Espectrofotometria: Fundamentos e Aplicações

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Técnica Espectrofotométrica 
Professor Luiz 
Métodos Instrumentais de Análise 
Fundamentos da Espectrofotometria 
Baseia-se na interação da matéria com a energia radiante 
 
Luz 
incidente 
Luz 
emergente 
Luz absorvida 
Perdas: 
 - reflexões 
 - dispersão 
 -absorção 
•Boa sensibilidade 
•Baixo custo de 
análise 
•Fácil operação 
•Equipamentos 
robustos 
Equipamento 
Equipamento 
Espectro UV-Visível 
Toda molécula é 
capaz de absorver 
energia a partir da 
radiação emitida 
pelo aparelho 
Entretanto, a quantidade de 
energia absorvida irá variar 
de acordo com a energia 
emitida 
(para cada comprimento de 
onda, existe uma 
quantidade específica de 
energia absorvida pela 
molécula) 
Espectros de absorção de diferentes substâncias 
Espectros de absorção diferentes substâncias 
(1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3: clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno) 
Cada substância apresentará um pico 
de absorbância característico e o 
comprimento de onda de emissão 
correspondente deverá sempre ser 
ajustado no aparelho antes de 
qualquer análise. 
Teoria da Espectrofotometria 
• Lei de Lambert 
 
• Lei de Beer 
 
1 cm 
Io IT1 
Io IT3 
3 cm 
solução 10 g/l 
Io IT1 
solução 20 g/l 
 
IT2 
 
Io 
It = Io 10
-Kl 
It = Io 10
-K´c 
A quantidade de energia transmitida 
depende da quantidade de moléculas 
presentes, ou seja, da concentração da 
substância analisada. 
A quantidade de energia transmitida 
depende do caminho óptico seguido pela 
radiação. 
Quanto maior a quantidade de moléculas 
(concentração), maior a quantidade de 
radiação absorvida (absorbância) e menor a 
quantidade de energia transmitida 
(transmitância) 
Quanto maior a barreira a ser 
atravessada pela radiação, menor a 
quantidade de energia na radiação 
transmitida. 
Lei de Beer-Lambert 
A espectroscopia de absorção molecular está baseada 
na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que 
estão relacionadas através das equações: 
A : Absorbância 
e: Coeficiente de Extinção Molar 
b: largura da cubeta 
c: concentração da substância 
Lei de Beer-Lambert 
A absorbância é muito importante porque ela é diretamente proporcional à 
concentração, c, de espécies absorventes de luz na amostra 
 
Caso a análise espectrofotométrica seja 
efetuada no mesmo equipamento e 
com a mesma cubeta, os fatores e e b 
serão constantes e absorbância só irá 
variar com a concentração da 
substância (de maneira linear). 
Desvios da Lei de Beer-Lambert 
• LIMITAÇÃO REAL 
– A Lei é válida somente para baixas concentrações. 
– Em Altas concentrações a interação entre as moléculas afeta a 
distribuição de radiação, alterando o coeficiente de absortividade 
molar (e). (Manter Absorbância inferior a 1,000) 
 
• DESVIO QUÍMICO 
– Surge quando a molécula sofre dissociação, associação ou reação na 
presença do solvente, resultando em produto com espectro de 
absorção diferente do inicial. 
 
Desvios da Lei de Beer 
– DESVIO INSTRUMENTAL 
• A lei só é válida para radiação monocromática, ou seja, para um 
único comprimento de onda () 
Como minimizar o desvio? 
• Escolher a região onde o e é constante na região selecionada 
(pico de absorção) 
 
Partes Essenciais de um Espectrofotômetro 
• Fontes de radiação; 
• Monocromador; 
• Compartimento de 
amostra; 
• Detector. 
Espectrofotômetro 
Fontes de Radiação 
Cubetas de Medida 
Análises Quantitativas 
Análises Quantitativas 
Curva de Calibração 
Bibliografia: 
Vogel. Química Analítica Quantitativa. 
 
Apostila de Química Analítica Quantitativa. EEL / USP. 
Análise Qualitativa 
240 250 260 270 280 290 300 
Comprimento de onda (nm) 
 2
,0
 
 
 
 
2
,2
 
 
 2
,4
 
 
 
 2
,6
 
 
 
 2
,8
 
 
 
 
3
,0
 
 
 
 3
,2
 
 
L
o
g
 
ε 
A ou B 
C 
D 
C5H11 
C5H11 
OH 
C5H11 
R 
OH OH 
R 
OH 
C5H11 
OH 
OH 
OH OH 
(A) (B) 
(C) (D) 
Espectro de absorção do canabidiol comparado com outros fenóis. 
Riboflavina FAD 
Espectro de Varredura - Riboflavina 
Espectro de Varredura - FAD 
Limite da Curva de Calibração 
Riboflavina 
Concentração Absorbâncias 
g/L 
 440 370 260 220 
0,00625 0,212 0,164 0,423 0,217 
0,0125 0,384 0,313 0,816 0,618 
0,025 0,686 0,571 1,494 1,305 
0,05 1,122 0,941 2,408 2,173 
0,1 1,465 1,23 2,914 2,659 
0 
0,2 
0,4 
0,6 
0,8 
1 
1,2 
1,4 
1,6 
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 
0 
0,5 
1 
1,5 
2 
2,5 
3 
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 
Gráfico para 440 nm 
Gráfico para 220 nm 
Análise Colorimétrica 
Dosagem de Glicose 
tubo tubo' Abs Abs' Média 
G 
(mg/mL) 
1 1' 0,0139 0,0130 0,0135 0,04 
2 2' 0,0252 0,0274 0,0263 0,08 
3 3' 0,0388 0,0418 0,0403 0,12 
4 4' 0,0546 0,0559 0,0553 0,16 
5 5' 0,0730 0,0648 0,0689 0,20 
y = 0,3496x - 0,0011 
R² = 0,9994 
0,000 
0,010 
0,020 
0,030 
0,040 
0,050 
0,060 
0,070 
0,080 
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 
A
b
s
 (
n
m
) 
G (mg/mL) 
Curva de Calibração 
Dosagem de Proteínas Totais 
TUBO 
[Proteína] 
(μg/mL) 
215 nm 225 nm 
DABS 
média 
1/1' 10 0,0976 0,0807 0,0555 0,0424 0,040 
2/2' 20 0,1964 0,2008 0,1101 0,1137 0,087 
3/3' 30 0,2923 0,3038 0,1614 0,1683 0,133 
4/4' 40 0,3888 0,4616 0,2164 0,2573 0,188 
5/5' 50 0,5644 0,5290 0,3141 0,2944 0,242 
6/6' 60 0,6742 0,7756 0,3759 0,4353 0,319 
7/7' 70 0,9047 0,8490 0,5208 0,4750 0,379 
8/8' 80 0,9739 0,9822 0,5488 0,5523 0,428 
9/9' 90 1,1025 1,1717 0,6206 0,6686 0,493 
10/10' 100 1,2508 1,2343 0,6944 0,6973 0,547 
y = 0,0058x - 0,0317 
R² = 0,9975 
0,000 
0,100 
0,200 
0,300 
0,400 
0,500 
0,600 
0 20 40 60 80 100 120 
D
A
b
s
 
[Proteína] (mg/mL) 
Concentração de Proteínas 
Análise UV 
• Dosagem de peróxido de hidrogênio (=240nm) 
Abs Abs AbsMédio H2O2 (mg/mL) 
0,0104 0,0099 0,0102 0,00 
0,0927 0,1174 0,1051 0,34 
0,2272 0,2381 0,2327 0,68 
0,3338 0,3455 0,3397 1,02 
0,4401 0,4491 0,4446 1,36 
0,5443 0,5551 0,5497 1,70 
y = 3,1091x - 0,0215 
R² = 0,9989 
0,0 
0,4 
0,8 
1,2 
1,6 
2,0 
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 
A
b
s
 
H2O2 (mg/mL)