09 Aula Análise deDNA

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ANÁLISE DE DNA
ANÁLISE DE DNA
Limitação: necessidade de DNA em grande quantidade
Fragmentação do DNA 
por endonucleases 
restritivas
Fragmentos sofrem 
eletroforese no gel de 
agarose (separação por 
tamanho)
Transferência para papel 
de nitrocelulose
Papel é mergulhado em 
solução com sonda de 
DNA marcado 
radioativamente (se liga 
ao DNA de seu interesse)
Hibridização entre DNA 
marcado e fragmentos Revelação
1. Southern Blot
ANÁLISE DE DNA
• Elementos necessários: Primer*(oligonucleotódeos), Desoxinucleotídeos
trifosfatos( ATP, GTP…), DNA molde, DNA polimerase termoresistente( Taq
polimerase), Solução tampão e Mg++.
• Termociclador- realiza ciclos com variações térmicas em intervalos precisos.
• Desnaturação- Temperatura elevada leva a separação das fitas.
• Anelamento- Temperatura reduzida para o anelamento dos primers.
• Extensão- Temperatura um pouco mais elevada para que a Taq polimerase 
sintetize o DNAc no segmento de interesse.
2. PCR
ANÁLISE DE DNA
PCR em tempo real
• Análise quantitativa e 
qualitativa
• Sonda com quimioluminescência
PCR tradicional
• Análise qualitativa
ANÁLISE DE DNA
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3. Microarranjo
Utilizado para avaliar a expressão de genes específicos- Diagnósticos, pesquisas 
científicas.
1. Os RNAm são transcritos reversamente em DNAc que por sua vez são 
marcados radioativamente.
2. A amostra interage com um chip que possui em cada ponto uma sequência de 
DNA complementar ao transcrito final de um gene.
3. Os DNAc anelam-se às suas sequências correspondentes e o excedente não 
hibridizado é “lavado”.
4. Cada ponto fluorescente representa um gene expresso.
Um DNA-chip consiste num arranjo pré-definido de moléculas de DNA 
covalentemente ligadas à uma superfície sólida.
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4. DNA recombinante/ Clonagem gênica
• DNA de interesse isolado por 
endonucleases de restrição
• Transcrição reversa em cDNA - sem 
íntrons
• Introdução do gene no plasmídeo por 
meio de DNA ligases. 
• O vetor de clonagem se multiplica 
com o seu hospedeiro → clonagem 
do fragmento recombinante 
• Produção do material de interese
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