Análise de Eletroferograma de Sequenciamento de DNA

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SEQUENCIAMENTO DE DNA
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É comum a existência de dúvidas no 
momento de analisar os resultados de 
um eletroferograma. 
Preparamos este breve conteúdo para 
auxiliar na análise dos dados provindos 
de um sequenciamento de DNA, e nos 
colocamos à disposição para 
esclarecimento de maiores dúvidas. 
Esperamos que o material seja útil. 
Boa leitura!
SOBRE A MYLEUS BIOTECNOLOGIA 
A biologia molecular em seus diversos aspectos tem se tornado cada dia mais importante para o 
desenvolvimento da pesquisa nas diversas áreas de estudo das ciências da vida. Nesse contexto, a 
Myleus Biotecnologia oferece serviços de apoio à pesquisa na área de genômica e sequenciamento 
de DNA.
A empresa conta com equipe técnico científica com elevada formação e experiência. Seus profissio-
nais garantem um serviço de alta qualidade, entregando os resultados com agilidade. Além disso, 
oferecemos preços competitivos, tornando a Myleus a melhor escolha para os serviços de sequen-
ciamento de DNA.
Os profissionais da Myleus garantem um serviço de alta qualidade e precisão. Os testes são realiza-
dos e os resultados são entregues com agilidade. Além disso, trabalhamos com preços competiti-
vos que tornam a Myleus a melhor escolha do mercado nacional.
Oferecemos serviços de sequenciamento capilar, sequenciamento de DNA e sequenciamento de 
DNA pelo método de Sanger.
A Myleus conta com estrutura laboratorial própria. Nosso laboratório segue as normas de gestão da 
qualidade ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005 e está em processo de acreditação.
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Para a análise dos dados provindos de um sequenciamento de DNA, é essencial utilizar um programa que permita a análise do eletroferograma 
e demais dados disponibilizados. Qualquer programa de sua escolha pode ser utilizado. A Myleus recomenda a programa gratuito da
ThermoFisher, Sequence scanner. Seguem abaixo algumas observações:
Esse é um exemplo do resultado esperado para um sequen-
ciamento de boa qualidade. É possível ver o pico de cada base 
muito bem definido e com boa intensidade. A sequência 
possuí um pequeno ruído, que pode ser visto na parte de 
baixo, mas o ruído nesse caso não atrapalha a análise. As 
barras azuis acima da figura indicam o QV (quality value) 
obtido na leitura. 
Quanto maior o QV, maior é a certeza de que a base lida está 
correta. Normalmente trabalha-se com a premissa de que QVs 
acima de 15 indicam uma boa qualidade. Um QV de 15 signifi-
ca que existe uma chance de 3% de a base ter sido identifica-
da erroneamente. Bases com o QV abaixo de 15 devem ser 
analisadas visualmente para o usuário tentar chegar a uma 
conclusão.
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Acima temos um exemplo de um sequenciamento que não 
apresentou um bom resultado. Isso pode ser visualizado pelos 
picos sobrepostos e provavelmente ocorreu devido a uma am-
plificação inespecífica. Isso pode ocorrer por alguns motivos. 
Seguem abaixo alguns deles e como eles podem ser solucio-
nados:
1) Contaminação da reação com primers forward e reverse. Se 
seu produto de PCR não está sendo purificado, é possível que 
o restante de primers da PCR esteja prejudicando o sequencia-
mento. Nesse caso, a purificação pode resolver.
2) Contaminação pela presença de fragmentos de outros 
tamanhos. É possível visualizar, por gel, se sua PCR está geran-
do apenas o fragmento desejado ou se existem bandas conta-
minantes. Caso existam bandas contaminantes, você pode 
recortar a sua banda do gel, purificá-la e enviá-la para 
sequenciamento.
3) Contaminação pela presença de fragmentos do mesmo 
tamanho. Isso ocorre quando sua amostra não está pura e 
duas espécies diferentes têm seu DNA amplificado. Esse caso 
normalmente é identificado quando todo o eletroferograma 
apresenta picos sobrepostos. Nesse caso, mesmo utilizando o 
gel de agarose não será possível visualizar a contaminação. O 
processo de separação de espécies/amostras deve ser revis-
to.
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O padrão ao lado representa um problema que pode ser devido ao exces-
so de DNA molde. Ou seja, muito DNA. 
O excesso de DNA faz que com todos os reagentes sejam consumidos no 
inicio da reação de sequenciamento, fazendo com a reação perca eficiên-
cia rapidamente. Isso pode ser visto pelo padrão descendente visto na 
figura da esquerda e na parte superior da figura da direita. 
Ambas essas figuras são o dado bruto de um resultado de sequenciamen-
to. Elas podem ser vistas na aba RAW do programa. Na figura da direita, 
abaixo, é possível ver o eletroferograma representativo do excesso de DNA 
molde na reação. Esse problema também ocasiona em um ruído alto com 
picos “falso positivos”, ou seja, ruídos são lidos como picos.
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A figura acima representa um eletroferograma com sinal muito 
baixo. Alguns dos motivos para isso são: baixa quantidade 
baixa de DNA molde na reação de sequenciamento ou 
mesmo à falha da reação. O sinal baixo pode ser confundido 
com background, o que dificulta a leitura das bases.
Estes são apenas alguns dos problemas que podem ser 
visualizados em uma reação de sequenciamento que não 
foi eficaz. Caso seu resultado não se enquadre em um 
desses perfis, ou você tenha outras dúvidas, a equipe téc-
nica da Myleus está à disposição para ajudá-los no que 
for possível.
Obrigado por acessar o site da Myleus!
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