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Biologia Molecular
GD 1 - Estrutura de nucleotídeos e ácidos nucléicos /Genes, Cromossomos e genomas.
Um nucleosídeo consiste em uma base nitrogenada ligada a uma pentose -> ligação beta entre o N1 da pirimidinas e do N9 das purinas com o C1’ da pentose – ocorre remoção de uma água. 
Um nucleotídeo consiste em um grupo fosfato e uma base nitrogenada ligados a pentose, ou seja é um grupo fosfato ligado a um nucleosídeo. O grupo fosfato se liga ao carbono 5’ da pentose em uma reação de esterificação.
A ligação fosfodiéster para a formação de um dinucleotídeo ocorre com a ligação do grupo fosfato de um nucleotídeo a hidroxila do C3’ do próximo nucleotídeo. -> A OH-3’ age como nucleófilo e ataca o fosfato alfa do próximo do nucleotídeo trifosfatado. Há a liberação de PPi.
A orientação 5’->3’ refere-se a extremidade da fita.
O esqueleto covalente do DNA e RNA estão sujeitos a hidrólise não-enzimática da lig fosfodiéster. O RNA é mais facilmente hidrolisado do que o DNA porque possui uma hidroxila no C2’, enquanto o DNA possui apenas o hidrogênio.
Purinas e pirimidinas são hidrofóbicas e relativamente insolúveis em água no pH próximo a neutralidade da célula. Quando o pH aumenta ou diminui, as bases se tornam carregas e a solubilidade aumenta. Iterações hidrofóbicas ou de empilhamento, em que duas ou mais ou mais bases são posicionadas no mesmo plano, são sustentadas por interações de van der Waals e dipolo-dipolo entre as bases. Essa iteração ajuda a minimizar o contato com a água e é importante para a manutenção tridimensional dos ácidos nucléicos. 
Outro modo importante de interação das bases é por meio das pontes de hidrogênio, o que permite a associação de duas ou mais fitas de ácido nucléico. As bases formam pares: A-T e C-G em DNA e A-U e C-G em RNA. Os ácidos nucléicos apresentam sempre essa complementaridade de bases, sendo que as fitas pareiam de modo anti-paralelo. É esse pareamento específico de bases que permite a duplicação da informação genética.
Ex: 5’ – GAT GAG GAT CCA GTG CAC CAA CTC G – 3’ -> fita molde 
 3’ – CTA CTC CTA GGT CAC GTG GTT GAG C – 5’ -> fita complementar
Podemos calcular a porcentagem de A+T e C+G da molécula acima: temos ao todo 25 nucleotídeos apenas na fita molde, 11 deles são A+T, então, 11/25=44% de A+T. Dos 25 nucleotídeos da fita molde, 14 representam a soma de C+G, então, 14/24=56% de C+G.
A distinção das extremidades 5’ e 3’ é importante para a leitura da informação genética que sempre acontece na direção 5’->3’. O crescimento da molécula também sempre acontece nesta direção. Ou seja, sua polaridade possui essa direção.
Primeiramente foi provado que o DNA (antes era chamado de nucleína, logo depois descobriu-se que a nucleína era foramada por fosfato, bases nitrogenadas e uma pentose) e não proteína carregava a info genética e a partir de Avery que injetou DNA de uma bactéria com linhagem patogênica em outra não patogênica, transformando-a em virulenta. Chagaff e seus colegas descobriram que as quatro bases nucleotídicas do DNA eram encontradas em proporções diferentes nos DNAs de organismos diferentes e que as quantidades destas bases estavam relacionadas. Regras de Chargaff -> A pareia com T e C pareia com G, então a quantidade de A é igual a de T, e a quantidade de C é igual a de G, é importante lembrar que duas pontes de hidrogênio são formadas entre A e T e três pontes são formadas entre C e G. Rosalind Franklin e Maurice Wilkins usaram o método da difração de raios X para analisar fitas de DNA. Demonstraram que o DNA produz um padrão de difração de raios X característico. A partir desse padrão deduziu-se que moléculas de DNA são helicoidais com duas periodicidades ao longo do seu eixo mais longo. 
Watson e Crick levaram em consideração todas as informações e postularam o modelo tridimensional da estrutura do DNA. O modelo consiste em um esqueleto hidrofílico com duas cadeias de DNA helicoidais, enroladas em torno do mesmo eixo para formar uma hélice dupla de orientação a direita. Os esqueletos hidrofóbicos de grupos fosfato e desoxirribose do lado de fora de hélice dupla, dão caráter ácido a molécula. As bases estão empilhadas dentro da dupla hélice. O pareamento das duas fitas cria um sulco principal e um sulco secundário na superfície da dupla fita. 
A dupla hélice de DNA é mantida por duas forças: as pontes de hidrogênio entre as bases complementares e as interações de empilhamento de bases. Durante a desnaturação do DNA as pontes de hidrogênio são rompidas, as interações hidrofóbicas também são desfeitas, mas não influenciam diretamente no processo de desnaturação. Durante a desnaturação as ligações covalentes não são rompidas.
Outra característica do modelo de Watson e Crick é que ele sugere um mecanismo para transmissão da informação genética, considerando que as duas fitas são complementares -> as duas fitas podem ser replicadas pela separação delas e posterior síntese de uma fita complementar para cada fita molde, (cada fita preexistente seria o molde para uma nova fita complementar) -> replicação é semiconservativa.
O DNA é uma molécula consideravelmente flexível, sua estrutura pode ser variada, mas isso não afeta as propriedades chave do DNA, como antiparalelismo e complementaridade.
A estrutura proposta por Watson e Crick é também chamada de forma B do DNA, que é também a estrutura mais estável para o DNA em condições fisiológicas . Porém há outras duas formas, a A e a Z. A forma A do DNA é favorecida em soluções desidratadas -> o DNA ainda está arranjado em dupla hélice com o sentido da mão direita, mas a hélice é mais larga com maior número de pares de bases por volta da hélice; seu sulco principal é mais fundo e o secundário mais raso, porque o plano dos pares de bases é mais inclinado em relação ao eixo da hélice. A forma Z do DNA possui rotação no sentido da mão esquerda, há ainda mais pares de base por volta da hélice (mais que na forma A, e também mais que na forma B); a estrutura da hélice é mais alongada e delgada; seu sulco principal é pouco aparente e o sulco secundário é estreito e fundo.
Várias estruturas de DNA envolvem três ou ate quatro fitas de DNA. Assim como o RNA pode apresentar bases pareadas. -> pareamento Hoogsteen -> DNA H
Toda vez que seis ou mais resíduos de adenosina aparecem sequencialmente em uma fita, ocorre uma curvatura na hélice do DNA, o que pode ser importante para a ligação de algumas proteínas –> DNA dobrado. 
Grampos e cruzes -> sequências complementares que estão 
próximas podem iteragir, formando grampos (fita simples) 
Quando a interação e em fita dupla, formam-se cruzes.
Ribozima -> RNA com propriedades catalíticas.
O RNA não possui uma estrutura secundária regular e simples que sirva como um ponto de referência, como é a dupla hélice do DNA. Sua estrutura é bastante variável, o que possui relação com a função que desempenha no metabolismo celular. Quando sequências complementares estão presentes, predomina a estrutura de fita dupla do tipo A, no sentido da mão direita. Quebras na estrutura da hélice do tipo, causadas por bases despareadas formam alças ou saliências. Grampos também são muito comuns. 
Cada espécie de DNA possui uma temperatura de desnaturação característica ou ponto de fusão (Tm – melting temperature): temperatura na qual 50% da molécula de DNA já foi desnaturada. Quanto maior o conteúdo de pares de bases G≡C maior o ponto de fusão do DNA (três pontes de hidrogênio dão mais estabilidade ao DNA). Extremos de pH, temperatura elevada, e elevadas concentrações salinas causam a desnaturação do DNA. Quando o pH ou a temperatura, ou as concentrações de sais voltam ao normal da célula, a molécula se renatura; esse processo é demorado caso a molécula esteja completamente desnaturada. O primeiro passo da renaturação é lento, porque as duas fitas devem se encontrar, ao acaso, por colisão e formar um segmento pareado, já o segundo é passo é mais rápido, porque uma vez que há uma parte da molécula já pareada, o restante das bases se fechamcomo um “zíper”, formando a dupla hélice. 
Ácidos nucléicos de diferentes espécies podem formar híbridos -> quaisquer sequências complementares podem parear durante a renaturação, independente da sua espécie. Também podemos formar híbridos RNA-DNA.
Em amostras de DNA isoladas de duas espécies distintas de bactérias, a base adenina corresponde a 32% e 17% do total de bases, respectivamente.
- Então, a timina corresponde a 32% e 17% do total de bases, respectivamente, por causa do pareamento A=T, a quantidade de adenina é sempre igual a quantidade de timina. Então, a porcentagem de A=T é 64% e 34%, respectivamente; restando 36% (100-64) e 66% (100-34) para G≡C, respectivamente. Então, citosina corresponde a 18% e 33%, assim como guanina corresponde a 18% e 33%, respectivamente. (Regra de Chagaff).
- Uma das espécies de bactérias foi isolada de uma fonte termal (64⁰C). Qual DNA foi isolada desta bactéria termofílica? A segunda bactéria, porque ela possui maior porcentagem de C≡G, então esta é a bactéria mais termofílica, sua temperatura de fusão é maior.
O RNA pode apresentar modificações fisiológicas nas suas bases, para que ele desempenhe sua função adequadamente. Já no DNA modificações nas bases não são comuns, porque o DNA é uma forma estável, que possui como função transmitir a informação genética, então, modificações na sua estrutura podem causar erros genéticos. Além disso, o DNA possui sistemas de reparo que impedem a modificação de suas bases.
Gene -> segmento de uma molécula de DNA que contém informação necessária para a síntese de um produto biologicamente funcional, seja uma proteína ou um RNA, ou seja codifica a sequência primária de um produto gênico final.
Cromossomo -> unidade de organização do genoma.
Cromossomos procarióticos estão dispersos no citoplasma, é um cromossomo circular e único, há a presença de plasmídeos e ausência de telômeros e centrômeros. Apresentam colinearidade (não há íntrons)
Cromossomos eucarióticos -> o DNA está associado a proteínas que têm a função de compactá-lo e condensá-lo. Possuem centrômeros (localização variável), telômeros (localizados nas extremidades dos cromossomos e ajudam a estabilizá-los, sintetizados pela telomerase), estão localizados no núcleo, são moléculas lineares, possuem várias origens de replicação.
Genoma -> A série completa de informação do DNA de um organismo, sequências gênicas e não-gênicas, DNA cromossômico e extra-cromossômico.
Genes eucarióticos possuem íntrons e exóns, não há colinearidade. Os genes codificadores das histonas são os únicos genes eucarióticos que não possuem introns. Já os genes procarióticos não possuem introns. Os genes procarióticos são organizados pelo modelo operon (um promotor pode regular mais de um gen, produzindo um produto policistrônico). 
Mitocôndrias e cloroplastos possuem DNA circular, semelhante ao de bactérias. Esses DNAs são bem menores que os cromossomais. Eles produzem tRNAs e mRNAs e poucas proteínas, o restante das proteínas necessárias são produzidas pelo DNA nuclear.
O DNA se encontra compactado, em diversos níveis, juntamente com proteínas e pequenas quantidades de RNA. As histonas são as principais proteínas encontradas na cromatina, estão em cinco classes principais: H1, H2A, H2B, H3 e H4. 
	- nucleossomos: DNA ligado fortemente a esferas protéicas (oito moléculas de histonas, duas cópias de cada uma das H2A, H2B, H3, H4) que estão regularmente espaçadas por um segmento de DNA no qual a histona H1 está ligada, é o sítio hipersensível. É a unidade fundamental sobre a qual o empacotamento de alta ordem da cromatina é construído. Há outras proteínas que facilitação a ligação das histonas ao DNA, e que regulam o posicionamento das “contas” do nucleossomo. Os nucleossomos vão se enovelando, enovelando, enovelando, até que formam os cromossomos.
- topoisomerases são enzimas que atuam no superespiralamento do DNA, diminuindo a tensão das superespiras formadas. Foram provadas necessárias para a montagem da cromatina in vitro.
	GD 2 - Southern blotting	
Na técnica de análise de ácidos nucléicos, Southern blotting, utilizamos o gel de agarose para a separação dos fragmentos de DNA, porque este gel tem uma capacidade de separar moléculas maiores, de até 30 kb. A agarose forma uma rede que prende as moléculas durante a sua migração, na eletroforese.
Endonucleases são enzimas que hidrolisam as ligações fosfodiéster internas do DNA. As endonucleases tipo II, ou de restrição, reconhecem e clivam em sequências específicas dentro do DNA, tais são sequências são seus sítios de restrição. Os sítios de restrição são sequências palidrômicas, ou seja, são sequências com repetições invertidas, possuem simetria dupla nas duas cadeias de DNA; ex: 5’ GGATCC 3’
Os fragmentos digeridos pelas endonucleases são os seus fragmentos de restrição, e é possível calcular uma média do tamanho desses fragmentos, caso se conheça a composição de bases do DNA digerido. 
Ex: Um genoma com conteúdo de GC igual a 60% foi digerido com as endonucleases a seguir, qual o tamanho dos seus fragmentos de restrição?
60% = G+C -> 40% = A+T -> 3/10 = G; 3/10 = C; 2/10 = A; 2/10 = T
AluI (cliva em AG/CT)
Probabilidade de ter a sequência AGCT: 2/10 x 3/10 x 3/10 x 2/10 = 9/2500 ,ou seja, 1 corte a cada, aproximadamente 277 nucleotídeos. 
TasI (cliva em /AATT)
2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 = 1/625 = 1 corte a cada 625 nucleotídeos. 
HindIII (cliva em A/AGCTT)
2/10 x 2/10 x 3/10 x 3/10 x 2/10 x 2/10 = 9/62500 = 1 corte a cada, aproximadamente, 6944 nucleotídeos. 
ApaI (cliva em GGGCC/C)
3/10 x 3/10 x 3/10 x 3/10 x 3/10 x 3/10 = 729/1000000 = 1 corte a cada, aproximadamente, 1371 nucleotídeos.
PmeI (cliva em GTTTAAAC)
3/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 3/10 = 576/100000000 = 1 corte a cada, aproximadamente, 173611 nucleotídeos.
Dentre as enzimas acima, apenas a PmelI não poderia ser usada para gerar fragmentos para serem utlizados em Southern blotting, porque ela gera fragementos maiores que 30kb, que é o limite suportado pelo gel de agarose. 
Sonda é um fragmento de ácido nucléico marcado (radiotiva ou quimicamente) que contém uma sequência complementar a um gene (ou a um segmento qualquer de DNA) que se deseja detectar em um experimento de hibridização. A sonda deve ser um ácido nucléico de fita única, porque ela precisa parear com o DNA alvo (hibridização).
Na técnica Southern blotting o DNA genômico (já extraído e purificado) deve ser digerido com enzimas de restrição. A técnica de tranferência em Southern nos permite encontrar e examinar, fragmentos de interesse dentro dos diversos outros fragmentos. Os fragmentos gerados após a digestão são separados por tamanho, por eletroforese em gel de agarose, no qual os fragmentos pequenos movem se mais depressa em um campo elétrico, do que os maiores. O gel pronto é colocado em substancia desnaturante, para que o DNA que até então esta em fita dupla seja desnaturado. Após essa etapa, há a transferência por capilaridade dos fragmentos de DNA do gel para um filtro de nitrocelulose ou náilon. 
Para identificar o fragmento de interesse, é usada a sonda especifica marcada. A sonda e o filtro são incubados juntos em uma solução que favorece a renaturação do DNA . Assim, a sonda vai formar pontes de hidrogênio com seu filamento complementar no filtro. Depois que o filtro é lavado para remover o excesso de sondas não-pareadas, ele é revelado, e poderemos ver a posição de onde a sonda se hibridizou. 
Esta técnica pode ser utilizada para detectar rearranjos genômicos e deleções gênicas; para avaliação da distribuição genômica de sequências ; para elucidação de processos biológicos, como o processamento do RNA; para a detecção de DNA de organismos infecciosos em amostras biológicas, entre outros. 
GD3 – Replicação e reparo de DNA 
A replicação do DNA é semiconcervativa -> cada fita do DNA funciona como um molde para a produção de uma nova fita, produzindo duas moléculas de DNA, cada uma com uma fita nova e uma fita velha. Esta hipótese foi propostapor Watson e Crick, e foi demonstrada por Mattheew Meselson e Franklin Stahl. 
A figura ao lado apresenta duas gerações do experimento Meselson-Stahl. Primeiramente houve o crescimento isolado do DNA pesado (no meio de crescimento havia apenas N15), depois essas células foram isoladas e levadas para um meio com apenas N14 onde foram a induzidas a replicar. A primeira geração formou um híbrido de N15 com N14; o que comprova a hipótese semiconcervativa. 
Na terceira geração do experimento teríamos duas hélices de DNA híbrido leve-pesado (N14 com N15) e seis hélices de DNA leve, apenas com N14. Então, 75% (6/8) da amostra apresenta DNA leve-leve e 25% (2/8) dela apresenta DNA leve-pesado. Assim a razão molar entre o DNA híbrido leve-pesado e o DNA leve-leve é 1/3. 
A replicação do DNA começa em uma origem e segue bidirecionalmente -> o cromossomo procariótico possui apenas uma origem de replicação, enquanto os eucarióticos possuem várias. No ponto da origem de replicação é formada uma alça, e em ambas as extremidades desta alça são formadas as forquilhas de replicação, onde o DNA parental é desenrolado, e as fitas separadas são replicadas. 
A síntese do DNA prossegue na direção 5’->3’ e é semidescontínua -> como as fitas são antiparalelas, uma das fitas é lida na direção 3’->5’, o que é inviável. Okazaki e seus colaboradores descobriram que esta fita é sintetizada em fragmentos pequenos, os chamados fragmentos de Okazaki; esses fragmentos podem variar de comprimento.
	- a fita líder, ou contínua, é aquela em que a síntese prossegue na direção 5’->3’, na mesma direção do movimento da forquilha de replicação.
	- a fita atrasada, ou descontínua, é aquela em que a síntese 5’->3’ prossegue na direção oposta a direção do movimento da forquilha.
Nuclease - enzimas que degradam o DNA, elas são divididas em duas grandes classes: exonucleases e endonucleases. 
Exonucleases - degradam o DNA a partir de uma das suas extremidades, podem operar na direção 5’->3’ ou na direção 3’->5’, removendo nucleotídeos.
Endonucleases - hidrolisam as ligações fosfodiéster (entre os nucleotídeos) internas. Uma classe de endonucleases são as enzimas de restrição, que quebram o DNA em sítios internos específicos. 
A DNA polimerase é a enzima que realiza a replicação do DNA. Três isoformas são as mais importantes: DNA polimerase I, II, III. A realização da polimerização requer um molde e um primer ou iniciador. O molde é uma das fitas de DNA já existentes, e o primer é uma pequena sequência de RNA (enzimas específicas são responsáveis por sua síntese) com o grupo OH-3’ livre. Este primer já deve estar ligado a fita molde para que a DNA polimerase inicie a polimerização.
Processividade da DNA polimerase -> após a adição de alguns nucleotídeos a enzima precisa se dissociar da fita molde e depois se associar a ela novamente para continuar a polimerização, o que pode limitar a velocidade do processo. É esse número de nucleotídeos adicionados sem dissociação da enzima que caracteriza a processividade. As isoformas da enzima possuem processividades variadas. 
A replicação possui alto grau de fidelidade, que é garantido pela própria DNA polimerase. Um mecanismo que todas DNA polimerases possuem é a atividade exonucleásica 3’->5’, que permite que a enzima remova um nucleotídeo recém adicionado, caso o pareamento não esteja correto. Se a enzima adicionar um nucleotídeo incorreto, ela é impedida de se mover para frente, então o nucleotídeo incorreto é removido pela atividade exonucleásica. Essa atividade é chamada revisora, ou atividade corretora, ou seja são processos que ocorrem durante a replicação para evitar erros.
DNA pol I -> remove nucleotídeos do primer (atividade exonucleásica 5’-3’) e à medida que esses nucleotídeos vão sendo removidos, ela adiciona os desoxirribonucleotídeos (atividade polimerásica) onde antes estavam os ribonucleotídeos.
DNA pol II -> relacionada com o reparo do DNA, não participa da replicação.
DNA pol III -> principal enzima da replicação devido a grande processividade e velocidade. Além da atividade de polimerase, ela também tem a atividade revisora. 
A atividade polimerásica requer dNTPs, Mg+2, fita molde e primer.
A replicação do DNA não envolve apenas a DNA polimerase mas várias outras enzimas. o complexo como um todo é chamado sistema da DNA replicase ou replissomo:
	- Helicases -> se movem ao longo do DNA separando as fitas.
	- Topoisomerases -> alivia o estresse topológico causado na estrutura da dupla fita pela formação da alça de replicação.
	- Proteínas de ligação ao DNA estabilizam as fitas separadas.
	- Iniciases ou primases -> sintetizam o primer e o colocam no seu ponto.
	- DNA ligases -> selam ligações fosfodiéster quebradas na estrutura do DNA.
A replicação ocorre em etapas: iniciação, alongamento e terminação. A seguir uma descrição de tais etapas em procariotos. A iniciação envolve a abertura da hélice no ponto da origem da replicação (esquematizado na figura ao lado). A hélice é aberta e é formado um complexo pré iniciação, onde age a proteína Dna A. Ela liga-se as quatro regiões de 9 pb gerando uma mudança conformacional nessa região, e sucessivamente reconhece e desnatura a região das repetições de 13 pb. A proteína Dna B se liga a região desnaturada e age como uma helicase, desenrolando o DNA bidirecionalmente.
O alongamento inclui a síntese da fita líder e a síntese da fita atrasada. As helicases desenrolam a dupla fita, o estresse topológico é desfeito pela topoisomerase, e proteínas estabilizam a dupla fita aberta. Na síntese da fita líder acontece a síntese do primer, e adição de nucleotídeos a partir dele. A DNA polimerase sintetiza fita líder ao mesmo tempo que sintetiza a fita atrasada, para isso, a fita atrasada precisa formar um laço envolta da enzima, para que a leitura e a polimerização seja feita no sentido 5’-3’. Dessa forma, a síntese na fita atrasada ocorre por meio dos fragmentos de Okazaki: um primer é adicionado e a partir dele são adicionados os nucleotídeo; a síntese de DNA continua até que o fragmento se estenda até o primer do fragmento de Okazaki anterior. Quando um fragmento for completado, a DNA polimerase se dissocia, e se associa novamente, em outro ponto da fita atrasada, para formar outro fragmento. Assim que um fragmento de Okazaki é completado, seu primer é removido e substituído por DNA, o corte remanescente é selado pela DNA ligase.
Terminação -> as duas forquilhas de replicação se encontram na região terminal do cromossomo que contém copias múltiplas de uma sequência de 20 pb. Essas sequências são o sítio de ligação para uma proteína Tus. Quando uma das forquilhas encontra essa proteína associada ela para, e quando a outra forquilha encontra a primeira forquilha parada, ela também para. 
Nos eucariotos, as origens da replicação são chamadas de sequências de replicação autônomas - ARS. A iniciação requer o complexo de reconhecimento da origem - ORC. A terminação envolve a síntese dos telômeros, pela telomerase. Os eucariotos também possuem uma maior diversidade de enzimas envolvidas no processo, incluindo um maior número de DNA polimerases. Além desses fatores, a replicação nos eucariotos é altamente regulada e coordenada com o ciclo celular.
Moléculas de RNA e proteínas podem ser facilmente degradadas e substituídas, já as moléculas de DNA são insubstituíveis, portanto manter a integridade dessas moléculas é importante, para tanto há um elaborado conjunto de sistemas de reparo do DNA
Mutação -> uma alteração permanente na sequência de nucleotídeos do DNA. Podem envolver a substituição de um par de bases por outro (transições, a substituição de uma purina por uma purina ou uma pirimidina por uma pirimidina e transversões, substituição de uma purina por uma pirimidina), a adição ou a deleção de um ou mais pares de bases. Há uma forte correlação entre as mutações e o câncer. As mutações podem não alterar o sentido da informação genética (sinônima), podem não gerar um produto funcional (sem sentido - nonsense), podem geraroutro produto funcional (sentido errado - missense) e podem alterar a fase de leitura do RNA (frameshift).
Desaminação, despurinação e oxidação são mutações que podem ocorrer espontaneamente. Outras ocorrem por ação de agentes mutagênicos, como inserções, deleções e troca de bases.
	- Bruce Ames desenvolveu um teste simples que mede o potencial mutagênico de tal substância em uma bactéria. O potencial mutagênico pode ser fortemente correlacionado com o potencial carcinogênico.
	-> A bactéria possui uma mutação que inativa a produção de histidina, então quando colocadas em um meio sem histidina, poucas bactérias crescem. As que cresceram apresentaram uma retromutação espontânea que permitiu a produção de histidina. Outros três meios de cultura foram preparados, mas desta vez foi colocada no meio da placa uma substancia mutagênica (as concentrações do mutagênico decresceram de placa para placa), que aumenta progressivamente o número de retromutações. Na região mais próxima da substância, ele está tão concentrado que nenhuma colônia cresceu, mas quanto mais distante do centro, mais diluído está o mutagênico, aumentando o número de retromutações fazendo com que as colônias cresçam. 
Reparo de despareamento - O DNA procariótico é metilado, é o meio que a bactéria encontra de distinguir o DNA molde do DNA recém sintetizado. Assim, quando há erros de pareamento, eles podem ser corridos levando em consideração a informação da fita molde. A proteína MultL forma um complexo com a MultS e se liga aos pb despareados (exceto C-C); a MultS se liga as sequências GATC (a metilação ocorre na adenina dessas sequências). Uma nuclease cliva o DNA do sítio de metilação até o local despareado, e esse segmento é subtituído por DNA novo (utiliza DNA polimerase III, DNA ligase).
Reparo por excisão de base -> as DNA glicosilases reconhecem bases modificadas (ex: citosina desaminada) e clivam sua ligação N-glicosídica, gerando um sítio abásico, também chamado de sítio AP. As AP endonucleases cortam a fita de DNA no local do sítio AP, o DNA removido é substituído pela DNA polimerase I e o corte remanescente é selado pela DNA ligase. 
Reparo por excisão de nucleotídeo -> ocorre quando há danos que causam grandes alterações estruturais. Uma exinuclease cliva um oligonucleotídeo de 12 a 13 pb nos procariotos e de 27 a 29 pb nos eucariotos. Esse oligonucleotídeo é liberado e a DNA polimerase I preenche a lacuna restante, a DNA ligase sela o corte. 
Reparo direto -> um exemplo é a fotorreativação dos dímeros de pirimidina, pela DNA fotoliase; os dímeros de pirimidinas resultam de uma reação induzida pela luz, e a fotoliase usa a própria energia luminosa para reverter essa lesão. A fotoliase usa o FADH ou um folato como cromóforo, ou seja, para absorver a luz. Outro exemplo é o reparo da O6-metilguanina, que se forma na presença de agentes alquilantes; seu reparo é realizado pela O6-metilguanina DNA metiltranferase (ela não é exatamente uma enzima, porque ela recebe o metil, tornando-se permanentemente inativa).
Quando há lesão nas duas fitas, ou quando há lesão em DNA de fita simples, ocorre reparo por recombinação de DNA. Porém, toda vez que a lesão ocorrer em níveis irreversivelmente altos, por exemplo, em exposição a luz UV forte, aciona-se a via de reparo sujeita a erros, que é parte de uma resposta celular ao estresse de lesões intensas do DNA, a chamada resposta SOS. Esse tipo de resposta induz a ação de proteínas SOS, as DNA polimerases IV e V também entram em ação.
GD5 - Transcrição e regulação da expressão gênica em procariotos.
A transcrição assemelha-se a replicação em seu mecanismo fundamental, as diferenças principais são que a RNA polimerase (responsável pela síntese de RNA a partir de DNA) não precisa de um iniciador (a transcrição inicia-se quando a RNA polimerase se liga aos promotores), e utiliza apenas uma fita do DNA como molde, envolvendo pequenos segmentos desta fita. Utiliza NTPs. A fita molde do DNA é antiparalela a nova fita de RNA. Além disso, na transcrição partes do genoma nunca são transcritas, enquanto na replicação o genoma todo é copiado.
A fita de DNA usada como molde para o RNA é chamada de fita molde ou fita anti-senso, fita negativa. A fita complementar a fita molde é chamada fita codificadora ou fita senso, fita positiva, a sua sequência de nucleotídeos é igual a sequência de nucleotídeos do RNA, com U no lugar de T. As sequências reguladoras da transcrição são sempre designadas como sequências da fita codificadora, por convenção. 
Ex: Dada a sequência de nucleotídeos 5’ - ACG UUA GAC GAU GCA GUA CGG -3’
A sequência da fita codificadora seria: 5 - ACG TTA GAC GAT GCA GTA CGG - 3’
A sequência da fita molde seria: 5’ - CCG TAC TGC ATG GTC TAA CGT - 3’ 
A RNA polimerase é uma enzima composta por cinco subunidades: 2α, β, β’, ω. Além da subunidade σ que se liga apenas transitoriamente a RNA polimerase. Existem várias isoformas da RNA polimerase, e o que as distingue é a subunidade σ. Tais enzimas não possuem atividade revisora, pelo fato que os RNAs produzidos têm vida curta, portanto um erro na sua síntese não tem grande impacto no metabolismo da célula. 
Os pares de base do DNA que correspondem a molécula de RNA recebem números posisitivos, são as chamadas sequências down stream, (o primeiro nucleotídeo adicionado pela RNA polimerase é o nucleotídeo +1); e aqueles nucleotídeos do DNA anteriores ao nucleotídeo +1 recebem números negativos, são as chamadas sequências up stream.
Promotores são sequências presentes no DNA que direcionam a transcrição de segmentos adjacentes, os genes. A região promotora geralmente se estende entre as posições -70 e +30. As sequências das regiões -10 (5’- TATAAT -3’) e -35 (5’- TTGACA -3’) são sítios importantes de ligação da subunidade σ, por apresentarem tais sequências consenso. Há um terceiro elemento de reconhecimento rico em ATs, chamado elemento UP (upstream promoter), e está ente as posições -40 e -60; ele é ligado a subunidade α da RNA polimerase. A figura abaixa apresenta um típico promotor procarioto.
A iniciação da transcrição envolve duas partes: a fase de ligação e a de iniciação em si. Na fase de ligação a subunidade σ reconhece as regiões -35 e -10 e se liga ao DNA, então o restante da subunidades da RNA polimerase se ligam a subunidade σ; levando a formação de um composto fechado, no qual o DNA ainda não está desenrolado. Até que a região -10 ate aproximadamente +2 é desenrolada, para formar o complexo aberto. A fase de iniciação envolve o inicio da formação da nova molécula de RNA e a liberação da subunidade σ, nesse ponto a RNA polimerase já deixou a região promotora, e está comprometida no alongamento do RNA. Durante um curto espaço de tempo existe a formação de um híbrido RNA-DNA, até que a extremidade 5’ do RNA dos procariotos fica disponível para já se iniciar a tradução.
Ativadores facilitam a ligação da RNA ao promotor, ex: proteína receptora de cAMP ou CRP. Repressores são proteínas que bloqueiam a síntese de RNA em genes específicos.
RNAs polimerases possuem alta processividade, isso porque se ela liberar um RNA antes de pronto, ela não consegue voltar ao ponto anterior, tendo que começar a síntese novamente. Portanto, o DNA possui sequências que indicam que a RNA polimerase deve parar a transcrição. Os procariotos possuem duas classes de sinais de terminação: Rho-dependente e Rho-independente. Rho (ρ) é uma proteína auxiliar. 
- As terminações Rho-independentes formam um transcrito que possui na sua extremidade 3’ sequências autocomplementares que induzem a formação de um grampo, e logo depois dessas sequências autocomplementares, o transcrito possui vários U. Quando a RNA polimerase chega a um sítio de terminação com essa estrutura (grampo seguido de poliU), ela para a transcrição. Tal estrutura rompe interações entre o RNA e RNA polimerase.
- As terminações Rho-dependentes também possuem sequências autocomplementares que formam grampos, nesta região a RNA polimerase para de se mover, mas não sedissocia; para isso a proteína ρ se liga a sítios específicos do RNA e se move na direção 5’-3’ até alcançar o complexo de transcrição, e contribui para a liberação do RNA.
Principais diferenças da transcrição em eucariotos e procariotos:
Eucariotos 				 Procariotos
Núcleo					 Citoplasma
Monogênico e poligênico		 Poligênico
Três RNA pol				 Uma RNA pol
RNA é modificado			 RNA não é modificado
Tradução não é simultânea 		Tradução é simultânea
Algumas enzimas usam o RNA como molde pra o DNA e, posteriormente, RNA. A síntese de DNA a partir de RNA é chamada de transcrição reversão. A principal enzima que realiza essa reação é a trascriptase reversa, mas a telomerase também é um exemplo de enzima que realiza síntese de DNA a partir de RNA. Além disso, em alguns bacteriófagos, retrovírus, temos a síntese de RNA dependente de RNA (RNA replicase).
- A transcriptase reversa primeiro catalisa a síntese de uma fita de DNA complementar ao RNA, depois ela degrada a fita do RNA no híbrido RNA-DNA e a substitui por DNA. A síntese laboratorial de DNA usando o mRNA como molde produz o DNA complementar (cDNA). 
- No caso da telomerase, ela é constituída de RNA e proteínas, esse RNA possui várias repetições de CyAx que servem de molde para as repetições de GyTx dos telômeros. Ao contrario da transcriptase reversa, ela copia apenas um pequeno segmento de RNA de possui dentro dela mesma. 
As sequências dos nucleotídeos dos promotores são variáveis podendo influênciar na afinidade de ligação da RNA polimerase e, portanto, a freqüência de iniciação da transcrição. Mas o inicio da transcrição também é regulado por proteínas. Dentre essas proteínas temos:
	- os fatores de especificidade, que alteram a especificidade da RNA polimerase para um certo promotor ou conjunto de promotores (ex: fator σ);
	- repressores, que impedem o acesso da RNA polimerase ao promotor. Eles se ligam a sítios específicos do DNA, chamados operadores (sítios que estão bem próximos ao promotor), é a regulação negativa. A iteração do repressor com o DNA é comandada por um sinal molecular, geralmente chamado de efetor ou molécula sinal, ela pode induzir que o repressor se ligue ou se dissocie do DNA;
	- e os ativadores, que aumentam a interação RNA polimerase e promotor, é a regulação positiva. Da mesma forma que na regulação negativa, há uma molécula sinal que se liga ao ativador, e o induz a se ligar ou se dissociar do DNA. Seus sítios de ligação são geralmente adjacentes aos promotores. Pouca transcrição ocorre quando não há ligação do ativador.
A maioria dos mRNAs procarióticos é policistrônico, ou seja, genes múltiplos em um mesmo transcrito, e possuem um promotor único que inicia a transcrição. Essa estrutura é chamada operon, e é demonstrada pela figura abaixo: 
O operon da lactose (lac) inclui os genes para a β-galactosidase (Z), a galactosídeo permease (Y) e a tiogalactosídeo transacetilase (A). Tal operon é sujeito a regulação negativa. A ligação do repressor Lac reduz consideravelmente a velocidade da transcrição, mas não a impede complemente, este estado é caracterizado por ser o nível de transcrição basal não-restritivo.
	- quando as células são providas com lactose, o operon lac é induzido; uma molécula sinal (alolactose, um isômero da lactose, que é convertida pela β-galactosidase) se liga ao repressor Lac fazendo com que ele se dissocie do operador.
O operon lac também está sujeito a regulação positiva. Quando tanto glicose como lactose estiverem disponíveis para a bactéria ocorre a chamada repressão catabólica. Neste caso a CAP ou CRP ou proteína receptora de cAMP age como ativador do operon. 
	- o efeito da glicose é mediado por cAMP e CRP. Esta proteína possui sítios de ligação com o DNA e com o cAMP. Quando a glicose está ausente, a concentração cAMP aumenta, por este ser um composto de baixa energia. Com altas concentrações de cAMP, ele se liga a CRP, o que faz com que sua afinidade pelo DNA aumente, então a CRP se liga a um sítio próximo ao promotor lac, estimulando a transcrição. Quando há glicose, a concentração de cAMP diminui, então ele se dissocia da CRP, fazendo com que ela perca afinidade pelo DNA. Então a CRP se dissocia do DNA e diminui, portanto, a expressão do operon lac.
A CRP é um elemento regulador positivo que responde aos níveis de glicose, enquanto o repressor Lac é um elemento regulador negativo que responde aos níveis de lactose. Os dois agem coordenadamente; a CRP tem pouco efeito no operon lac se o repressor está bloqueado a transcrição; e a dissociação do repressor causa grande efeito apenas quando a CRP está ligada, facilitando a transcrição.
 
Uma rede de operons com um regulador comum é chamada de regulon. Como exemplo, o cAMP e a CRP estão envolvidos na regulação coordenada de muitos operons.
Operon tryptofano (trp)
Quando o trp é abundante na célula, ele se liga ao repressor Trp causando uma mudança conformacional neste e fazendo com que o repressor Trp se ligue ao operador trp inibindo a expressão do operon tpr -> regulação negativa -> impede o acesso da RNA pol ao promotor -> o próprio trp é a molécula sinal que se liga ao repressor.
O operon trp também é regulado por outro processo, chamado atenuação da transcrição, no qual a transcrição é iniciada, mas é interrompida abruptamente antes que os genes sejam transcritos. Este mecanismo depende do acoplamento íntimo entre a transcrição e a tradução, que ocorrem de forma quase simultânea nos procariotos, ou seja, assim que há uma parte de RNA pronta, ele já se liga ao ribossomo para iniciar a tradução.
	- o mecanismo de atenuação utiliza sinais codificados em quatro sequências dentro de uma região-líder de 162 nucleotídeos na extremidade 5’ do RNA. Dentro desta região há um atenuador, que são as sequências 3 e 4; elas formam uma estrutura de grampo rica em C≡G seguida de resíduos de U. Vários resíduos seguidos de U sinalizam o final da transcrição, então se esta estrutura de grampo seguida de poliU ocorrer, a RNA polimerase se dissocia do DNA. A sequência 2 é um pareamento alternativo para a sequência 3; se ocorrer o pareamento entre 2 e 3 não se forma a estrutura que indica o fim da transcrição.
	- a sequência 1 é que regula se haverá pareamento entre 2 e 3 ou entre 3 e 4 e, ou seja, se haverá ou não transcrição. Isso ocorre porque a sequência 1 é sensível aos níveis de trp dentro do citoplasma da célula, porque ela possui dois códons seguidos para o trp. Então, se há altas concentrações de trp o ribossomo passa rapidamente por esses dois códons, e segue para a sequência 2; com a sequência 2 ocupada pelo ribossomo as sequências 3 e 4 se paream sinalizando o fim da transcrição. Já se há baixa disponibilidade de trp, quando o ribossomo chegar ao dois códons de trp seguidos, ele vai demorar para adicionar o aminoácido, então as sequências 2 e 3 se paream, o que faz com que a transcrição continue.