Aula 7

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Quimioterápicos: conceito e 
mecanismo de ação II 
Farmácia Noturno 2013 
Fernanda Abreu 
fernandaaabreu@micro.ufrj.br 
Agentes Antimicrobianos 
Histórico: 
 
1860- Joseph Lister- fenol em instrumentação cirúrgica 
1909- Paul Ehrlich- salvarsan (composto arsênico)-sífilis 
1929- Alexander Fleming*- penicilina 
1932- Gerhard Domagk* -prontosil (sulfonamida) 
1939- aparecimento de resistência bacteriana 
1940- H. Florey* & E. Chain* -utilização da penicilina 
1944- Selman Waksman *e Albert Schatz- estreptomicina 
1945- Edward Abrahan- isolamento cefalosporina C 
1946- Selman Waksman - isolamento neomicina 
1947- Cloranfenicol, o primeiro antibiótico de amplo espectro 
1960- Descobre-se as cefalosporinas 
.... 
 
 
 
 
 
 
 Staphylococcus aureus X Penicillium notatum 
*** A partir desse momento todos acreditavam que 
a cura para todas as doenças infecciosas havia sido 
encontrada. 
Agentes antimicrobianos 
• Em curto espaço de tempo: aparecimento de estirpes resistentes à droga. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Resultado da pressão natural seletiva ocasionada pelo uso clínico de 
antibióticos e na agropecuária como promotores de crescimento e 
agentes profiláticos. 
 
• Associado à globalização ( diminuição de barreiras geográficas). 
S. Aureus MRSA 
Agentes antimicrobianos 
• Relação entre a quantidade utilizada e 
aparecimento de estirpes resistentes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aparecimento de resistência: frequência e 
período de uso, concentração elevada. 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência Intrínseca X Resistência Adquirida 
 
– Definição RI: resistência resultante do estado 
fisiológico do micro-organismo ou da sua 
organização estrutural. 
• Ex.: Vancomicina em Gram-negativas. 
Vancomicina Ampicilina 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência Intrínseca X 
Resistência Adquirida 
– Definição RI: resistência resultante 
do estado fisiológico do micro-
organismo ou da sua organização 
estrutural. 
• Ex.: Vancomicina em Gram-
negativas. 
Vancomicina Ampicilina 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência Intrínseca X Resistência Adquirida 
 
– Definição RA: decorrente de mutações no material genético bacteriano ou da 
aquisição de material genético codificando genes de resistência. 
 
– Estará presente em algumas estirpes da espécie bacteriana. 
 
– Genes de resistência podem estar: 
 
 - no cromossoso; 
 - em plasmídeos, podendo ser parte integrante ou não de transpósons ou de 
integrons. 
 
– Podem ser transferidos horizontalmente entre diferentes estirpes, espécies e 
gêneros  disseminação da resistência. 
 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Plasmídeos de resistência: 
• Denominados plasmídeo R; 
 
• São amplamente distribuídos em Gram-positivas e –
negativas; 
 
• Tamanho variado de 2 a 200kb; 
 
• Pode conter 1 (resistência simples) a vários (resistência 
múltipla) genes de resistência a drogas; 
 
• Alguns contêm genes que permitem autotransferência 
(plasmídeos conjugativos); 
 
 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Plasmídeos de resistência: 
 
 
Tabela página 544 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Genes de resistência: 
• Os que não possuem genes de autotransferência 
podem ser mobilizados para transferência por : 
– plasmídeos conjungativos; 
Ex.: Recombinação entre plasmídeo conjugativo (A) e plasmídeo 
não conjugativo (B): 
 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Genes de resistência: 
• Os que não possuem genes de autotransferência 
podem ser mobilizados para transferência por : 
– plasmídeos conjungativos; 
– Transdução gereneralizada (fagos: geralmente limitada a única 
espécie ou espécies relacionadas); 
– Podem estar em transpósons; 
– Ou transpósons conjugativos; 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Genes de resistência: 
• Os que não possuem genes de autotransferência 
podem ser mobilizados para transferência por : 
– Podem estar em transpósons; 
– Ou transpósons conjugativos; 
Transpósons: segmentos de DNA que 
podem transpor de uma posição para outra 
na mesma molécula de DNA ou outra 
diferente. 
Ex.: Cromossomo X plasmídeo 
 
Tn conjugativos possuem genes para 
autotransferência entre bactérias. 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Genes de resistência: 
• Em transpósons: 
 
 
Tabela página 545 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Mecanismos de acúmulo de genes de resistência a drogas em uma 
molécula de DNA: 
1. Integração sucessiva de transpósons carreando genes de resistência 
a drogas ao longo de múltiplas gerações bacterianas; 
 
 
 
Figura pág 555 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Mecanismos de acúmulo de genes de resistência 
a drogas em uma molécula de DNA: 
2. Aquisição de integrons; 
Integrons são elementos genéticos compostos por um sistema de 
recombinação sítio-específica que reconhece e captura cassetes 
móveis de genes. 
• Um integron inclui: 
– Um gene que codifica uma integrase (intI) utilizada na reação 
de recombinação e seu promotor; 
– Um promotor Pc para expressão dos genes componentes do 
cassete 
– Um ou mais cassetes de genes 
 
Figura pág 556 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Mecanismos de acúmulo de genes de resistência a drogas em uma molécula 
de DNA: 
2. Aquisição de integrons; 
Cassetes de genes são elementos genéticos móveis que podem existir como 
moléculas circulares livres incapazes de se duplicar ou integrados no sítio 
attI de um integron. Contem um sítio attC na extremidade 3´. 
 
 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Resistência adquirida 
– Mecanismos de acúmulo de genes de resistência a drogas em uma molécula 
de DNA: 
2. Aquisição de integrons; 
- Um integron pode ter mais de um cassete de genes que serão expressos em 
quantidade diferentes. 
- No caso de haver diferentes cassetes, a pressão seletiva para determinado 
determinante genético, selecionará outros genes de resistencia presentes 
no integron. 
 
 
Figura pág 558 
Mobilidade dos integrons está relacionada a sua presença frequente em 
transpósons, plasmídeos conjugativos ou mobilizáveis. 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Origem dos genes de resistência 
 
– O período entre o início do uso e aparecimento de resistência 
é pequeno, o que torna improvável que a mutação espontânea 
seja responsável unicamente pela resistência; 
 
– Todos os mecanismos identificados até o momento em estirpes 
relacionadas a infecções são também encontrados em micro-
organismos do ambiente. 
 
– Maior probabilidade: genes evoluíram em organismos 
produtores de antibióticos como forma de proteção e foram 
subsequentemente transferidos horizontalmente. 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Medidas tomadas para conter o espalhamento da resistência (CDC): 
1. Utilizar imunização para prevenir doenças; 
2. Evitar a introdução desnecessária de dispositivos parenterais, como 
cateteres; 
3. Ter como alvo o patógeno (isolar o agente infeccioso e fazer 
antibiograma); 
4. Realizar o controle antimicrobiano (estar atualizado em relação ao 
tratamento adequado); 
5. Utilizar dados locais; 
6. Tratar a infecção, não a contaminação (utilizar técnicas antissépticas 
para coletar amostra); 
7. Tratar com o agente antimicrobiano menos exótico; 
8. Monitorar o uso de antimicrobiano (interromper o uso assim que o 
tratamento terminar ou casoo diagnóstico não seja confirmado; dor 
de garganta x Streptococcus X vírus) 
9. Isolar o patógeno (manter indivíduos infectados em áreas 
específicas e descontaminar material); 
10. Romper a cadeia de contágio (higiene pessoal). 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
 
1. Alterações no sítio-alvo da droga 
2. Expressão de altos níveis da enzima cuja ação é 
bloqueada pela droga 
3. Redução da permeabilidade celular em relação à droga 
4. Mecanismo de efluxo da droga 
5. Presença de segunda enzima que executa a reação 
metabólica inibida 
6. Produção de enzimas modificadoras das drogas 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
 
1. Alterações no sítio-alvo da droga 
2. Expressão de altos níveis da enzima cuja ação é 
bloqueada pela droga 
3. Redução da permeabilidade celular em relação à droga 
4. Mecanismo de efluxo da droga 
5. Presença de segunda enzima que executa a reação 
metabólica inibida 
6. Produção de enzimas modificadoras das drogas 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
 
1. Alterações no sítio-alvo da droga 
• Geralmente ocasionado por mutações espontâneas no 
cromossomo bacteriano, resultando na síntese de proteína 
modificada. 
• Não ocorre a ligação ao agente antimicrobiano. 
Ex.: β-lactâmicos  modificação na estrutura das PBPs 
 Vancomicina  Em alguns enterococos foi observado que a 
parede celular era formada sem os resíduos de D-Ala-D-Ala, 
havendo modificação do sito alvo da vancomicina. Genes 
presentes em transpóson são responsáveis pela modificação. 
 
 
Figura pagina 548 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
 
2. Expressão de altos níveis da enzima cuja ação é 
bloqueada pela droga 
• Geralmente ocasionado por mutações espontâneas no 
cromossomo bacteriano que afetam os elementos reguladores 
da expressão dos genes. 
Ex.: β-lactâmicos  aumento no nível de PBPs 
 
 
Figura pág 549 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
 
3. Redução da permeabilidade celular em relação à droga 
• Resistência relacionada a presença do operon marRAB Sistema 
MAR – Multiple Antibiotic Resistence); 
• Observado em bactérias Gram-negativas; 
• O produto do gene marA inibe a expressão da porina OMPF, o 
que reduz a permeabilidade da célula e leva a resistência a várias 
drogas. 
• Ex.: resistência a tetraciclina. 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
4. Mecanismo de efluxo da droga 
• Geralmente mediada por plasmídeo (Ex.: resistência a 
tetraciclina). 
• Novas proteínas de membrana citoplasmática aparecem do 
envelope celular e bombeiam a droga para fora da célula. 
• Assim, não há o acúmulo de droga dentro da célula. 
• Transporte dependente de ATP ou força proton motiva. 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
5. Presença de segunda enzima que executa a reação 
metabólica inibida 
• Geralmente mediada por plasmídeo; 
• Ex.: Sulfas  plasmídeo R que codifica outra diidropteroato-
sintetase. A eficiente de ligação da droga a nova enzima é 10.000 
vezes menor. 
Mesmo ocorre para trimetoprim 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
6. Produção de enzimas modificadoras das drogas 
• Geralmente mediada por plasmídeo; 
• Genes envolvidos na resistência muitas vezes fazem parte de 
transpósons; 
• As drogas são modificadas e tornam-se inativas; 
Ex.: Cloranfenicol: acetilação pela enzima CAL (cloranfenicol acetil-
transferase), tornando a droga inativa. 
 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Mecanismos mediadores de resistência a drogas 
6. Produção de enzimas modificadoras das drogas 
• Ex.: β-Lactâmicos: 
• Produção de β-lactamase que quebram anel β-lactâmico; 
• β-lactamases de Gram-positivas são secretadas no meio; 
• β-lactamases de Gram-negativas são secretadas no espaço 
periplasmático; 
Figura página 554 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• Como contornar a resistência? 
• Associação de compostos ao tratamento de forma a inibir a 
resistência aos antibióticos: Sinergismo. 
• Ex.: ácido clavulânico: produzido por Streptomyces 
clavuligerus  forma complexo irreversível com β-
lactamases. 
 Sulbactam: ação semelhante; droga semissintética 
Resistência a agentes antimicrobianos 
• A interrupção do uso de determinado antibiótico pode eliminar os 
genes de resistência? 
 
– Estudos mostram que esses genes e elementos genéticos envolvidos 
na HGT tem certa estabilidade; 
 
– Outros fatores ambientais podem estar envolvidos na persistência da 
resistência; 
 
– Ex.: Caso um plasmídeo de R contenha outros genes que codifiquem 
alguma vantagem seletiva, como fatores que aumente a eficiência de 
colonização do ambiente ou resistência a metais pesados. 
 
– Além disso, os mecanismos de transferência de genes em bactérias 
são contínuos. 
Aula Prática 
02/09/2013 
Prática 6 
Classificação de bactérias: provas bioquímicas II 
Provas bioquímicas 
• São utilizadas para auxiliar na identificação e 
classificação dos micro-organismos. 
• São baseados em métodos bioquímicos para 
evidenciar características metabólicas e 
atividades enzimáticas das bactérias. 
• Resultados dados como positivos ou 
negativos são analisados em tabelas para 
identificação. 
 
Tabela de Resultados 
Teste Bioquímico Resultado 
Fermentação da glicose (+ ou -; com gás –
G; sem gás - SG 
Fermentação manitol 
Fermentação lactose 
VM 
VP 
Metabolismo aeróbico X fermentativo 
Teste do citrato 
Coloração de Gram 
Tubo escolhido: X 
Interpretação dos resultados 
• Fermentação da glicose, manitol e lactose 
Meio com: 
-único carboidrato fermentável 
-indicador de pH; 
Vermelho de fenol 
pH ácido  amarelo 
pH básico  vermelho 
-Tubo de Durham 
O que observar no resultado: 
-Produção de ácido; 
-Produção de gás. 
A e B  positivo 
C  controle não inoculado 
D e E  negativo 
Interpretação dos resultados 
• Fermentação da glicose ácida mista (VM) 
O Vermelho de Metila é um 
indicador de pH. 
 
ADICIONADO APÓS 
CRESCIMENTO 
 
 Vira quando há intensa 
acidificação do meio (pH 4,4). 
 
Esta prova só pode ser feita 
após 48 horas de incubação. 
 
Adicionar 2 a 5 gotas do 
indicador de pH. 
Interpretação dos resultados 
• Fermentação Butileno glicólica 
Produção de acetoína a partir da glicose 
Após crescimento: 
-Adicionar 2-5 gotas de reagente Barrit A; 
 
-Adicionar 2-5 gotas de reagente Barrit B; 
 
-Agitar levemente; 
 
-Esperar 10-15 minutos para ler 
resultados 
Barritt A + acetoína ------------------> H2O + diacetil + guanidina (cor vermelha) 
α-naftol 
Barritt B (KOH) 
O2 
Interpretação dos resultados 
• Metabolismo respiratório x Metabolismo 
fermentativo 
O meio de HUGH-LEIFSON. 
 
Indicador de pH o azul de bromotimol 
 ácido é amarelo 
 neutro é verde 
 pH básico, azul 
 
Facultativos cresceem nos 2 tubos 
 
Metabolismo oxidativo cresce apenas na 
superfície do tubo sem vaselina. 
 
Crescimento evidenciado pela 
produção de ácidos em ambos os metabolismos. 
 
Interpretação dos resultados 
• Prova do citrato 
Meio contendo indicador de 
pH 
Azul de bromotimol 
 
Utilização do citrato leva à 
produção de CO2 que se 
complexa com sódio e água do 
meio gerando carbonato de 
sódio. 
PROVAS BIOQUÍMICAS II – 
ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
 
Prática 7Prática 7 
• No metabolismo celular microbiano, como 
em outras células animais, a degradação de 
metabólitos e os processos para obtenção de 
energia e de biossíntese são regulados por 
catalisadores biológicos que são as enzimas. 
Estas enzimas podem ser extracelulares 
(exoenzimas) ou intracelulares 
(endoenzimas). 
Prática 7 
1) Hidrólise do Amido 
 Inóculo em meio de ágar amido 
Princípios: 
• Após o crescimento, caso o micro-organismo possua as 
exoenzimas para degradação de amido surgirá um halo 
incolor em volta do crescimento de bactérias 
produtoras de amilase devido à ausência de amido 
naquela região. 
 
• Execução: Com a alça de platina flambada coletar um 
pouco da cultura e inocular em 4 pontas da placa de 
ágar + amido. Incubar 24/48h a 37oC.; 
 
Prática 7 
2) Redução do Nitrato 
 
Princípios: 
• No metabolismo oxidativo o oxigênio (O2) é o aceptor final de 
elétrons na cadeia respiratória dos aeróbios enquanto o nitrato 
(NO3) é um dos possíveis aceptores finais de elétrons nos 
anaeróbios facultativos. 
 
• No meio de cultura é adicionado nitrato em excesso. Se o micro-
organismo possuir a enzima, mesmo na presença de oxigênio, com 
o excesso de nitrato ele reduzirá este substrato a nitrito. 
 
• Execução: Com o auxílio de uma alça coletar um pouco de cultura e 
inocular no meio de água peptonada nitratada (marca preta); 
 
 
Prática 7 
3) Formação de H2S e Indol e Observação de 
Mobilidade em Meio Sólido 
 
Princípios: 
 a) Formação de H2S (2 modos) 
- Cisteína da peptona do meio 
- Tiosulfato de sódio do meio 
 
 
 
* Tira de papel embebida em acetato de chumo . Na presença de H2S forma 
sulfeto de chumbo (precipitado escuro) 
 
Prática 7 
3) Formação de H2S e Indol e Observação de 
Mobilidade em Meio Sólido 
 
Princípios: 
 b) Produção de Indol 
 
 
 
 
Se o micro-organismo produzir a enzima triptofanase, ele será capaz de degradar o 
aminoácido triptofano produzindo indol. O indol é revelado pelo reativo de Kovak. 
 
** Reativo de Kovac embebido em fita. 
Prática 7 
3) Formação de H2S e Indol e Observação de 
Mobilidade em Meio Sólido 
 
Princípios: 
 b) Produção de Indol 
 
 
 
 
Se o micro-organismo produzir a enzima triptofanase, ele será capaz de degradar o 
aminoácido triptofano produzindo indol. O indol é revelado pelo reativo de Kovak. 
 
** Reativo de Kovac embebido em fita. 
Prática 7 
3) Formação de H2S e Indol e Observação de 
Mobilidade em Meio Sólido 
 
Princípios: 
 c) Observação de Mobilidade em Meio Sólido 
 
 
 
 
• Observação da turvação do meio após inóculo e incubação 
 
• Inocular o meio SIM com a agulha de inoculação, dando uma picada de 1cm abaixo da 
superfície 
Prática 7 
 4) Prova da Uréia 
 
Princípios: 
• Caso o micro-organismo possua a enzima urease, ele 
produzirá amônia/carbonato de amônia, produto 
básico que alcalinizará o meio que possui como 
indicador de pH o vermelho de fenol que em pH 
básico fica rosa/vermelho e em pH ácido e neutro 
fica amarelo. 
 
 
 
Prática 7 
 5) Prova da Catalase 
 
Princípios: 
• Caso o micro-organismo possua a enzima catalase 
haverá o desprendimento de bolhas dentro do tubo 
de cultura. 
 
 
 
 
PROVAS BIOQUÍMICAS II – ATIVIDADE 
ENZIMÁTICA 
OBJETIVOS GERAIS DA PRÁTICA 
• Justificar a importância das provas 
bioquímicas na classificação bacteriana. 
• Interpretar os resultados dos testes 
bioquímicos realizados. 
 
PROVAS BIOQUÍMICAS II – ATIVIDADE 
ENZIMÁTICA 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS DA PRÁTICA 
 
1) Hidrólise do Amido 
 
Verificar se o microrganismo possui a enzima amilase. 
 
2) Redução do Nitrato 
 
Verificar a capacidade do microrganismo produzir a enzima nitrato redutase respiratória, responsável 
pela redução do nitrato a nitrito. 
 
3) Formação de H2S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido 
 
Verificar a capacidade do microrganismo produzir gás sulfídrico (ou sulfeto de hidrogênio); 
Verificar a capacidade do degradar o aminoácido triptofano; 
Verificar se o microrganismo é móvel ou não. 
 
4) Prova da Uréia 
 Verificar a capacidade do microrganismo produzir a enzima urease. 
 
5) Prova da Catalase 
Verificar se o microrganismo possui a enzima catalase. 
 
PROVAS BIOQUÍMICAS II – ATIVIDADE 
ENZIMÁTICA 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 
Provas Bioquímicas II – Atividade Enzimática 
 
• Escolher o tubo com cultivo do microrganismo desconhecido repicado na aula 
anterior; 
 
• Preparar e observar uma lâmina do microrganismo desconhecido corado por 
coloração de Gram; 
 
• Hidrólise do amido 
– Com a alça de platina flambada coletar um pouco da cultura e inocular em 4 pontas da placa 
de ágar + amido. Incubar 24/48h a 37oC.; 
 
• Redução do nitrato 
– Com o auxílio de uma alça coletar um pouco de cultura e inocular no meio de água peptonada 
nitratada (marca preta); 
 
PROVAS BIOQUÍMICAS II – ATIVIDADE 
ENZIMÁTICA 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 
Provas Bioquímicas II – Atividade Enzimática 
 
• Formação de H2S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido 
– Inocular o meio SIM com a agulha de inoculação, dando uma picada de 1cm abaixo da 
superfície. 
– Colocar uma tira embebida com o reativo de Kovac (para a prova do indol) 
– Colocar uma tira embebida em acetato de chumbo (para a prova do H2S); 
 
• Prova da Uréia 
– Com o auxílio de uma alça de inoculação coletar uma porção da cultura e inocular no meio 
com uréia; 
 
• Prova da Catalase 
– É feita vertendo água oxigenada (H2O2) no próprio tubo de ágar inclinado contendo a bactéria 
crescida; 
 
• Incubar a estante com os tubos na estufa para leitura e interpretação na aula 
seguinte.