
litos em relação às duas fases em contato - móvel e estacionária – de modo que a sepa-
ração ocorrerá na interface entre essas fases.
Vogel (2002) nos lembra que a correta escolha do método de separação usualmente é fei-
ta com base na sensibilidade, velocidade de obtenção dos resultados ou, até mesmo, na dis-
ponibilidade de equipamentos e materiais, sendo muito importante a experiência do analista. 
Os cinco mecanismos de separação descritos a seguir podem ser empregados na fase 
líquida. Na cromatografia com fase gasosa, apenas a adsorção e a partição são possíveis.
Adsorção
Primeira das técnicas cromatográficas usada sistematicamente, a adsorção é prova-
velmente o mecanismo mais conhecido. Particularmente útil na separação de compos-
tos orgânicos não voláteis, em solventes não polares ou pouco polares, traduz-se como 
sendo um fenômeno físico-químico através do qual um sólido (adsorvente) fixa em sua 
superfície um líquido ou um gás, por meio de interações dipolo-dipolo, forças de Van 
Der Waals ou pontes de hidrogênio. 
Ewing (1972) destaca o exemplo do carvão ativo, usado nos exaustores de fogão nas 
residências, para adsorção de gases e vapores, removendo os odores provenientes do 
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
preparo de alimentos. Outros adsorventes muito empregados são a sílica ou sílica gel –
uma forma hidratada de dióxido de silício com área superficial muito grande (SiO2xH2O) 
– e o óxido de alumínio (Al2O3xH2O), mais conhecido como alumina.
Em virtude das fortes interações entre o analitos e o adsorvente, dificultando sua des-
sorção, o uso da adsorção em cromatografia torna-se difícil ou pouco confiável. Ainda 
assim, esta técnica de separação é usada em cromatografia líquida e em cromatografia 
com fase gasosa. 
Partição
Este mecanismo de “distribuição”, muito utilizado em separações cromatográficas, 
baseia-se na solubilidade relativa do soluto nas duas fases imiscíveis (móvel e estacio-
nária): os componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos por 
ela, enquanto os menos solúveis são conduzidos mais rapidamente pela fase móvel. 
Duas situações emergem:
• Fase Normal: fase estacionária polar (água ou trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica 
ou alumina) e fase móvel apolar (hexano ou éter isopropílico). O componente menos 
polar elui primeiro, uma vez que apresenta maior solubilidade na FM;
• Fase Reversa: fase estacionária apolar (hidrocarboneto tipo C-18) e fase móvel 
é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila). O componente mais polar elui 
primeiro por apresentar maior solubilidade na FM.
Figura 3 – Cromatografia por partição
Fonte: Reprodução
A partição é o mecanismo de separação mais comum em cromatografia com fase 
gasosa: o processo implica a partição do soluto entre uma fase móvel gasosa e uma fase 
estacionária líquida, depositada sobre pequenas partículas em colunas empacotadas ou 
ligadas quimicamente às paredes internas de uma coluna capilar. 
A solubilidade relativa dos analitos entre uma fase móvel líquida e uma fase estacio-
nária faz com que o processo de partição tenha destaque na Cromatografia Líquida de 
Alta Eficiência (CLAE), uma vez que a fase estacionária é normalmente ligada a um su-
porte inerte, evitando problemas de sua dissolução na fase móvel (fenômeno que rapida-
mente inutilizaria a coluna, levando a não reprodutibilidade nas separações repetitivas!).
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Em Síntese
Uma regra simples que funciona na cromatografia de partição é: “semelhante separa se-
melhante”. Assim, materiais não polares dissolvem-se e são separados em fases não po-
lares, enquanto que materiais polares requerem fases estacionárias ainda mais polares.
Troca iônica
Por “troca iônica” entende-se o fenômeno da troca de íons, de mesmo sinal, entre uma 
solução e um material insolúvel em contato com ela. A eficácia da separação é função da 
estrutura molecular da fase estacionária sólida que deve ser aberta e permeável, de modo 
que os íons e as moléculas do solvente possam circular com liberdade através dela: é a 
resina de troca iônica.
As resinas de troca iônica consistem em complexas substâncias orgânicas altamente 
polimerizadas, com elevada densidade de ligações cruzadas (para que não haja sua so-
lubilidade), contendo grande número de grupos ácidos ou básicos. Insolúveis em água, 
tais resinas apresentam grupos ativos hidrofílicos, apresentando diferentes graus de afi-
nidade com solutos iônicos. 
A cromatografia de troca iônica só ocorre na fase líquida: os íons da fase móvel 
ligam-se temporariamente aos contra-íons imobilizados na fase estacionária (a resina de 
troca iônica) de onde podem ser seletivamente deslocados por eluição com um tampão 
de força iônica crescente. O mecanismo ilustrado na Figura 4 é de fácil compreensão: 
quando uma resina aniônica trocadora de cátions (possuindo íons móveis tipo R+) entra 
em contato com uma solução que contém cátions S+, estes últimos penetram pela estru-
tura da resina substituindo as posições dos cátions R+, que, por sua vez, passam para a 
solução até que seja alcançado um equilíbrio. Processo análogo ocorre para o mecanis-
mo de troca iônica das resinas catiônicas.
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
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n
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SO
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n
Na+
SO
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n
Na+
SO
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n
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SO
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n
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SO
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n
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SO
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n
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SO
O–O
n
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SO
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n
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SO
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n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
SO
O–O
n
Na+
S+
S+R+
R+
Figura 4 – Mecanismo de troca iônica: resina aniônica trocadora 
de cátions tipo poliestireno Sulfonado: R+ = Na+
A cromatografia iônica pode ser usada para a separação de ânions ou de cátions, 
independentemente do tamanho dos íons, mas atualmente sua maior utilidade analítica 
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
está na separação e determinação dos ânions mais comuns (F–, Cl–, Br–, I–, NO2
–, NO3
–, 
SO4
2–, PO4
3–, etc.) em água, bem como de cátions e ânions em alimentos.
Figura 5 – Separação de vários metais de transição em resina 
aniônica eluída com HCl sucessivamente diluído
Fonte: EWING, G.W., 1972, p. 407
As técnicas de troca iônica podem ser adaptadas para uso em CLAE, onde se escolhem 
partículas de resina sintética suficientemente pequenas para tornar eficiente a coluna.
Permeação em Gel
Também conhecida como cromatografia de exclusão molecular (CE ou SEC), filtra-
ção em gel ou peneira molecular, a permeação em gel é um mecanismo relativamente 
simples: oscomponentes da amostra em solução são separados segundo seus tamanhos 
efetivos. A fase estacionária é um material polimérico, o gel, que dependendo de sua 
rigidez, do tipo de fase móvel, das pressões de trabalho e do tamwanho do material 
que deverá ser separado, pode pertencer a uma das classes ilustradas na Tabela 1. 
O solvente faz com que as partículas do gel inchem consideravelmente – o que é uma 
das características intrínsecas desse tipo de “recheio”.
Tabela 1 – Principais tipos de recheios para SEC
Nome comercial Classe Rigidez
Tipo de fase 
móvel
Pressões de 
trabalho
Usos
Sephadex(1) dextrano (carboi-drato polimérico)
Não rígidos
Aquosas
Inferiores a 3 bars CE Clássica
Sepharose 
Bio Gel A
poliagaroses
Sephacryl(2)
Bio-Gel P
poliacrilamida Aquosas ou não aquosas
Ultrastyragel
Copolímero 
de estireno 
e divinilbenzeno
Semirrígido Aquosas ou não aquosas 100 a 150 bars CE Clássica e CLAE
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Nome comercial Classe Rigidez
Tipo de fase 
móvel
Pressões de 
trabalho
Usos
– Sílica porosa ou vidro poroso Rígido
Aquosas ou 
não aquosas Pressões elevadas CLAE
(1) Sephadex (Figura 6): pode ser produzida com tamanhos diferenciados de poros, originando “peneiras moleculares” capazes de 
separar moléculas de massas molares a partir de 700 até cerca de 600.000 g/mol! 
(2) Bio-Gel P (Figura 7): pode separar moléculas de massas molares a partir de 1.800 até cerca de 400.000 g/mol!
Os outros polímeros mencionados na tabela anterior apresentam classificações com-
paráveis.
Figura 6 – Estrutura Parcial de Sephadex
Fonte: VOGEL, ,2002, p. 132
CH2
CH2
HN NH
NH
O=C C=O
C=O
CH CH CH
CH CHCH
OH
HO
OH
CH2
CH2
CH2
CH2
O
O
O
CH2 CH2
CH2
CH2
CH2n
O
C=O
NH
OH
HO
OH
CH2
O
O
HO
OH
CH2
O
O
HO OH
CH
2
CH
2
O
O
O
HO OH
O
CH
2
O
O
HO OH
CH
2
CH
2
O
O
Figura 7 – Estrutura Parcial de Sephacryl
Dependendo do material empregado como fase estacionária, identificam-se limites 
que determinam os intervalos de tamanhos de moléculas que podem ser separadas: 
limite de permeação é aquele abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho 
são igualmente retidas nos poros do material; limite de exclusão é aquele acima do qual 
todas as moléculas são muito grandes, de modo que nenhuma delas penetra nos poros 
da fase estacionária, sendo totalmente eluída junto à fase móvel. 
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Tabela 2 – Comparação das propriedades dos recheios: Sephadex e Bio-Gel P
Sephadex(1)
Limite de exclusão 
(massa molar)
Bio-Gel P(2)
Limite de exclusão 
(massa molar)
G10 700 P-2 1.800
G15 1.500 P-4 4.000
G25 5.000 P-6 6.000
G50 30.000 P-10 20.000
G75 80.000 P-60 60.000
G100 150.000 P-100 100.000
G150 300.000 P-250 200.000
G200 600.000 P-300 400.000
(1) Amersham Biosciences, comercializado pela GE Healthcare;
(2) Bio-Rad.
Fonte: Adaptada de usp.br
É lógico concluirmos que as moléculas apresentando tamanhos intermediários entre 
esses dois limites serão separadas: as moléculas grandes são sempre eluídas primeiro, 
seguindo-se sucessivamente as moléculas cada vez menores. Isto acontece porque as 
moléculas pequenas podem penetrar mais profundamente nos orifícios do gel e são 
mais fortemente retidas do que as moléculas maiores, que não podem fazer o mesmo.
Figura 8 – Cromatografia por exclusão: mecanismo e cromatograma
Fonte: Adaptada de Wikimedia Commons
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Temos:
VT = V0 + Vi
Onde:
• VT = volume total da fase móvel;
• V0 = volume intersticial (fora dos poros, entre as partículas);
• Vi = volume intrasticial (dentro dos poros).
Bioafinidade
Mecanismo de separação químico, usado apenas na fase líquida, a bioafinidade sim-
plificou muito a separação e a determinação de misturas biológicas, consideradas de di-
fícil separação. Técnica instrumental de separação mais seletiva dentre todas as estuda-
das, baseia-se em mecanismos muito específicos de interações entre a fase estacionária 
e determinados solutos: é o chamado efeito “chave-fechadura” (Figura 9).
Normalmente resultantes de reações enzimáticas ou de anticorpo-antígeno, tais in-
terações podem ter seletividade muito elevada para um determinado tipo de moléculas, 
como as proteínas em misturas complexas. 
Os anticorpos são extremamente específicos em suas reações com antígenos, sen-
do essa característica aproveitada na cromatografia por bioafinidade. No processo, um 
anticorpo imobilizado na matriz cromatográfica (por meio de ligação covalente) pode 
reagir com uma determinada proteína (antígeno) em uma mistura contendo centenas 
de proteínas, ligando-a à coluna. As proteínas que não interagem quimicamente com a 
coluna segundo o mecanismo chave-fechadura, são removidas, retendo-se apenas a de 
interesse. Uma mudança na força iônica do eluente libera a substância desejada, que é 
finalmente coletada.
Figura 9 – Mecanismo de bioafinidade: chave-fechadura
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Apesar de possuir elevadas sensibilidade e resolução, bem como elevada capacidade 
de purificação, uma vez que as fases estacionárias contêm um material biologicamente 
ativo, é uma técnica relativamente cara. 
Tabela 3 mostra outras substâncias com possibilidade de separação via cromatografia 
por bioatividade.
Tabela 3 – Relação biológica por bioatividade
Substância a ser isolada Substâncias imobilizadas na matriz
Enzimas Substratos, co-fatores, inibidores competitivos
ácidos nucléicos Sequência de bases complementares, histonas, enzimas específicas
Hormônios e vitaminas Proteínas transportadoras, receptores
Anticorpos Antígenos, células
Lectinas Glicoproteínas, polissacarídeos
Células Lectinas, proteínas específicas da superfície da célula
Proteínas em geral Corantes, íons metálicos
Fonte: Adaptada de usp.br
Cromatografia em Coluna
A cromatografia em coluna baseia-se na polaridade relativa das moléculas que estão 
sendo analisadas: fases estacionárias sólidas envolvem mecanismos de separação por 
adsorção; fases estacionárias líquidas, partição.
Figura 10 – Cromatografia em Coluna
Fonte: Adaptada de usp.br
Fase Móvel Líquida
Neste grupo, estão todos os mecanismos de separação estudados anteriormente: 
adsorção, partição, troca iônica, permeação em gel e bioafinidade. Subdivide-se em:
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC): colunas de vidro, sob pressão atmosférica 
e vazão da fase móvel por ação da gravidade;
• Cromatofrafia Líquida de Alta eficiência (CLAE ou HPLC): colunas metálicas 
ou capilares, sob pressões elevadas. 
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Cromatogafia Líquida 
de Alta Eficiência (CLAE)
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), também conhecida como HPLC 
(High Performance Liquid Cromatography), desenvolveu-se significativamente a partir 
dos anos 70, e desde então vem apresentando novos avanços tecnológicos: utilização de 
colunas preenchidas por partículas diminutas; desenvolvimento e aperfeiçoamento de 
vários detectores, como espectrofotômetros de massa acoplados ao HPLC.
Utiliza-se coluna fechada, reaproveitável, de modo que uma única coluna pode rea-
lizar centenas de separações individuais, com baixa perda de carga para a fase móvel. 
Sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) são requeridos para que a fase móvel 
migre a uma velocidade razoável.
Como diferenciais, a CLAE apresenta capacidade de realizar separações e análises 
quantitativas de uma grande quantidade de compostos  presentes em vários tipos de 
amostras, em poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade, sendo nor-
malmente empregada em amostras de alimentos, água, solo, sangue e urina.
A Figura 11 traz uma representação esquemática de um equipamento típico para CLAE. 
Figura 11 – Representação esquemática de um equipamento para CLAE
A fase móvel é desgaseificada por aquecimento com agitação, borbulhamento de gás 
hélio, ultrassom ou vácuo – evitando a formação de bolhas. O sistema de bombeamento, 
resistente à corrosão, foi o fator mais importante para o desenvolvimento da CLAE: a 
bomba, controlada por um microprocessador,é capaz de gerar pressões de até 6.000 
psi, com velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min.
O principal detector utilizado nessa técnica é o espectrofotométrico (UV e Visível). 
Além dele, temos o de índice de refração (RI); fluorescência (FD); espalhamento de luz 
(ELSD); espectrometria de massas (MS), além de detectores eletroquímicos.
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Figura 12 – Separação de Aminoácios em coluna de troca iônica por CLAE
Fonte: AMORIM, 2019, p. 56
Cromatografia Gasosa (CG)
Definição e Princípios Gerais
Em 1951, Martin e James realizaram os primeiros experimentos que podem ser 
classificados como CG, quando separaram ácidos graxos de baixo peso molecular. Uma 
vez que a maior parte da teoria já havia sido desenvolvida uma década antes por Martin e 
Synge – que estudaram a cromatografia de partição em fase líquida – rapidamente a técnica 
se desenvolveu, de modo que o primeiro cromatógrafo comercial chegou ao mercado em 
1955. M. Golay foi o precursor da cromatografia gasosa capilar no ano de 1956.
Atualmente, essa técnica é a mais extensivamente utilizada para fins analíticos, pois 
apresenta vantagens como:
• Elevada resolução: é possível separar misturas complexas contendo até 200 com-
postos muito semelhantes;
• Alta velocidade de análise: maior parte das análises entre 5 e 50 minutos;
• Alta sensibilidade: detecção em escala de nanogramas (10–9g) a picogramas (10–12g);
• Ótima exatidão: erros relativos entre 0,1 e 1%.
A CG comporta amostras sólidas, líquidas ou gasosas, bem como compostos orgâni-
cos ou inorgânicos. A única exigência da técnica é que os analitos precisam ser voláteis 
e apresentem certa estabilidade na temperatura necessária para que o vapor seja produ-
zido (pontos de ebulição de até 300°C). Estas limitações reduzem a 20% dos produtos 
químicos conhecidos, aqueles que podem ser analisados por esta técnica. 
Importante destacar que amostras “sujas” precisam de tratamento prévio e normalmente 
requerem a utilização de um equipamento complementar (Espectrômetro de Massas, EM) 
para confirmação da identidade do analito. Dessa forma, Ewing (1972) aponta que sua maior 
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utilidade é para fins qualitativos ou semi-quantitativos. Entretanto, com cuidadosa calibração 
e experiência do analista, medidas quantitativas podem ser realizadas com sucesso.
Na cromatografia com fase gasosa (CG), separa-se uma mistura em seus componentes 
fazendo-se mover um gás sobre um adsorvente estacionário. Duas possibilidades existem: 
ou a fase estacionária é um sólido (CGS) ou um líquido (CGL), o que limita os mecanismos 
de separação à adsorção e à partição. Atualmente não se faz a distinção e esta termino-
logia foi substituída pelo termo geral cromatografia com fase gasosa (CG).
Tabela 4 – CG: Mecanismo de adsorção e partição
Parâmetro analisado Cromatografia gás-sólido (CGS) Cromatografia gás-líquido (CGL)
Fase Móvel (FM) Gás: H2, He e N2 Gás: H2, He e N2
Fase Estacionária (FE)
Adsorvente sólido: sílica gel, carvão 
ativo, alumina, peneira molecular 
(argila microporosa), copolímero 
estireno-divinilbenzeno.
Líquidos de alto ponto de ebulição: 
poliésteres e poliglicóis (polares), 
silicones (polisiloxanas), parafinas 
(apolares), sobre um suporte sólido.
Fenômeno físico-químico responsável 
pela interação do analito com a FE Adsorção Partição
Aplicações
• Identificação e/ou quantificação de compostos em laboratórios forenses, visando a 
elucidação de crimes contra a pessoa ou patrimônio;
• Na indústria farmacêutica, tanto no controle de impurezas presentes em matérias-
-primas quanto no controle da qualidade de produtos acabados;
• Na água, detectando a presença de compostos halogenados, bem como os níveis 
de contaminação por pesticidas (amostras de água e solo);
• Análise do perfil de ácidos graxos de amostras de origem vegetal ou animal;
• Transformação de biomoléculas a partir de derivados voláteis: teores de álcoois, gor-
duras, carboidratos, aminoácidos, enzimas e ácidos nucleicos podem ser avaliados.
Aparelhagem
A Figura 13 ilustra esquematicamente as partes principais de um cromatógrafo a gás.
Figura 13 – Representação esquemática de um cromatógrafo a gás
Fonte: Adaptada de Wikimedia Commons
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Suprimento de Gás de Arraste (Cilindro de Alta Pressão)
O gás de arraste fica contido em cilindros sob alta pressão. Além do reservatório, são 
necessários reguladores de pressão e medidores de vazão para controlar e medir o fluxo 
de gás (300 e 900 ml/min), além de dispositivos de purificação (“traps”).
Como requisitos, a fase móvel em CG deve ser inerte, ou seja, não pode interagir 
com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento: ela apenas carrega a 
amostra através da coluna. Além disso, precisa ser isenta de impurezas que possam 
degradar a fase estacionária. 
Cada detector demanda um gás de arraste específico para seu melhor desempenho: 
detector de condutividade térmica (DCT) utiliza He e H2; detector de ionização de chama 
(DIC ou FID), N2 e H2; detector de captura de elétrons (DCE) emprega N2 (super seco), 
e mistura de Ar + 5% de CH4. 
Sistema de Injeção da Amostra
Dos diversos dispositivos de introdução da amostra desenvolvidos, os mais comuns 
envolvem a introdução de amostras líquidas com uma microsseringa (capacidades típi-
cas de 1 μL, 5 μL e 10 μL) em um bloco de metal aquecido, posicionado na entrada da 
coluna (Figura 14). 
A temperatura do bloco deve ser suficiente para que a amostra líquida se vaporize 
rapidamente sem decomposição ou fracionamento. 
Amostras sólidas podem ser dissolvidas em solventes adequados, enquanto as gaso-
sas (0,5 a 10 ml) podem ser injetadas segundo o mesmo procedimento, mas a seringa 
de gás deve ser capaz de resistir à pressão existente na entrada da coluna.
Figura 14 – Sistema de Injeção “On-Column”
Fonte: Adaptada de ufsj.edu.br 
1. Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna;
2. Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna;
3. “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
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Coluna Cromatográfica
Uma vez injetada e vaporizada, a amostra é introduzida na coluna cromatográfica, 
onde ocorre a separação. A natureza da fase estacionária sólida, o tipo e quantidade 
da fase líquida, o método de empacotamento, o tamanho da coluna e a temperatura 
são fatores importantes para a resolução desejada. Dividem-se em dois grupos, como 
ilustrado na Figura 15:
• Colunas Recheadas ou Empacotadas: São tubos de 0,5 a 5 metros de com-
primento e 2 a 6 mm de diâmetro interno feitos de vidro pirex, metal (alumínio, 
aço inoxidável ou cobre) ou plásticos resistentes a temperaturas elevadas (PTFE). 
A fase estacionária sólida (finamente granulada) é depositada sobre suporte líquido 
ou sólido, inertes;
• Colunas Capilares: Tubos de sílica fundida, vidro pirex, aço inox ou Nylon, pos-
suem entre 5 a 100 metros de comprimento e 0,1 a 0,5 mm de diâmetro interno. 
A FE é sólida granulada ou líquida, depositada sobre as paredes internas, inertes.
Figura 15 – Colunas para CG: 1A e 1B: recheadas ou empacotadas; 2: capilares
Fonte: Adaptada de usp.br 
Para minimizar a perda de material da FE líquida por volatilização, durante o uso, o 
material do recheio normalmente é constituído por cadeias poliméricas, entrecruzadas 
ou presas ao suporte por ligações químicas. Idealmente, as FE devem apresentar as 
seguintes características:
• Amplo intervalo de temperatura de uso: otimiza a separação;
• Boa estabilidade térmica e química: não reagindo com os componentes da amostra, 
seu tempo de vida útil aumenta;
• Pouco viscosa: menor resistência ao processo de distribuição do analito entre as 
FM e FE;
• Elevado grau de pureza: reprodutibilidade dos resultados.
A escolha da coluna adequada a determinada separação pelo analista pode ser comple-
xa. Entretanto, a ideia básica de que “coisas parecidas separam coisas parecidas” funciona 
bem para colunascapilares (estamos nos referindo à polariadade do analito e da FE). Ain-
da, colunas longas apresentam tempos de eluição também longos, além de alta resolução 
dos picos cromatográficos. Menores diâmetros levam a uma maior eficiência. 
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Figura 16 – Separação de Vinte Fenóis em Coluna Capilar
Fonte: ufjf.br
Você Sabia?
O uso das colunas capilares só se generalizou após a introdução das colunas de sílica 
fundida ou quartzo, em 1979. Muitos laboratórios fazem mais de 90% de seu trabalho 
usando seis colunas diferentes ou menos!
Forno
Características desejáveis em um forno para CG: 
• Uniformidade da temperatura: utilização de sistemas de ventilação interna;
• Intervalo amplo de temperaturas: entre temperatura ambiente até 400°C. (siste-
mas criogênicos podem ser utilizados quando se requer temperaturas menores que 
a ambiente);
• Isotérmico ou com programação linear de temperatura;
• Acesso fácil à coluna: agiliza o processo de substituição pelo analista;
• Aquecimento e resfriamento rápidos: análises de rotina;
• Temperatura estável e reprodutível: exatidão e precisão de +/- 0,1°C.
Detectores
Posicionado na saída da coluna, a função do detector é registrar e medir as pequenas 
quantidades dos componentes da mistura que foram separados na coluna. O sinal de 
saída do detector alimenta um dispositivo que resulta num gráfico, o cromatograma. 
A escolha do detector depende de fatores como o nível de concentração e a natureza 
dos componentes da mistura. Os detectores mais usados na CG são os de condutividade 
térmica, ionização de chama e captura de elétrons.
• Detector por Condutividade Térmica (DCT): Usando um filamento metálico 
aquecido ou um termistor (um semicondutor de óxidos de metais fundidos), o DCT 
responde às mudanças na condutividade térmica para todas as substâncias (uni-
versal), exceto ao gás de arraste (He ou H2), porque sua condutividade térmica é 
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superior à dos demais gases. Sua sensibilidade (mínimo detectável) é de cerca de 
10–5 g.s–1 (EWING, 1972);
• Detector por Ionização de Chama (DIC ou FID): Baseia-se na queima do ar do 
efluente da coluna, misturado com H2 e ar, gerando uma chama de energia suficiente 
para ionizar as moléculas de soluto (de potenciais de ionização baixos). Os íons produ-
zidos são coletados por eletrodos e a corrente iônica produzida é medida. Responde 
a hidrocarbonetos. Não responde a H2, He, N2, O2, CO, CO2, H2O, NH3, NO, H2S, 
SiF4. Sua sensibilidade (mínimo detectável) é de cerca de 10
–11 g.s–1 (EWING, 1972).
A Figura 17 traz a separação de pesticidas em FE líquida (polisiloxana), injetando-se 
2μL de amostra sob gradiente de temperatura, tendo FID como detector.
Figura 17 – Separação de pesticidas em coluna CP-Sil 5, gás de arraste: 
He; temperatura da coluna: 195ºC (6,5 min)/195ºC a 275°C(10°C/min)
Fonte: professor.ufop.br
• Detectores por Captura de Elétrons (DCE): Usa-se uma fonte de elevada energia 
(raios β) para gerar elétrons “lentos” por ionização do gás de arraste pelo detector 
(preferencialmente N2). Os elétrons assim gerados migram para o anodo e geram 
uma pequena corrente. A resposta do detector relaciona-se à afinidade das molé-
culas do eluato. É seletivo, respondendo a compostos que contêm halogênios ou 
enxofre, anidridos, compostos em que a carbonila está conjugada, nitritos, nitratos 
e compostos organometálicos. Não responde a hidrocarbonetos, álcoois e cetonas. 
Sua sensibilidade (mínimo detectável) é de cerca de 10–14 g.s–1 (EWING, 1972).
Análise Qualitativa
Baseada nos tempos de retenção do analito:
Figura 18 – CG: Análise Qualitativa
Fonte: Adaptada de Wikimedia Commons
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Onde:
• tR = tempo de retenção do soluto;
• tM = tempo morto: tempo que a FM leva para percorrer a coluna;
• tR’ = tempo de retenção corrigido ou tempo que o soluto passa na FE: tR – tM.
Se “k” representa a intensidade de interação do soluto com a FE, este fator pode ser 
utilizado para a identificação do mesmo, se comparado com o obtido pela injeção de pa-
drões do soluto puro. A expressão matemática do fator de retenção é então dada por:
K � �t t
t
R M
M
��
Para dois solutos (1 e 2), podemos definir o fator de separação, “α”, como sendo 
a relação entre os fatores de retenção de dois picos de solutos adjacentes: quanto mais 
longe o valor do fator de separação for do valor unitário, maior será a distância entre os 
valores máximos entre os picos adjacentes. Matematicamente, temos:
� � �
�
�
k
k
t t
t t
R M
R M
2
1
2
1
Para garantir uma boa separação, o valor ideal de “k” deve estar entre 2 e 6, enquanto o “α” 
ideal deverá estar entre 1,05 e 1,20!
Análise Quantitativa
Baseia-se na medida da área e da altura do pico de um dado componente. Essa área 
pode ser determinada tanto por técnicas geométricas (triangulação manual) quanto por 
integração automática (programas computacionais). 
Usa-se a relação da concentração do analito com a área do pico analítico: normaliza-
ção (a resposta do detector é função apenas da concentração); padrão interno (adiciona-
-se uma pequena quantidade conhecida de uma substância de referência à amostra a ser 
analisada, antes da injeção na coluna, obtendo-se uma curva de calibração); padrão ex-
terno (injeta-se uma solução contendo padrões de todas as substâncias a serem analisadas, 
com concentrações próximas à da amostra nas mesmas condições analíticas).
A resolução dos picos cromatográficos reflete o grau de perfeição com que dois pi-
cos são separados, considerando a contribuição de dois parâmetros: a seletividade e a 
eficiência da coluna. Quanto maior a seletividade, mais os picos afastam-se (dado pelo 
fator de separação, “α”); uma eficiência maior acarreta picos mais estreitos. 
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Figura 19 – Resolução cromatográfica
Fonte: usp.br
Matematicamente, a resolução “Rs” entre dois picos cromatográficos adjascentes é 
dada por:
R t tS R R�
�
� ��
2 1
1
2
1 2Wb Wb
Onde:
• Rs = resolução entre os dois picos;
• tR1 = tempo de retenção do pico 1;
• tR2 = tempo de retenção do pico 2;
• Wb1 = largura do pico 1 na base;
• Wb2 = largura do pico 2 na base.
Para análises quantitativas, é altamente desejável uma resolução > 1,5!
A CG pode desempenhar um papel valioso quando combinada com outras técnicas 
instrumentais, destacando-se a espectrometria de massa (EM) e espectrometria no in-
fravermelho (IV). Assim, informações como a massa molar e a estrutura química dos 
compostos analisados podem ser obtidas com precisão A Figura a seguir mostra a de-
terminação de fenol pela técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de 
massas (CG/EM). 
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Determinação de fenol por CG/EM Varian, modelo saturn-3. Curva de calibração com amostras 
de 5 até 10.000 µg.L–1 de fenol em água. Intervalo de temperatura: 40 a 2500°C (gradiente). 
Gás de arraste He. Disponível em: https://bit.ly/3lIwMV6
Dessa forma, o sistema CG/EM pode ser utilizado em aplicações forenses, ambien-
tais, destacando-se as áreas farmacêutica e de alimentos.
Cromatografia com Fluído Supercrítico (CFS)
A SFC é semelhante à cromatografia gasosa e à cromatografia líquida, mas utiliza 
dióxido de carbono (CO2) líquido como fase móvel. 
Um fluido é considerado supercrítico quando a temperatura e a pressão do sistema 
estiverem acima das condições do seu ponto crítico. Nestas condições, os fluidos têm 
propriedades físico-químicas intermediárias entre as apresentadas em seu estado líquido e 
gasoso. Em geral, as densidades são elevadas devido a altas pressões, resultando em gran-
des poderes de solvatação (comparados com o mesmo fluido no estado gasoso), e baixas 
viscosidades e altos coeficientes de difusão (comparados com o fluido no estado líquido). 
Os detectores podem ser do tipo DCT, FID, DCE e espetrômetro de massa. Da mes-
ma forma que na CL ou CG, a separação dos solutos presentes na fase móvel se dá por 
suas diferentes interações com afase estacionária presente em uma coluna. 
As fases estacionárias utilizadas para a cromatografia supercrítica seguem os mes-
mos tipos utilizadas na cromatografia líquida: quanto maior for a interação de um soluto, 
maior será o seu tempo necessário para eluir da coluna, ocorrendo a separação. 
Figura 20 – Representação esquemática de um cromatógrafo supercrítico analítico
Fonte: ROSA, 2015, p. 604
(1) Reservatório de CO2; (2) Válvula de bloqueio do CO2; (3) Bomba de CO2; 
(4) Bomba de cossolvente; (5) Reservatório de cossolvente; (6) Misturador; 
(7) Pré-aquecedor; (8) Válvula de injeção; (9) Coluna cromatográfica; (10) 
Forno; (11) Manômetro de pressão; (12) Detector; (13) Válvula controladora 
de pressão.
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Aplicações de cromatografias supercríticas analíticas: análise de medicamentos, ali-
mentos, explosivos, petróleo, polímeros e propulsores. Em relação à cromatografia su-
percrítica preparativa, temos o fracionamento de extratos de produtos naturais, bem 
como a purificação de enantiômeros.
Vantagens da SFC
• Se comparada à CG, permite análise para compostos pouco voláteis;
• Se comparada à CLAE (HPLC), apresenta: menores tempos de separação, maio-
res eficiências, reequilíbrio da coluna mais rápido, menores tempos de otimização 
de métodos, maior reprodutividade; menores perdas de carga na coluna devido a 
menor viscosidade da fase móvel; menor custo do solvente; menores quantidades 
de solvente orgânico utilizado e de resíduos gerados.
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UNIDADE Métodos Cromatográficos de Análise
Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Vídeos
Isolation of Plant Pigments by Column Chromatography – Amrita University
https://youtu.be/a2wwgLV80U8
Separation of Photosynthetic Pigments by Chromatography (Practical 4)
https://youtu.be/W56RHxu2Hpc
Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose
https://youtu.be/vL3EfRx78P0
 Leitura
Copolímeros de estireno-divinilbenzeno para aplicação em cromatografia de exclusão por tamanho
https://bit.ly/32YDZcg
Fluidos supercríticos em química analítica. II. Cromatografia com fluido supercrítico: instrumentação
https://bit.ly/3fc4pfB
Os primórdios da cromatografia líquido-líquido
https://bit.ly/36TP1k4
Eletroforese convencional: conceito e técnica
https://bit.ly/3kIOmHi
Utilização de cromatografia supercrítica na purificação de compostos bioactivos
https://bit.ly/3lLWbxa
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Referências
AMORIM, A. F. V. Química: métodos cromatográficos. 1. ed. Fortaleza: 2019.
CIOLA, R. Fundamentos da cromatografia a gás. São Paulo: Edgard Blücher, 1985.
________. Fundamentos da cromatografia a líquido de alto desempenho – HPLC. 
1. ed. São Paulo: Edgard Blücher, 1998.
EWING, G. W. Métodos instrumentais de análise química. São Paulo: Edgard 
Blücher, 1972. v.2.
HAGE, D. S.; CARR, J. D. Química analítica e análise quantitativa. São Paulo: 
Pearson, 2012. (e-book)
HARRIS, D. C. Análise química quantitativa. 9. ed. Rio de Janeiro: LTC, 2017. (e-book)
LANÇAS, F. M. Cromatografia em fase gasosa. São Carlos: ACTA, 1993.
SETTLE, F. A. Handbook of instrumental techniques for analytical chemistry. 
New Jersey: Prentice Hall, 1997. Disponível em: <https://www.researchgate.net/publi-
cation/334612301_Handbook_Of_Instrumental_Techniques_For_Analytical_Chemis-
try_PDFDrivecom>.
SKOOG, D. A. et al. Fundamentos de química analítica. 9. ed. São Paulo: Cengage 
Learning, 2014. (e-book)
________; HOLLER, F. J. Princípios de análise instrumental. 5. ed. Porto Alegre: 
Bookman, 2002.
VOGEL, A.I. et al. Análise química quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro: LTC, 2002. 
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