Coleta fungos

Prévia do material em texto

Colheita, Isolamento Primário Semeadura, tempo de observação dos isolamentos primários de fungos
Prof. Dr. Bruno Jaegger Laranjeira
Coleta e Transporte
Etapa + importante;
Coleta incorreta:
Inutilização de todos os procedimentos posteriores;
Pode redundar em resultados falsos.
Perguntar ao paciente qto ao uso de antifúngicos
Uso tópico = suspensão durante 15 dias;
Uso sistêmico = 1 mês.
Suspensão do medicamento deve ser acordada com o médico do paciente.
Ficha Padrão
Dados epidemiológicos do paciente: Identificação, origem, residência, tempo de evolução da doença;
Localização e aspecto clínico da lesão, possível contato com animais;
Uso de drogas antifúngicas nos últimos 30 dias;
Suspeita clínica.
Processamento da amostra:
em até 2 horas ou em 24 horas mantidas sobre refrigeração.
Pele
Higienização do local com álcool 70%;
Raspado das bordas da ferida com lâmina de bisturi, ou com uma lâmina de microscopia recém quebrada ao meio;
Escolher as lesões mais recente;
Se apresentar várias lesões, coletar material das lesões em um único bloco de amostras;
Acondicionar as amostras em pequenas placas de petri.
Método de Porto
Raspado de Pele
Pêlos 
Higienização do local com álcool 70%; 
Coletar em áreas de alopécia (rarefação de pêlos)
Coleta por arrancamento com pinça. Não cortar, pois foco infeccioso se encontra no bulbo piloso.
Unhas 
Higienização do local com álcool 70%;
Material: tesouras, limas, alicates e diversas curetas dermatológicas;
Retirar material da região de progressão e confluência do tecido são com o doente;
Raspagem profunda das áreas quebradiças, distróficas e descoloradas;
Paroníquia=coletar pus com swab. 
Mucosas, orifícios naturais e secreções diversas
Swab estéril: 2 amostras (exame direto e cultura);
Casos particulares:
Boca (lesão vegetante): biópsia ou raspagem com cureta dermatológica
Ânus:
Lesão escamosa: escamas da periferia;
Lesão ulcerada: curetagem ou biópsia;
Vagina: 2 swabs de fundo de saco e 2 da endocérvix.
Conjuntiva e córnea
Raspagem ou debridação pelo oftalmologista;
Semear rapidamente=evita a dessecação
Biópsia do centro e periferia das lesões;
Histopatológico: formol
Micológico: solução salina.
Micoses subcutâneas e profundas
Tecidos ou órgãos
Sangue e medula óssea
Coleta de sangue venoso feito por punção com seringa e agulha estéreis.
Coletar quando suspeita de infecção do sistema nervoso central (punção lombar);
Se o processamento não for imediato, deixar a temperatura ambiente; não refrigerar pois o próprio fluido manterá cultivo dos fungos até serem cultivados
Líquido cefalorraquidiano (LCR)
Urina
20 a 30 ml jato médio em frasco estéril;
Sonda vesical implantada no momento da coleta;
Punção suprapúbica;
Não utilizar urina armazenada em bolsa coletor, ligada a sonda vesical;
Analisar após, no máximo, em 2 horas.
Fezes 
Colher uma pequena qtde em frasco estéril;
Processar em 2 horas;
Pele sobre as lesões deve ser desinfetada (alcóol 70% ou iodado);
 Exudato aspirado com seringa e agulha estéreis.
Pus e líquidos patológicos
Escarro
Lavar boca com água antes da coleta;
 Se não tiver escarro, poderá ser estimulado com neublização com salina;
 Colocar escarro em frasco estéril;
 Enviar ao laboratório em até 2 horas;
Lavados brônquicos e aspirados traqueais constituem melhores espécimes clínicos.
Microscopia
Exame direto:
Material clínico montado entre lâmina e lamínula, imerso em solução clarificante;
Hidróxido de sódio ou potássio a 40% ou tinta da china.
Fragmentos de biópsia: prata-metenamina ( Grocott-Gomori), PAS, ou HE. 
Auxiliar primário no diagnóstico clínico.
Cryptococcus neoformans em contraste com tinta da China
Aspergilose invasiva. corte longitudinal de uma arteríola pulmonar cuja luz encontra-se invadida por hifas,muitas delas septadas e ramificando-se em ângulo agudo. Coloração PAS.
Montagem de lâmina para exame direto:
Sobre uma lâmina colocar 2 gotas de solução clarificante (KOH ou NaOH 40%);
Colocar sobre as gotas as escamas de pele e cobrir com a lamínula;
Aguardar 5 a 10 min. e observar na objetiva de 40X;
Pêlo e cabelos: dar preferência àqueles quebrados, anormais e aos bulbos pilosos;
Unhas: quanto mais fino for o fragmento, melhor será a visualização dos fragmentos fúngicos. 
O que é isolamento primário?
Microorganismos que crescem a partir do material clínico, em meio basal;
Os meios podem ser acrescidos de inibidores de fungos saprófitas;
Não são de todos prejudiciais para a maioria dos fungos patogênicos;
Cicloeximida = inibe o crescimento de Cryptococcus neoformans. 
Isolamento primário
Utilização, em geral de 3 meios:
Ágar Sabouraud simples;
Ágar Sabouraud com cloranfenicol;
Ágar Sabouraud com cloranfenicol e cicloeximida.
Exceções
Suspeita de pitiríase versicolor: 
Ágar Sabouraud + azeite de oliva;
Meio Dixon.
Quando houver presença de leveduras no E.D.:
Semear em placas contendo o meio CHROMagar (meio cromogênico);
Suspeita de histoplasmose e paracoccidioidomicose:
Saboraud com BHI (SABHI)
Fezes:
Sabouraud + clor + gentamicina, Sabou. +cicloex + genta
CHROMagar
Semeadura
Pele, pêlo, cabelos e unhas:
Semeio com garfo na profundidade do meio, em 3 pontos equidistantes do tubo contendo ágar;
Mucosas, orifícios naturais e secreções diversas:
 Semear com swab a superfície do meio e no CHROMagar semear um ponto e continuar com alça de platina;
Biópsias de tecidos:
Semear os fragmentos de tecido com garfo.
Sangue periférico, medula óssea, LCR, escarro, pus e líquidos patológicos:
Semear com alça de platina ou colocar uma alíquota de 0,1 ml nos tubos, com seringa ou pipeta Pasteur.
Urina:
Semelhante aos outros líquidos e no CHROMagar semear com alça calibrada.
Tempo de observação
Escamas de pele, pêlo, cabelos e unhas:
No máximo de 15 dias para dermatófito, com observação diária após 3º dia de semeadura;
Suspeita de levedura: 5 dias, observação diária após 2º dia de observação.
Demais amostras:
Máximo de 30 dias para fungos filamentosos e dimórficos, com observação diária;
Suspeita de leveduras: 24-72h, com observação diária.
Temperatura de incubação
Temperatura ambiente;
Malassezia sp. 32ºC
Aspectos Gerais de Fungos Filamentosos 
Caracterização das colônias:
Tamanho da colônia;
Características das bordas;
Textura;
relevo.;
Pigmentação.
Tamanho da colônia
Visualização em placas;
Observação de macrocolônias;
Bordas
Bem delimitadas a irregulares, lembrando franjas;
Pode ser peça chave para indentificação;
Ex: Sporothrix schenckii (colônias velhas apresentam bordas escurecidas).
Textura
Colônias algodonosas: aspecto de algodão;
Colônias furfuráceas: lembram um punhado de substância farinácea espalhada em uma superfície;
Colônias penugentas: lembram pequenos fragmentos de penugem de aves;
Colônias arenosas: lembram areia de praia;
Colônias veludosas: aspecto aveludado;
Colônias glabrosas: aspecto de cera ou manteiga (leveduras)
Relevo
Topografia de determinada colônia:
Colônias cerebriforme: topografia de altos e baixos;
Colônias rugosa: variação da cerebriforme, com pregas menos evidentes e, às vezes radiais a partir do centro;
Colônias apiculadas: saliência na parte central;
Colônias crateriformes: se aprofundam no meio
Pigmentação
Se é encontrada no verso ou reverso;
Se é encontrada tanto no verso qto no reverso;
Se é ou não difusível no meio;
Pode estar presente em um tipo de meio, mas em outro não
Achados micromorfológicos
Importante na identificação final;
Pesquisa de estruturas de reprodução e ornamentação;
Montagem em lâmina e lamínula de uma alíquota da cultura, com 1 gota de lactofenol azul de algodão;
Hifas estéreis: Usar meios de enriquecimento (ágar lactrimel).
Microcultivo em lâmina (ágar-batata: 4-5mm)
Leveduras
Crescem bem em 48h;
Temperatura entre 25-37 ºC;
Em meios micológicos e bacteriológicos comuns, incluindo ASA e ágar BHI;
Colôniasglabas, cor branca ou bege, textura cremosa e superfície lisa;
E.D.: estruturas arredondadas ou ovais em brotamento (blastoconídios), associados ou não a presença de hifas ou pseudo-hifas.
Métodos específicos de identificação
Pesquisa de:
Presença de cápsula, ascos, blastoconídios, clamidoconídios, artroconídios, hifas,pseudo-hifas;
Formação de tubo germinativo
Prova do tubo germinativo
Distinção entre Candida albicans e C. dubliniensis;
Projeção alongada, que emerge da levedura, qdo entra em contato com soro humano;
Inocula-se a levedura em 0,5-1 ml de soro (humano,cavalo, coelho);
Incuba-se a suspensão a 37ºC, 2-3 horas
Tubo germinativo de Candida albicans 
Prova do microcultivo
Meios:
Ágar-arroz-twen80 (melhor para clamidoconídios);
Ága-fubá-twen80 (melhor para blastoconídios);
Rotina: ágar sabouraud dextrose.
Microcultivo de C. albicans
Candida tropicalis 
Geotrichum
Técnica:
Tocar as colônias de leveduras recentes (24-48h), com alça de platina estéril;
Fazer de 3-4 estrias paralelas sobre o ágar (em placa de petri), sem perfurar o meio;
Cobrir as estrias com uma lamínula, na porção central, e pressiona levemente com a pinça;
Incubar a placa a 25-30ºC, 48-96 horas.
Microcultivo leveduras 
Assimilação de carboidratos ou auxonograma
Meio: Yeast Nitrogen Base;
Destituído de qualquer fonte de carbono;
Adição de acúcares: dextrose, sacarose, maltose, galactose, lactose;
Positividade: formação de halo de crescimento;
Controle positivo: assimilação de dextrose;
Identificação: através da tabela. 
Auxonograma: 1Glucosa(+); 2 Maltosa (+); 3 Sacarosa (+); 4 Galactitol (+); 5 Inositol (+); 6 Lactosa (–);7 Melibiosa (–); 8 Eritritol (–). 
Assimilação de nitrogênio
A levedura utiliza um composto nitrogenado como fonte de energia;
Fonte utilizada: nitrato de potássio
Fermentação de Carboidratos
Crescer anaerobicamente na presença de determinado açúcar;
Colocar 200µl a solução de levedura na solução de carboidrato (2%), em tubos, que já tem um tubo de Durham invertido;
Incubação 25-30ºC, 48-96 horas;
Positividade: formação de bolhas;
Identificação: ver tabela.
Outros sistemas de identificação
Manuais;
Automatizados;
Obrigado!!!!