Cromatografia livro

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SUMÁRIO
1 - Introdução, 1
1.1. Histórico, 1
1.2. Classificação, 1
2 - Tipos de Processos Cromatográficos, 3
2.1. Cromatografia de adsorção, 3
2.2. Cromatografia de partição, 4
2.3. Cromatografia em fase líquida, 6
2.4. Fatores que influem na separação, 7
2.5. Cromatografia em fase gasosa, 11
3 - Tratamento teórico da Cromatografia, 14
3.1. Equação de Van Deemter, 14
3.2. Fase estacionária, 14
3.3. Suporte, 15
3.4. Coluna, 16
3.5. Fase móvel, 16
4 - O Cromatógrafo, 18
4.1. O Cromatógrafo a Gás, 18
4.2. O Cromatógrafo a Líquido, 20
4.3. Detetores, 23
5 - Análise Qualitativa, 30
6 - Análise Quantitativa, 31
6.1. Introdução, 31
6.2. Medição de área, 31
6.3. Métodos de cálculo, 33
6.4. Seleção do melhor método de cálculo, 37
7. Otimização do processo analítico, 39
7.1. Parâmetros analíticos, 39
7.2. Projetando um método analítico, 41
7.3. Validação de um método analítico, 43
8. Técnicas adicionais de identificação, 50
8.1 Tempo de retenção e retenção relativa, 50
8.2. Índice de retenção, 50
8.3. Equivalência entre fases estacionárias, 51
9. Bibliografia, 52
10. Apêndice 1 (Características Básicas dos Detetores), 53
10.1. Sensibilidade, 53
10.2. Nível de ruído, 53
10.3. Limite de Detecção, 53
10.4. Faixa de Linearidade Dinâmica, 54
11. Apêndice 2 (Técnicas de introdução da amostra), 55
12. Apêndice 3 (Sistemas de aquisição de dados), 57
13. Apêndice 4 (O desenvolvimento cromatográfico), 58
14. Apêndice 5 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 60
15. Apêndice 6 (Estatística), 64
Alexandre Schuler - Cromatografia
1 - INTRODUÇÃO
1.1. Histórico
 Cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo de separação 
físico-químico, o qual é baseado nos fenômenos de adsorção e partição. Este termo foi 
escolhido porque as primeiras separações foram realizadas com substâncias coloridas. 
Entretanto, o processo cromatográfico não é restrito a essa classe de substâncias, 
constituindo-se na atualidade no método mais eficiente de separação, com aplicações na 
Química Analítica Qualitativa e Quantitativa, para compostos orgânicos e inorgânicos, 
independentemente de seu estado físico.
1.2. Classificação
Num processo cromatográfico são envolvidas uma fase móvel e uma fase 
estacionária. A fase estacionária é um sólido ou um líquido (Figura 1.1). No segundo caso, 
este fica impregnado em um sólido (suporte) e o fenômeno mais atuante é a partição. No 
primeiro caso, tem predominância a adsorção. Assim, pode-se classificar a Cromatografia 
em dois tipos gerais: Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.
Figura 1.1 - O Processo Cromatográfico . A Fase Móvel transporta a amostra através da Fase 
Estacionária. A velocidade média das partículas da amostra depende da sua natureza. Desse modo, 
cada componente atingirá o final da coluna em um instante diferente.
A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. No primeiro caso, denomina-
se o processo de Cromatografia em Fase Líquida e no segundo caso de Cromatografia em 
Fase Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Líquido e Cromatografia a Gás.
A Cromatografia pode ainda ser classificada em função da técnica 
empregada:
 Cromatografia em Papel
 Cromatografia em Camada Delgada
 Cromatografia em Coluna Clássica
 Cromatografia em Fase Gasosa
Alexandre Schuler - Cromatografia
 Cromatografia em Fase Líquida de Alto Desempenho
Esta última é mais conhecida pela iniciais de seu nome em inglês (High 
Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas as 
seguintes técnicas:
• Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)
• Cromatografia de Troca Iônica (IEC)
GPC (do inglês Gel Permeation Chromatography) é empregada na análise 
de polímeros, enquanto a IEC (do inglês Ion Exchange Chromatography) é empregada na 
análise de íons (cátions e ânions).
2
Alexandre Schuler - Cromatografia
2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS
2.1. Cromatografia de Adsorção
Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido 
(adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações 
semelhantes às “forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação
k N
N
a
a
n
=
onde Na e Nn são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de uma 
determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes 
variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vários 
componentes é forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente (coluna 
cromatográfica), cada componente necessitará de um intervalo de tempo diferente para 
transpor a coluna. Esse intervalo de tempo é denominado tempo de retenção (Tr). A Figura 
2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsorção. A substância mais fortemente 
adsorvida é mais dificilmente arrastada pela Fase Móvel.
a) Cromatografia de Adsorção b) Cromatografia de Partição
Figura 2.1 - Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.
2.2. Cromatografia de Partição
3
Alexandre Schuler - Cromatografia
Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não 
miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relação 
C1 / C2, onde C1 e C2 são as concentrações da substância em cada um dos dois líquidos. 
Denomina-se coeficiente de partição à relação
k C
C
p =
1
2
Se M0 é a massa total da substância e M1 é a massa dissolvida no solvente 1, 
podemos escrever
k
M
V
M M
V
M
V
V
M M
p =
−
= ⋅
−
1
1
0 1
2
1
1
2
0 1( )
logo, M M k V
V k V
p
p
1 0
1
2 1
=
+
. (eq. 1)
Se a substância estava inicialmente dissolvida no solvente 1, M1 é a massa 
que permanece neste solvente após adição do solvente 2, o qual extraiu a massa (M0 - M1). Se 
as duas fases forem separadas (com auxílio de um funil de separação, por exemplo), a adição 
de outra quantidade do solvente 2 vai extrair a massa (M1 - M2), onde
M M k V
V k V
p
p
2 1
1
2 1
=
+
. (eq. 2)
Substituindo na eq. 2 o valor de M1 (eq. 1 ), fica
M2 = Mo [kpV1/(V2 + kpV1)]2 (eq. 3)
A eq. 3 pode ser generalizada para
Mn = Mo [kpV1/(V2 + kpV1)]n (eq. 4)
que dá a massa Mn que permanece no solvente 1 após n extrações com o solvente 2. Dá-se ao 
processo agora descrito o nome de extração. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por 
exemplo, 2 componentes, com k kp p'≠ , um dos componentes ficará preferencialmente no 
solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, à medida que n cresce, cada fase ficará mais pura 
em um dos componentes. No caso anterior (extração), a porção de líquido 1 era sempre a 
mesma, renovando-se apenas o líquido 2. Agora, ambos são renovados. O Esquema 
2.1, onde o líquido 1 é o superior, ilustra o processo, que pode ser visualizado a nível 
molecular na Figura 2.1.b.
4
Alexandre Schuler - Cromatografia
Sejam duas substâncias A e B, onde kA é maior que kB. Isto significa que o 
líquido 1 vai se enriquecendo de A e o líquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de B, a 
cada etapa do processo. Os números da esquerda, em cada quadrícula, indicam a fração de A 
e os da direita indicam a fração de B. Do mesmo modo, os números superiores indicam a 
fração de A e de B no líquido 1 e os inferiores indicam a fração de A e de B no líquido 2. No 
exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e de B, cujos coeficientes de 
partição valem, respectivamente, 3 e 1/3.
Para este segundo tipo de procedimento, a eq. 4 não é válida. Em seu lugar, 
pode ser deduzida, de modo semelhante, a eq. 5, onde Mn é a massa extraídaapós n etapas. 
A partir dos valores de MAn e MBn, pode-se calcular a composição da mistura (ou o grau de 
pureza de cada componente) em cada solvente, após n etapas (n partições). 
 
Esquema 2.1 - Distribuição (partição) de duas substâncias (A e B), em dois líquidos (1 e 2) 
não miscíveis.
Mn = Mo [V2/(V2 + kpV1)]n (eq. 5)
A partição, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo 
cromatográfico. O número de “equilíbrios” (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna (n) é 
conhecido como o “número de pratos teóricos”, prato teórico sendo um ponto de equilíbrio 
(entre uma fase e outra). A distância entre dois pontos de equilíbrio consecutivos chama-se 
“altura equivalente a um prato teórico” (H). Os parâmetros n e H serão novamente discutidos 
mais adiante.
IMPORTANTE ! Se kB também for maior que a unidade, a perda de B será muito grande e 
também a purificação de A será muito demorada (exigirá maior número de etapas).
2.3. Cromatografia em Fase Líquida
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O exemplo mais simples de cromatografia a líquido é a separação em uma 
camada delgada de sílica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em 
Camada Delgada). A Figura 2.2 ilustra o processo.
O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os 
componentes de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação). Quando 
o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da cuba que 
contém o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical e a um nível 
abaixo do ponto de aplicação. As razões de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 são 
características de cada substância, dependendo da natureza da fase móvel e da fase 
estacionária. A Cromatografia em Camada Delgada é a mais empregada em Análise 
Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada, é 
menos indicada para fins preparativos, quando então se emprega a Cromatografia em Coluna 
Clássica. Neste segundo tipo de processo, a fase estacionária é colocada em um tubo de vidro 
(coluna cromatográfica) colocado na posição vertical. A coluna é dotada de uma torneira na 
extremidade inferior (Fig. 2.3), que é utilizada para controlar a vazão da fase móvel, que 
desce por gravidade.
Fig. 2.2 - Cromatografia em Camada 
Delgada.
 Neste exemplo, a amostra contém dois 
componentes, A e B, que são identificados pelos 
respectivos valores de Rf
A necessidade de se controlar a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, 
além da impossibilidade (naquela época - anos 50) de se bombear um líquido com 
fluxo constante e contínuo, levaram os projetistas a abandonar essa técnica, passando a 
utilizar um gás como fase móvel (1956).
Figura 2.3
 
O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A 
indica o nível da fase móvel. A diferença A’ - A deve ser o menor 
possível, para evitar a diluição do material a ser cromatografado, o 
que resultaria em zonas (na Fig. 2.3, as faixas 1, 2 e 3) mais 
largas. Ao se fazer a eluição (passagem da fase móvel), os 
componentes afastam-se do ponto de aplicação (topo da coluna) a 
uma distância d tal que d/l = Rf (l é o comprimento da coluna), 
obtendo-se assim uma coluna desenvolvida . A partir daí, 
continuando-se a eluição, cada componente pode ser coletado 
isoladamente, quando atingir o final da coluna. Denomina-se 
Volume de Retenção (Vr) o volume de fase móvel necessário para 
a eluição completa de um componente. Desse modo, tem-se Vr = 
V1 / Rf, onde V1 é o volume ocupado pela fase móvel dentro da 
coluna. A partir daí pode ser calculado o volume total de solvente 
6
Alexandre Schuler - Cromatografia
Cromatografia 
em Coluna
necessário para a eluição de todos os componentes da amostra. No 
Apêndice 4, são discutidos mais detalhes sobre o 
desenvolvimento da coluna.
2.4. Fatores que influem na separação
Independentemente do processo envolvido na separação cromatográfica 
(adsorção ou partição), esta é função de uma série de fatores, a saber:
Natureza da fase estacionária Vazão da fase móvel
Concentração da fase estacionária Temperatura
Natureza da fase móvel Granulometria e geometria do suporte
A polaridade da fase estacionária é um fator importante a se 
considerar. Em princípio, quando se tem uma fase estacionária não polar, os diversos 
componentes da amostra eluem na ordem crescente de seus pontos de ebulição e o 
processo assemelha-se bastante a uma destilação (Figura 2.4). Quando a fase 
estacionária apresenta polaridade, essa ordem de eluição em função do ponto de 
ebulição fica alterada (Figura 2.5) e só é obedecida quando os componentes 
apresentam polaridade de mesma ordem de grandeza (componentes A-C e D-G da 
Figura 2.6). Em alguns casos, a diferença de polaridade pode ser equilibrada com a 
diferença de ponto de ebulição, fazendo com que dois componentes distintos eluam 
juntos (Figura 2.7). Nesses casos, outros fatores podem auxiliar na separação, como a 
ponte de hidrogênio entre os componentes D-G da Figura 2.6.
FE: Esqualano (um hidrocarboneto de baixíssima polaridade)
A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)
FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)
B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)
Figura 2.4 – Separação em função da diferença 
no ponto de ebulição
Figura 2.5 - Efeito da polaridade sobre a 
separação cromatográfica
A concentração da fase estacionária líquida também influi na separação, 
como pode ser observado na Figura 2.8. Aliás, com o uso, é normal diminuir a concentração, 
por arraste pela fase móvel, mesmo à temperatura ambiente, de modo que colunas com fase 
estacionária líquida possuem um tempo de vida útil finito, que pode ser bastante curto, à 
medida em que a temperatura da análise se aproxima da temperatura limite, que por 
definição situa-se 150oC abaixo da temperatura de ebulição da fase estacionária. Atualmente, 
7
Alexandre Schuler - Cromatografia
tem sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seção 3.2 - Fase Estacionária; p. 
14).
Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros
A- n-nonano (154oC)
B- n-decano (174oC)
C- n-undecano (194oC)
D- etanol (78oC)
E- n-propanol (94oC)
F- n-butanol (118oC)
G- n-pentanol (132oC)
H- água (100oC)
não polar, não forma ponte polar, ponte de hidrogênio média polar, ponte de hidrogênio fortíssima
Figura 2.6 – Efeito da ponte de hidrogênio sobre a separação cromatográfica
Outro fator importante, 
principalmente em HPLC, é a polaridade da 
fase móvel. Aliás, esse é o principal recurso para 
implementar uma separação (ver Gradiente 
de Polaridade, na Seção 4.2; p. 22). Também 
a vazão da fase móvel é muito importante na 
separação. A Figura 2.9 ilustra a situação, que 
foi alvo de um estudo semi-teórico realizado 
por van Deemter (Capítulo 3). Também a 
temperatura (a que está submetida a coluna) é 
fator determinante na separação, 
particularmente em CFG, conforme resume o 
quadro anexo à Figura 2.10. Finalmente, a 
granulometria da fase estacionária sólida (ou 
do suporte sólido da fase estacionária líquida), conforme mostrado na Tabela 2.1, também influi na 
separação.
Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte/FE sólida sobre a separação cromatográfica
malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)
60-80 4300 0,93 20
 80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
 D.E. = 1/8”; l = 4 m; C = 10 %
FE: Apiezon (um hidrocarboneto)
A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)
 B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)
Figura 2.7 - Uma separação malsucedida
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Figura2.8 - Efeito da concentração da fase estacionária sobre a 
separação cromatográfica.
 
onde: V1 < V2 < V3 < V4
Figura 2.9 - Efeito da vazão da fase móvel sobre a separação 
cromatográfica.
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Alexandre Schuler - Cromatografia
 Figura 2.10 - Efeito da temperatura sobre a separação cromatográfica.
O quadro apresentado a seguir sumariza a relação entre o efeito e o tipo de processo.
TIPO FASE MÓVEL FASE 
ESTACIONÁRIA
EFEITO
ADSORÇÃO G S DIMINUI TR
L S DIMINUI TR
PARTIÇÃO G L DIMINUI TR
L L NÃO ALTERA TR
 
2.5. Cromatografia Em Fase Gasosa (CFG)
Na Cromatografia a Gás empregam-se colunas bem mais longas que 
aquelas usadas em Cromatografia a Líquido. O princípio é o mesmo, mas a força motora é a 
pressão do gás e não a força da gravidade, de modo que as colunas normalmente são dobradas 
em espiral, a fim de ocupar menos espaço dentro do cromatógrafo. A Fig. 2.11 esquematiza 
um cromatógrafo a gás.
A amostra (gás, líquido ou sólido em solução) é injetada (ver Apêndice 2), 
com auxílio de uma microseringa ou válvula apropriada, no Injetor, que também é o 
Vaporizador (V) e os seus vapores são arrastados para o interior da coluna pela fase móvel 
(gás de arraste). Na saída da coluna, a amostra passa pelo Detetor (D), que envia um sinal
10
Alexandre Schuler - Cromatografia
Fig. 2.11 - Cromatógrafo a Gás
para o Registrador (R). Como será visto adiante (Detetores, p. 23), este sinal é proporcional 
à quantidade de cada componente, o que permitirá uma análise quantitativa. Vale acrescentar 
que a Cromatografia a Gás é talvez o método de análise mais preciso. O sinal eletrônico 
captado pelo registrador é transformado num movimento da pena do mesmo. Como o papel 
de registro está em movimento, obtém-se um gráfico (Fig. 2.12) denominado cromatograma.
Fig. 2.12 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes.
As áreas A1 e A2 sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.12 são 
proporcionais às quantidades dos dois componentes na mistura. Distância de Retenção (Dr) é 
a distância, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeção (Início) e o ponto 
correspondente ao máximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do papel (z), mas 
o tempo de retenção (Tr = Dr/z) é uma característica da substância que varia com a vazão da 
fase móvel, a natureza e a concentração da fase estacionária e com a temperatura. Por isso, o 
cromatógrafo possui controladores de vazão da fase móvel e da temperatura do forno da 
coluna. A coluna (e consequentemente a fase estacionária) pode ser substituída, até 
encontrar-se a coluna ideal para uma dada amostra. Além disso, existe uma vazão ideal para 
cada coluna, independentemente da natureza da amostra (ver Fig. 2.13). Assim sendo, a 
11
Alexandre Schuler - Cromatografia
temperatura da coluna é o principal recurso disponível para obter-se um máximo de 
separação entre os diversos componentes da amostra.
Outro parâmetro usado em CFG é a Retenção Relativa (RR), que é 
também usado na identificação:
RR = Tr
Tr
 = Vr
Vr
 = Dr
Dr
2
1
2
1
2
1
Essas relações são equivalentes, desde que Vr2 = F.Tr e F e z são constantes (F = vazão da 
fase móvel).
Fig. 2.13 - Relação entre F e n ou H. Fi é a Vazão Ideal (os parâmetros A, B e C são descritos 
na Seção 3.1, eq. 6).
Obs.: Experimentalmente determina-se H por medição da distância de retenção e aplicação 
das equações:
n = (4Dr/L)2 e H = l /n,
onde l é o comprimento da coluna e L é a largura do pico na base. A Figura 2.14 ilustra o 
procedimento. O parâmetro n mede a eficiência de uma coluna cromatográfica (ver 
Capítulo 3).
12
Alexandre Schuler - Cromatografia
Figura 2.14 - Procedimento para determinação do 
número de pratos teóricos. As duas 
grandezas devem ser medidas em 
milímetros (ou em minutos ou 
segundos).
13
Alexandre Schuler - Cromatografia
3 - TRATAMENTO TEÓRICO DA CFG
3.1. Equação de Van Deemter
Van Deemter estabeleceu uma equação empírica (eq. 6) que relaciona as 
diversas variáveis da Cromatografia a Gás com H (altura equivalente a um prato teórico). 
Como H é igual a l /n e n mede a eficiência do processo, buscam-se condições em que o valor 
de H é mínimo:
λ = parâmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna.
dp = diâmetro médio das partículas do suporte.
Dg = coeficiente de difusão da amostra na fase móvel.
γ = fator de correção para a tortuosidade dos canais entre partículas.
K’ = k.Nl /Ng ; k = coeficiente de partição.
N = fração de fase estacionária (l) ou da fase móvel (g) dentro da coluna.
df = espessura efetiva do filme líquido (película de fase estacionária na superfície do suporte).
Dl = coeficiente de difusão da amostra na fase estacionária.
v = velocidade linear da fase móvel.
A equação de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral
H = A + B/v + C.v (eq. 7)
que é a equação de uma hipérbole (Fig. 2.13). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de 
empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difusão da amostra em 
cada fase são fatores que devem ser seriamente considerados, quando é projetada uma coluna. 
Temperatura é talvez o fator mais importante, embora não apareça explicitamente na eq. 6. É 
que K’ e D são altamente dependentes da temperatura. Realmente, observa-se na prática que 
esta é a variável que mais influi na resolução, variando drasticamente a retenção relativa. De 
um modo geral, o tempo de retenção depende da natureza da fase estacionária, da 
temperatura de operação e da vazão da fase móvel.
3.2. Fase estacionária
A fase estacionária é um sólido (Cromatografia de Adsorção) altamente poroso 
(mais de 150 m2/g), ou, mais comumente, um líquido (Cromatografia de Partição). No segundo 
caso, o líquido é depositado sobre um sólido (suporte), que será discutido mais adiante.
Interações entre dipolos, polaridade e pontes de hidrogênio são os 
principais fatores, na fase estacionária, que determinam a separação cromatográfica. Esses 
fatores são dependentes da temperatura, daí também a necessidade de um controle dessa 
variável. Os Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influência da polaridade e da ponte de 
14
(eq. 6)
Alexandre Schuler - Cromatografia
hidrogênio sobre a separação. Em ambos, como são usadas fases estacionárias polares, os 
picos aparecem na ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no Cromatograma 
3.1.b, como a fase estacionária (diglicerol) interage com o etanol (ponte de hidrogênio), o 
tempo de retenção deste é bastante aumentado (ver também Seção 2.4; p. 7).
Alto ponto de ebulição e inércia química e catalítica (em relação à amostra, 
à fase móvel e ao material de que é constituído o tubo da coluna) são os principais requisitos 
para uma fase estacionária. Em relação ao ponto de ebulição (PE) deve ser lembrado que a 
temperatura limite para operação com uma dada coluna é 1500C abaixo do PE da fase 
estacionária. Acima dessa temperatura, a perda por volatilização é excessiva. Em anos 
recentes tem sido utilizada a FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde a FE une-se ao suporte 
mediante uma reação química. As fases estacionárias mais freqüentemente utilizadas, com 
um amplo espectro de aplicações, são polímeros derivados de silício, as polisiloxanas (ou 
siliconas), como a SE-30, por exemplo. Outra fase também bastante utilizada é o 
polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M).
3.3. Suporte
O suporte tem a função de fixar dentro da coluna a fase estacionária. É 
necessário que o suporte seja química e cataliticamente inerte. O material a ser empregado 
também não pode exibir área superficial maior que 50 m2/g, alta porosidade, nem grande 
poder de adsorção. Centros ativos(ácidos ou básicos) podem provocar modificações 
estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomáceas, graças à sua baixa 
capacidade de adsorção e à sua baixa porosidade, são ainda muito empregadas como suporte. 
Um excelente suporte à base de diatomácea é comercializado com um nome constituído da 
palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP). Atualmente, têm sido 
desenvolvidos materiais sintéticos, copolímeros do etilvinilbenzeno com divinilbenzeno. A 
depender do processo de fabricação, esses polímeros também podem ser empregados como 
fase estacionária (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc). Permitem um bom empacotamento, 
graças à uniformidade na granulometria e na própria geometria das partículas.
Figura 3.1 - Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre FE e etanol
3.4. Coluna
O material de que é constituída a coluna (tubo) pode ser aço inox 316, 
alumínio, níquel, vidro ou teflon. Quando não se conhece o material a ser analisado, dá-se 
15
Alexandre Schuler - Cromatografia
preferência às colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover 
centros ácidos de sua superfície) ou de teflon, sendo que a última tem emprego mais restrito, 
devido à sensibilidade ao calor e à pressão. As colunas são classificadas quanto ao diâmetro 
externo:
- Coluna microanalítica (capilar) ............ 0,1 a 0,5 mm
- Coluna analítica .................................. 1/8”, 3/16” e 1/4”
- Coluna semi-preparativa ..................... 3/8”, 1/2” e 5/8”
- Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm
As colunas analíticas mais comumente empregadas possuem 2 a 3 m de 
comprimento, com 1.000 a 10.000 pratos teóricos. Colunas capilares são bem mais longas. As primeiras 
capilares fabricadas possuíam mais de 100 m. Com o avanço da tecnologia, o comprimento atual situa-
se entre 20 e 40 m, embora com cerca de 100.000 pratos teóricos. Tem-se notícia de uma coluna capilar 
com cerca de 1600 m de comprimento e 1 milhão de pratos teóricos. 
Atualmente foram desenvolvidas colunas com 0,53 mm (colunas 
“megabore”) com excelentes resultados. Mais simples de instalar, reúnem as qualidades das 
colunas analíticas e das capilares.
As colunas usadas em CLAD (seção 4.2, p. 22) são bem mais curtas (10 a 40 cm) e 
os diâmetros encontrados mais comumente no comércio especializado variam entre 3 e 5 mm.
3.5. Fase móvel
Em CFG, a fase móvel é um gás inerte, devendo apresentar-se bastante 
puro, principalmente quando tratar-se da análise de traços. Os gases mais empregados são H2, 
N2, He, Ar e Ne, podendo também serem utilizados outros, em casos especiais.
Na escolha da fase móvel (ou gás de arraste), devem ser considerados os 
seguintes fatores:
- Disponibilidade/custo.
- Eficiência na separação.
- Efeito sobre o tempo de análise.
- Segurança.
- Efeito sobre o sistema de detecção.
OBS.:
1 - A equação de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N2 e H2, 
apresenta os seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada coluna:
Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v (N2)
Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v (H2)
Esses dados comprovam a influência da natureza do gás de arraste sobre a eficiência.
16
Alexandre Schuler - Cromatografia
2 - A velocidade relativa de eluição aumenta na ordem H2 < N2 < He < Ar, fato que 
demonstra a influência da natureza do gás de arraste sobre o tempo de análise.
A Tabela 3.1 resume a aplicação dos critérios acima mencionados, para 
seleção da fase móvel em função do detetor empregado. 
Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detetor.
TIPO DE DETETOR GASES MAIS USADOS
(Ordem de prioridade)
Condutividade Térmica H2 > He >> N2
Ionização de Chama N2 > Ne > He
Captura Eletrônica N2 > He
Em Cromatografia a Líquido empregam-se como Fase Móvel 
principalmente água deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleção depende do detetor a 
ser empregado e a fase móvel deve ser imiscível com a fase estacionária liquida.
17
Alexandre Schuler - Cromatografia
4 - O CROMATÓGRAFO 
4.1. O Cromatógrafo a Gás
A Fig. 2.11 (p. 11) representa esquematicamente um Cromatógrafo a Gás. 
É possível agora descrever mais detalhadamente o instrumento.
a) Controles de Temperatura
O cromatógrafo dispõe de termostatos para controle independente do 
aquecimento dos três principais setores: câmara de vaporização, forno da coluna e bloco do 
detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistência elétrica localizada na base 
do forno, é homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado após o final do 
aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento do forno deve 
permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de resfriamento 
automático.
Figura 4.1 - Fluxímetro de bolha Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor
b) Controles Pneumáticos
Os cromatógrafos a gás normalmente possuem uma válvula controladora 
de pressão e outra para ajuste da vazão da fase móvel. Idênticos sistemas existem para o 
controle da vazão dos gases auxiliares (ver seção 4.3.2.b; p. 25). A vazão é medida com o 
auxílio de um fluxímetro de bolha, ou bolhômetro (Fig. 4.1). A “pêra” (parte inferior) 
contém uma solução de sabão líquido. Comprimindo-se a “pêra”, o nível do líquido sobe e o 
gás forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazão, é suficiente marcar 
com um cronômetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na atualidade, 
existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados, tornando obsoletos 
esses acessórios.
c) Coletor de Frações
18
Alexandre Schuler - Cromatografia
O coletor de frações é um acessório utilizado em Cromatografia 
preparativa. O material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2), de 
modo que uma parte é desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente, é 
condensado. Colunas de maiores dimensões permitem a injeção de uma maior quantidade de 
amostra, permitindo assim a produção de pequenas quantidades de um material com alta 
pureza (maior que 99,9999%), que pode ser empregado como padrão, por exemplo.
d) Detetores
Por ser necessário um estudo mais detalhado, serão discutidos mais adiante.
e) Eletrômetro
O eletrômetro é um amplificador de sinal. Este módulo pode ser controlado 
a qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser ampliado 
independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente maior) pode 
ser atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do registrador. Os 
Cromatogramas 4.1 e 4.2 ilustram, respectivamente, a relação real de áreas e outro registro 
da mesma amostra, com ampliação do primeiro sinal e atenuação do terceiro, ou mais 
exatamente, atenuação menor para o primeiro e atenuação maior para o terceiro, em relação 
à atenuação do segundo. Logicamente, as áreas medidas no segundo cromatograma, 
multiplicadas pelos respectivos fatores de atenuação, fornecem os valores reais das áreas 
relativas.
Cromatograma 4.1 - Mesma atenuação Cromatograma 4.2 - Atenuações diferentes
f) Registrador
O registrador é um instrumento acessório, que transforma o sinal emitido 
pelo detetor e amplificado pelo eletrômetro, em um sinal mecânico. Na extremidade do 
sistema mecânico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da 
linha de base, é proporcional à quantidade do componente na amostra. Como o papel está em 
19
Alexandre Schuler - Cromatografia
movimento, obtém-se uma curva (cromatograma), onde a distância do início da análise 
(ponto de injeção) ao máximo de cada pico é a distância de retenção (Dr). Dividindo Dr por z 
(velocidadedo papel), obtém-se o tempo de retenção, Tr. Idealmente, com separação 
completa e condições ótimas (incluindo seleção perfeita da fase estacionária), obtém-se uma 
curva simétrica. No Apêndice 3 são discutidas outras técnicas de aquisição de dados.
g) Programador Linear de Temperatura
Quando a retenção relativa (RR) de alguns componentes é próxima da 
unidade (baixa resolução) e no entanto a temperatura de ebulição dos componentes menos 
voláteis é muito alta (Cromatograma 4.3), um aumento na temperatura da análise 
(temperatura da coluna), com o objetivo de reduzir o tempo de análise e obter um pico mais 
agudo para os últimos componentes (o que inclusive diminuiria o erro na determinação de 
Dr), acarretaria uma diminuição na já pequena retenção relativa dos primeiros componentes 
(Cromatograma 4.4). Em situações como essa, pode-se aplicar um gradiente de temperatura, 
com o auxílio de um Programador Linear de Temperatura (PLT). A velocidade de 
aquecimento pode ser controlada, sendo possível também promover um aquecimento 
isotérmico em algumas regiões. Em operações desse tipo deve-se indicar no cromatograma a 
temperatura inicial (Ti), a temperatura final (Tf), que não deve diferir da temperatura de 
ebulição da fase estacionária em menos de 1500C, e a velocidade de aquecimento, para que o 
cromatograma possa ser reproduzido posteriormente (Cromatograma 4.5).
Cromatogramas 4.3, 4.4 e 4.5 - Análises em diferentes temperaturas
4.2. O Cromatógrafo a Líquido
O cromatógrafo a líquido (mais comumente conhecido pela sigla inglesa da 
técnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em português: Cromatografia 
Líquida de Alto Desempenho), é um instrumento mais simples que o cromatógrafo a gás nos 
seguintes aspectos:
a) só possui um canal analítico, enquanto CG’s podem ter até quatro canais;
b) é modulado, isto é, sistema de bombeamento e detetor são independentes, o que 
facilita a substituição de detetores;
20
Alexandre Schuler - Cromatografia
c) opera geralmente à temperatura ambiente;
A Figura 4.3 é um diagrama em blocos de um CL típico. Cada bloco é descrito 
a seguir:
Figura 4.3 - Diagrama em blocos de um HPLC típico
a) Reservatório de Fase Móvel
A Fase Móvel (um líquido puro ou uma mistura de composição definida) deve 
ser filtrada em membranas com 0,46 µm de diâmetro de poros e desgaseificada (ver próximo 
item).
b) Sistema de desgaseificação
A Fase Móvel deve ser desgaseificada, para evitar a formação de bolhas, as 
quais podem provocar cavitação (com conseqüente dano à bomba) ou gerar picos falsos, ao 
passarem pela célula do detetor. São conhecidas várias técnicas de desgaseificação:
- aquecimento com agitação;
- borbulhamento de gás hélio;
- ultra-som;
- vácuo
c) Bomba
O bombeamento da Fase Móvel é realizado por uma bomba controlada 
por um microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de sucção (para evitar 
vaporização de fase móvel mais volátil) e a vazão (importante quando a análise é 
realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo caso há necessidade de uma segunda 
bomba; ver mais adiante).
d) Válvula de injeção
A amostra é sempre introduzida com auxílio de uma válvula, porquanto 
a pressão de trabalho nunca é menor que 50 atmosferas (Apêndice 2).
e) Coluna
21
Alexandre Schuler - Cromatografia
As colunas empregadas em CL são retas, uma vez que seu comprimento 
raramente ultrapassa 30 cm, ocupando portanto muito pouco espaço no equipamento.
f) Detetor
Os detetores utilizados em CL serão descritos na próxima seção.
g) Sistema de aquisição de dados.
Os sistemas de aquisição de dados empregados em CL são exatamente os 
mesmos empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores 
(Apêndice 3).
Gradiente de Polaridade
Quando o CL dispõe de apenas uma bomba, é evidente que a fase móvel 
tem uma composição constante, do início ao fim da análise. Nessa situação, a polaridade 
da mesma também é constante. Diz-se então que o processo é isocrático . Quando 
dispõe-se de duas bombas (ou mais), é possível variar a composição da fase móvel, 
colocando-se em cada reservatório um líquido de polaridade diferente. O 
microprocessador altera a vazão de cada linha de líquido, de modo que a partir do ponto 
de confluência a vazão seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre com 
gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade, pode-se utilizar 
os Cromatogramas 4.3 e 4.4 (p. 20) como ilustração de processos isocráticos com 
polaridades diferentes e o Cromatograma 4.5 como ilustração de um processo com 
gradiente de polaridade. 
4.3. Detetores
4.3.1. Generalidades
Os detetores mais empregados são do tipo diferencial. A sua resposta (R), 
dada pelas áreas relativas dos picos, é proporcional à concentração de cada componente 
(detetores de condutividade térmica) ou à velocidade de fluxo de massa do componente 
(detetores de ionização):
R = K .C R = K .dm
dt
1 2
Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os 
seguintes: detetor de condutividade térmica (DCT), detetor de ionização de chama (DIC) e detetor 
de índice de refração (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicação.
22
Alexandre Schuler - Cromatografia
A escolha do detetor é importante e depende do material a ser analisado. 
As principais características dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleção do 
detetor mais apropriado, são as seguintes (ver Apêndice 1, p 53):
- Sensibilidade
- Nível de ruído
- Resposta
- Faixa de linearidade dinâmica
- Custo/vida útil
- Universalidade
- Especificidade / Seletividade
- Condutividade térmica (para DCT)
4.3.2. Detetores empregados em Cromatografia a Gás
a) Detetor de Condutividade Térmica (DCT)
O sistema de detecção por diferença de condutividade térmica consiste de 
dois filamentos (célula para amostra e célula de referência), os quais fazem parte de uma 
ponte de Wheatstone (Figuras 4.4a e 4.4b). Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes 
perdem calor para o gás de arraste. No momento em que a amostra atingir a célula 
correspondente, o filamento perderá calor para a solução (gás de arraste + amostra). Como a 
solução possui condutividade diferente, a temperatura do filamento é alterada, o mesmo 
ocorrendo com a sua resistência elétrica. Essa variação na resistência é medida pela ponte. 
Note-se que quanto maior for a concentração do material analisado, maior será a variação na 
corrente e portanto maior será o sinal (R = K.C).
A sensibilidade de um detetor de condutividade térmica pode ser avaliada pela equação:
S = KI . ( ) . (T - T )2 g - s
g
f b
λ λ
λ (eq. 8)
onde:
S = sensibilidade (mV.cm3/mg)
K = constante da célula
I = intensidade de corrente
R = resistência do filamento
λγ = condutividade térmica do gás de arraste
λσ = condutividade térmica da substância
Tf = temperatura do filamento
Tb = temperatura do bloco
IMPORTANTE ! Se a câmara do detetor contiver ar atmosférico no momento em que o 
circuito for energizado ocorrerá queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer 
circular o gás de arraste.
23
Alexandre Schuler - Cromatografia
Figura 4.4.a - Bloco do Detetor de Condutividade Térmica.
b) Detetor de Ionização de Chama (DIC)
A figura 4.5 representa o circuito eletrônico de um DIC. Rv é uma 
resistência variável, cujo valor depende do número de partículas entre os eletrodos. O 
efluente da coluna, ao passar entre os eletrodos, é ionizado. Nos DIC, a fonte de ionização é a 
chama resultante da combustão de hidrogênio com ar (gases auxiliares). A correntecontínua gerada pela fonte (fonte CC, Fig 4.5.b) é transportada do polarizador para o 
coletor (Fig 4.5.a) por impurezas existentes na fase móvel ou por partículas de fase 
estacionária líquida arrastada pela fase móvel, por exemplo. No amplificador existe outra 
fonte de corrente, sendo esta variável e de sentido contrário, permitindo assim zerar a 
corrente resultante no circuito. Quando um componente da amostra atinge o detetor, caso 
possua átomos de carbono e átomos de hidrogênio, entrará em combustão, sendo ionizado. 
Com a ionização, aumenta a corrente saída do coletor, o que irá gerar uma tensão (∆V), a 
qual é ampliada pelo amplificador eletrométrico e enviada ao registrador/integrador. 
Evidentemente, a sensibilidade do detetor dependerá da facilidade relativa de ionização de 
cada componente da amostra.
24
Alexandre Schuler - Cromatografia
Figura 4.4b- Diagrama Eletrônico do DCT
Fig. 4.5.a- Estrutura física de um DIC
c) Detetor de Captura Eletrônica (DCE)
Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao contrário 
daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos eletrodos (Rv). 
Uma fonte de 3H-1 ou de 63Ni ioniza as moléculas do gás de arraste (N2), liberando os elétrons 
responsáveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substância capaz de absorver esses 
elétrons passar pelo detetor, haverá uma queda na corrente, resultando num sinal que 
também será amplificado e enviado ao registrador. 
Aqui, a sensibilidade do detetor depende da capacidade de absorção de 
elétrons por parte dos diversos componentes da amostra.
25
Alexandre Schuler - Cromatografia
Fig. 4.5.b- Circuito eletrônico de um DIC / DCE
d) Propriedades dos detetores
A Tabela 4.1 é auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos 
detetores, auxiliando no trabalho de seleção do detetor mais apropriado para uma análise. O 
Apêndice 5 descreve outros detetores de uso menos extensivo, como o DNP.
Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detetores empregados em CFG.
PROPRIEDADES DCT DIC DNP DCE
Limite de detecção 1 ppm 100 ppb 0,1 ppb 0,1 ppb
Faixa de linearidade 104 107 104 102
Vazão da fase móvel 1-103 mL/min 1-200 mL/min 10-100 mL/min 10-100 mL/min
Quant. Típica amostra 1 - 40 µL 0,05 - 5 µL 1 - 5 µL 1 - 5 µL
Comp. Detectados todos orgânicos nitrogenados e 
fosforados
halogenados
Áreas de aplicação uso geral orgânicos resíduos de 
pesticidas
resíduos de 
pesticidas
4.3.3. Detetores empregados em CLAD
Os detetores mais empregados em Cromatografia a Líquido de Alto 
Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detetores são:
a) Detetores de índice de refração
À semelhança do detetor de condutividade térmica, o detetor de índice de 
refração é o mais antigo, menos sensível e o único universal, dentre os detetores empregados 
em CLAD. Baseando-se na diferença de índice de refração entre a fase móvel e cada 
componente da amostra, conhecem-se dois tipos de detetores IR:
26
Alexandre Schuler - Cromatografia
• Os detetores tipo deflexão utilizam como elemento ativo um diodo capaz de 
gerar uma corrente contínua cuja intensidade é proporcional ao ângulo de 
incidência da luz que atravessa a célula (Figura 4.6). Ao passar pela célula 
analítica uma substância com índice de refração diferente daquele da fase móvel, 
haverá uma alteração no ângulo de incidência, resultando numa variação na 
intensidade de corrente, que é proporcional à concentração dessa substância na 
célula e consequentemente também proporcional à sua concentração na amostra.
Figura 4.6 - Detetor de Índice de Refração tipo deflexão.
• Os detetores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema 
mostrado na Fig. 4.7 ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz é refletida e a outra 
parte é refratada. De acordo com a Lei de Fresnel, a relação entre essas duas frações é 
função do índice de refração. Assim, ao passar uma substância (transportada pela fase 
móvel) pela célula, altera-se o índice de refração e portanto o percentual de luz refratada. 
Utilizando-se como foto-detetor um diodo sensível à intensidade de luz, a corrente 
gerada por este será alterada de um modo proporcional à concentração dessa substância 
na amostra. 
b) Detetores de UV-VIS
Os detetores de ultravioleta-visível (UV-VIS) baseiam-se na Lei de 
Lambert-Beer, que estabelece uma relação linear entre Absorbância e Concentração:
A = ε . l . c
onde l é o caminho ótico (distância percorrida pela luz dentro da solução; espessura da 
célula). A constante de proporcionalidade ε denomina-se absortividade molar. A 
absorbância, por sua vez, é proporcional à transmitância, fração de luz transmitida. 
Quando o conteúdo da célula (Fig. 4.8) é transparente à radiação 
empregada (UV ou VIS), a transmitância é 100 % e evidentemente a absorbância é ZERO.
27
Alexandre Schuler - Cromatografia
Entretanto, quando chega à célula uma substância que absorva essa luz, o 
sistema de detecção mede a diferença em intensidade, gerando o cromatograma 
correspondente.
Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de 
radiação uma lâmpada de mercúrio, cujo comprimento de onda principal (90 % do total da 
radiação) mede 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de 
onda fixo (e único). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemático desse tipo de 
instrumento. Como a região útil da radiação UV varia de 190 a 300 nm, é de se esperar que 
mesmos os compostos que absorvem luz UV não venham a ser detectados em um detetor do 
tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma varredura 
em toda a região UV, é primordial, evidentemente, que a fonte de radiação (lâmpada de 
deutério) possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de interesse (fonte 
não monocromática). Desse modo, o instrumento (UV variável) necessita de um dispositivo 
que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a amostra com uma 
luz monocromática. Esse dispositivo chama-se “monocromador”. Para se operar na faixa 
visível (400-750 nm), emprega-se uma lâmpada de tungstênio.
Figura 4.7 - Detetor de Índice de Refração tipo Fresnel.
28
Alexandre Schuler - Cromatografia
Figura 4.8 - Detetor de Ultravioleta fixo
6 - ANÁLISE QUALITATIVA
O tempo de retenção (Tr) é uma característica físico-química e como tal 
permite que se faça análise qualitativa, desde que se disponha de um padrão. Na falta do 
padrão, é necessário coletar cada componente isoladamente e identificá-lo por outros 
métodos analíticos; espectrometria, por exemplo. Atualmente, são comercializados 
cromatógrafos cujo detetor é um espectrômetro de massas.
Quando uma amostra é submetida à análise, é preciso fornecer ao analista 
alguns dados a respeito da mesma:
- Origem (de síntese, natural, etc ?).
- Componentes prováveis (espécie, número).
- Composição quantitativa provável.
- Faixa de ponto de ebulição (amostra líquida).
- Outros dados relacionados com as variáveis do processo.
Quanto maior for o número de informações, mais rapidamente o analista 
encontrará as condições ideais de análise.
Como existe apenas uma vazão ideal para cada coluna, resta ao analista 
procurar a coluna e a temperatura (ou programação de temperatura) ideais.
Existem outros modos de efetuar a identificação, os quais serão estudados 
mais adiante (Capítulo 8).
29
Alexandre Schuler - Cromatografia
6 - ANÁLISE QUANTITATIVA
6.1. Introdução
Para se determinar a composição de uma mistura (Análise Quantitativa) é 
necessário medir as áreas relativas dos picos de todos os componentes.Entretanto, nem 
sempre o número de picos é igual ao número de componentes, pois além da probabilidade de 
ocorrer superposição, alguns componentes poderão não ser detectados, o tempo de análise 
poderá ser inferior ao tempo de retenção de um componente menos volátil, etc.
O uso de uma referência (padrão) permite, contudo, determinar a 
percentagem de um dado componente, mesmo que não apareçam os picos dos outros 
componentes.
Antes de se efetuar o cálculo da composição, entretanto, é preciso fazer as 
correções das áreas, pois a relação das áreas de dois componentes quase sempre é diferente da 
relação entre as suas massas (composição em massa). Isto porque a sensibilidade (Resposta) 
de um detetor a duas diferentes substâncias normalmente é diferente.
Analisando a eq. 8 (p. 23), observamos que além de outros fatores, a 
sensibilidade dos detetores de condutividade térmica depende da diferença λg - λs. Como λs 
varia de substância para substância, podemos dizer que uma mistura binária qualquer 
contendo 50% de cada componente muito provavelmente terá uma relação de áreas diferente 
da unidade.
Com os detetores de ionização de chama (e também com os de captura de 
elétrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar 
elétrons) varia de substância para substância. Aliás, essa afirmação vale para qualquer outro 
tipo de detetor, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Líquido.
Assim sendo, vale a pena repetir, é necessário primeiro determinar os 
fatores de resposta para as áreas e só depois efetuar o cálculo da composição.
6.2. Medição de Área
A área de um pico pode ser medida por vários métodos, a saber:
i - Com auxílio de um planímetro.
ii - Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balança analítica).
iii - Com auxílio de um integrador:
a) de disco (eletromecânico) ou 
b) eletrônico
30
Alexandre Schuler - Cromatografia
iv - Determinação gráfica:
 a) S = h.L ou b) S = h.L’,
 onde h é a altura do pico, medida desde a linha de base até o ápice do mesmo, L é 
a largura na base (distância entre os pontos em que a linha de base é interceptada 
pelas tangentes traçadas nos dois ramos da curva) e L’ é a largura do pico na 
metade de sua altura, como se vê na Figura 6.1. Essas grandezas devem ser 
medidas em milímetro.
O planímetro é um dispositivo mecânico, articulado. À medida em 
que se percorre o perímetro do pico, um ponteiro percorre uma escala. A leitura ao 
final do perímetro é a área do pico. O traçado do integrador de disco é mostrado 
abaixo do pico, na fig. 6.1. O uso de um integrador permite determinar a área com 
um erro da ordem de 0,1%. Entretanto, os erros dos outros métodos, em torno de 
0,5 - 1%, é bastante aceitável para a maioria das finalidades. Dado o alto custo dos 
integradores, principalmente os eletrônicos , muitos Laboratórios ainda utilizam o 
método gráfico . Atualmente, encontram-se no mercado várias versões de 
softwares (com a respectiva interface), que substituem com muitas vantagens 
(inclusive de custo) os integradores eletrônicos .
A utilização do planímetro exige habilidade do operador, de modo 
que o erro poderá ser bem maior que 1% (a precisão normalmente é baixa). O 
método de pesagem, por sua vez, é pouco empregado em virtude de exigir a 
destruição do cromatograma. Dentre os métodos gráficos (a e b), o da meia altura 
(b) é recomendado para os picos cuja linha de base não está bem definida e 
também por causa da imprecisão no traçado das tangentes. Entretanto, a medição 
de uma largura L’ (da ordem de 5 mm) muitas vezes acarreta um erro da mesma 
magnitude do erro da medida de L, de modo que os dois processos, em geral, 
podem ser considerados igualmente precisos. A experiência indicará, em cada 
ocasião, qual método deverá ser empregado.
Se os picos não estão completamente separados, ao ponto de não se 
poder medir a largura L’, utiliza-se o método “a” (S = h.L), medindo-se L do seguinte 
modo (Fig. 6.2):
1) Traçar, como na Fig. 6.1, a tangente do pico; mas só as 
mostradas na fig. 6.2;
2) A partir do ponto A (Fig. 6.2), traçar uma vertical até 
cortar a linha de base;
3) L1 e L2 são as bases dos dois picos da Fig. 6.2 e as suas 
áreas são h1L1 e h2L2.
Fig. 6.1 - Método gráfico para determinação de áreas relativas em 
cromatografia.
31
Alexandre Schuler - Cromatografia
OBS.: Essa técnica pode ser empregada também nos casos em que A fica abaixo de L’ e é 
denominada CORREÇÃO VERTICAL. Se o primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3), 
o procedimento é exatamente igual. Por outro lado, na situação inversa, a medição da área do segundo pico 
é feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda técnica chama-se CORREÇÃO TANGENCIAL. Se 
houver um outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da tangente, procede-se a uma 
correção vertical entre os dois pequenos.
Figura 6.2 - Correção vertical Figura 6.3 - Correção vertical Fig. 6.4 - Correção horizontal
6.3. Métodos de Cálculo
Os métodos de cálculo descritos a seguir já incluem a correção da área.
a) Normalização de área
Usa-se um dos componentes da mistura como referência. Seja uma mistura 
das substâncias S1, S2, ... , Sn e Sr, onde Sr é a referência.
A seguinte relação é válida para um cromatograma dessa mistura:
m
A
 = m
A
 A = m
m
 . Ar
r
i
c
c
i
r
r
i
i (eq. 9)
onde Aci é a área corrigida de uma substância qualquer i. Por outro lado, podemos dizer que:
A A Fc i ii = . (eq. 10)
onde Fi é o fator de correção. Igualando-se os segundos membros das equações 9 e 10, fica:
A .F = m
m
 . A ou F = m
m
 . A
A
i i
i
r
r i
i
r
r
i
(eq. 11)
32
Alexandre Schuler - Cromatografia
OBS.: Para uma mesma solução, mi / mr = Ci / Cr, logo Fi = Ci / Cr . Ar /Ai (eq. 11’) aplicando-
se a eq. 11 a uma amostra de concentração conhecida (mistura padrão), encontra-se Fi. Então, a 
partir da eq. 10 (aplicada à amostra de concentração desconhecida), é calculada a área corrigida 
Aci. Finalmente, a composição é dada pela eq. 12:
C = A
A
. 100i c
c
i
iΣ
(eq. 12)
Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma 
mesma função química, os fatores de correção (também denominados fatores de 
conversão - pois convertem a área em concentração ou massa - ou fatores de resposta) 
são praticamente iguais. Assim, admitindo-se que F1 = F2 = ... = Fn = F, pode-se fazer F 
= 1 e a equação 12 simplifica-se:
C A
A
. 100i = i
iΣ
(eq. 12’)
O caso geral é conhecido como Normalização de Área com Fator de 
Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 12’) como Normalização de Área sem Fator de 
Resposta, ou simplesmente Área %.
b) Padronização Interna
Para a determinação da composição de uma amostra pelo método da 
Normalização de Área, é necessário que todos os seus diversos componentes sejam detectados 
(a eq. 12 exige que sejam calculadas todas as áreas: ΣAci). Entretanto, não é fácil ter certeza 
absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Além disso, se apenas um 
único componente interessa ao analista, a sua determinação a partir de uma amostra com 
muitos componentes traria dois outros agravantes:
i) Todo trabalho de medição e cálculo dos picos de interesse.
ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de 
retenção do componente de interesse.
Para resolver o problema (ii) o analista preferiria usar um detetor que se 
possível só detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial ? A 
respostaa essas questões está na adição à amostra de uma substância nova, com as seguintes 
características: 
- Solúvel na amostra.
- Detectável.
- Possuir Tr diferente de qualquer componente detectável.
33
Alexandre Schuler - Cromatografia
- Não reagir com a amostra.
Essa substância é denominada de padrão interno.
Seja uma solução padrão contendo todas as substâncias de interesse e o 
padrão interno (Pi), cujas concentrações e áreas sejam respectivamente:
Ai e Ci - um componente qualquer de interesse.
APi e CPi - o padrão interno.
As relações Ci /Ai = Ri (eq. 13) e CPi /APi = RPi (eq. 14) dão a resposta do 
detetor para qualquer componente, inclusive Pi. Numa mesma solução, a relação Ri / RPi é 
constante e igual a Fi (comparar com a eq. 11).
C
A
 . A
C
 = Fi
i
p
p
i
i
i (eq. 15)
A adição do padrão interno a uma amostra de concentração desconhecida, 
resulta em uma solução para a qual são válidas as relações:
C
A
i
i
'
' = R (eq. 16) e 
C
A
 = R (eq. 17),i P
'
P
' P 
i
i
i 
equivalentes às equações 13 e 14. Logo,
C
A
 . F = R = C
A
P
'
P
' i i
i
'
i
'
i
i
(eq. 18)
Assim, C = A
A
 . C . Fi
' i
'
P
' P
'
i
i
i (eq. 19)
OBS.: A precisão desse método, bem como a do método “a”, independe do erro de injeção, 
mas a precisão de ambos depende do erro na preparação dos padrões.
c) Padronização externa
Mais prático que o método anterior e não necessitando também da detecção 
de todos os componentes da amostra, o método do padrão externo, entretanto, depende do 
volume injetado, de modo que sua precisão é influenciada pelo erro de injeção.
Considerem-se as equações 13 e 16. Numa solução de composição 
conhecida (solução padrão) e numa amostra desconhecida, têm-se respectivamente:
34
Alexandre Schuler - Cromatografia
C
A 
 = R e C
A
 = Ri
i
i i
'
i
' i
Igualando-se os dois primeiros membros, tem-se, tirando o valor de Ci
' :
C = A . C
Ai
'
i
' i
i
(eq. 20)
Como Ri é constante, uma vez determinado o seu valor, a partir da solução 
padrão e para cada componente de interesse, o analista terá apenas que aplicar a eq. 21:
C = A . Ri
'
i
'
i (eq. 21)
OBS.:
1 - Os valores de Ri, obtidos num determinado laboratório, podem ser tabelados, ou 
fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilização das análises. Devido a 
alterações na sensibilidade do detetor (variação na relação de fluxo dos gases auxiliares no 
DIC, corrosão, decaimento natural na fonte radioativa do DCE, etc.), os valores de Fi (ou de 
Ri) devem ser recalculados periodicamente. O analista deverá determinar experimentalmente 
a periodicidade. 
2 - O método do padrão externo (regra de três simples) é uma simplificação do 
método do padrão interno (regra de três composta), onde se faz Vip = Via , onde Vip é o 
volume injetado de solução padrão e Via é o volume injetado da amostra. Portanto, a precisão 
deste método de cálculo depende da perícia do analista na medição do volume a ser injetado.
d) Técnica para fechar uma análise
Muitas vezes é necessário fazer duas injeções. Isso acontece quando uma 
única coluna não consegue separar todos os componentes e/ou um único detetor não detecta 
todas as substâncias.
Considere-se o método de Normalização de Área e uma situação em que 
um dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injeções o 
volume não foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas áreas dos dois 
cromatogramas fossem somadas diretamente.
No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os 
componentes (1), (2) e (4) são quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2) aparece 
nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas áreas, nos dois cromatogramas (Aa2 e Ab2) 
seriam iguais. Na prática, geralmente encontra-se A Aa b2 2≠ . Qualquer uma das áreas é 
correta, de modo que A ou B pode ser tomada como referência, indiferentemente. Tomando 
o cromatograma A como referência, tem-se:
35
Alexandre Schuler - Cromatografia
A
A
a
b
2
2
 = K (para corrigir as áreas no cromatograma B)
A .F + A .F + A .K.F + A .F + A .F .K = Aa1 1 a2 2 b3 3 a4 4 b5 5 ci∑ , 
onde Aci é qualquer termo do 1o membro. A concentração de qualquer componente é 
calculada a partir da eq. 12.
6.4. Seleção do melhor método de cálculo
Para se decidir sobre o melhor método de cálculo para uma dada amostra, 
basta responder às questões apresentadas no Esquema 6.1.
36
Alexandre Schuler - Cromatografia
Esquema 6.1 - Critérios para seleção do melhor método de cálculo.
37
Alexandre Schuler - Cromatografia
7 - OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO ANALÍTICO
7.1. Parâmetros analíticos
Conforme foi visto ao longo dos capítulos anteriores, muitos fatores 
influem no processo cromatográfico. Essa influência não é aleatória, podendo portanto ser 
controlada pelo operador, com o objetivo de otimizar o processo de separação.
A Tabela 7.1 mostra a importância do correto dimensionamento de uma 
coluna cromatográfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influência do volume injetado 
sobre L (largura do pico na base; ver Fig. 2.14, p. 13), n e H (ver Fig. 2.13, p. 13). O Gráfico 
7.1 mostra a relação entre C e nmax () e entre C e Hmin(), onde C é a concentração da fase 
estacionária. O Gráfico 7.2 mostra como esses parâmetros (n e H) variam com o 
comprimento da coluna (l).
A temperatura (T) modifica o tempo de retenção (tr). A variação do tr com 
T não é linear. A relação
∆tr / ∆T
depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o 
Gráfico 7.3 e os Cromatogramas 7.1.a,b e 7.2.a,b,c evidenciam essas afirmações. Finalmente, 
a Tabela 7.4 mostra que nmax, Hmin e Fo (vazão ideal) dependem inclusive da granulometria do 
suporte.
Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentração da FE sobre a eficiência.
Coluna * Vazão Ideal
l (m) C (%) m (g) Fo n x 10-3 H (mm)
(mL/min)
1
2
4
9
16
4
4
4
4
10
10
10
10
10
1
2
5
20
0,13
0,24
0,57
1,24
2,15
0,05
0,12
0,26
1,18
30+5
20+5
28+5
21+5
38+5
18+5
26+5
34+5
37+5
0,8
1,4
4,3
8,0
16,0
1,9
2,0
2,7
3,3
1,25
1,43
0,93
1,13
1,00
2,11
2,00
1,48
1,21
(*) a) Fase estacionária: Apiezon L; DE = 1/8”; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh
b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.
Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H.
Volume (µL) L (mm) n H (mm)
39
Alexandre Schuler - Cromatografia
0,5
1,0
1,5
2,0
7
9
11
12
15.800
9760
6800
5270
1,01
1,64
2,35
3,03
Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de retenção
Composto 70oC 100oC 130oC 160oC
n-pentano 1,60 1,17 0,85 0,68
n-hexano 3,29 1,93 1,23 0,77
n-heptano 7,38 3,65 1,92 1,35
n-octano 18,88 7,08 3,25 2,00
A partir dessas informações é possível estabelecer, por exemplo, para uma 
coluna com 1/8” de diâmetro externo (coluna analítica), que:
♦ Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax é função linear de l.
♦ O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte.
♦ O valor de nmax varia com C, sendo máximo quando C = 12 %, para suporte com faixa 
de granulometria de 60-80 mesh ( ≡ malhas por polegada linear; equivale a um 
diâmetro de partícula de 175-230 mm).
♦ A faixa de vazão ideal não varia com a temperatura.
♦ O tempo de retenção diminui de maneira não linear com o aumento da temperatura; a 
relação ∆tr / ∆T varia com a natureza do composto e o intervalo de temperaturaconsiderado.
7.2. Projetando um método analítico
Para se projetar um novo método analítico por cromatografia, são 
necessárias várias avaliações, relacionadas a seguir:
40
Alexandre Schuler - Cromatografia
♦ Seleção do tipo de cromatógrafo (a gás ou a líquido);
♦ Seleção do detetor, em função dos compostos a serem analisados e de suas concentrações;
♦ Parâmetros de funcionamento do detetor;
♦ Seleção da coluna:
• natureza da Fase Estacionária (e sua granulometria, caso seja sólida);
• dimensões da coluna (comprimento e diâmetro);
• concentração da Fase Estacionária (FE), natureza e granulometria do suporte, no 
caso de FE líquida;
♦ Seleção da temperatura (ou programação de temperatura) para a coluna, no caso de CFG;
♦ Seleção do Gradiente de Polaridade, se necessário, no caso de CFL (HPLC);
♦ Determinação do Limite de Detecção (LD) e da Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD);
♦ Determinação dos Fatores de Resposta;
♦ Determinação das demais condições de análise: volume injetado, técnica de injeção, 
atenuação (se não dispuser de sistema de integração), temperatura do vaporizador (em 
CFG) e do detetor e vazão da fase móvel (ou gradiente);
♦ Concentração dos componentes na solução padrão, natureza do solvente empregado e 
técnicas de amostragem e de preparação da amostra e da solução padrão;
♦ Método de cálculo utilizado;
♦ Número mínimo de determinações em paralelo e erro máximo (reprodutibilidade);
♦ Avaliação do erro estatístico global, associado às diversas operações (preparação de 
soluções, técnica de amostragem, técnica de injeção e medição de área); expressão do 
resultado final;
Observações:
a) na seleção do detetor, verificar se o material a ser analisado é detectável por ele e se o 
seu Limite de Detecção é compatível com a faixa de concentração de interesse (ver, 
por exemplo, a Tabela 4.1 na p. 26);
b) na avaliação dos erros estatísticos, considerar todas as operações envolvidas, tais como 
pesagem, medição de volume, diluição, técnicas de amostragem e de injeção, etc;
c) para cálculos estatísticos, utilizar o Apêndice 6 (ver Seção 7.3).;
d) em relação aos diversos métodos de cálculo, lembrar que:
Método prep. 
Padrão
prep. 
Amostra
injeção comp. Não 
detectados
altura(1)
Área % Não Não Não Sim Sim
Norm % Sim Não Não Sim Sim
P. Ext. Sim Não Sim Não Não(2)
P. Int. Sim Sim Não Não Não(2)
41
Alexandre Schuler - Cromatografia
(1) como medida da “área”; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentração.
42
Alexandre Schuler - Cromatografia
Tabela 7.4 – Efeito da granulometria do suporte sobre a eficiência
Malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)
60-80 4300 0,93 20
 80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
D.E. = 1/8”; l = 4 m; C = 10 %
7.3. Validação de um método analítico
7.3.1. Objetivo
A identificação por Cromatografia (a gás ou a líquido) é feita por 
comparação dos tempos de retenção , para uma dada substância, entre uma solução 
padrão e a amostra. Entretanto, é sabido que num determinado sistema cromatográfico 
(Fase Móvel, Fase Estacionária e Detetor), mesmo empregando-se como fluxo da Fase 
Móvel aquele encontrado por ser o ideal (de acordo com os experimentos de van 
Deemter), não é nula a probabilidade de outro componente da amostra apresentar o 
mesmo tempo de retenção que o da substância de interesse. Validar um método analítico 
consiste em garantir que nas condições analíticas, a substância-problema e apenas ela 
apresenta aquele tempo de retenção. Evidentemente um método validado deve ser 
operacionalizado através de um manual (Norma), o qual determina condições 
padronizadas que garantam a sua repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado 
que um determinado método analítico validado para um determinado tipo de amostra 
não é necessariamente válido para outro tipo de amostra (ex.: dosagem de um princípio 
ativo existente em um determinado medicamento versus a mesma determinação nas 
vísceras do cadáver de uma suposta vítima de super-dosagem), posto que outro tipo de 
43
Alexandre Schuler - Cromatografia
amostra pode conter outras substâncias também passíveis de ser detectadas no mesmo 
tempo de retenção do analito e que não tenham sido incluídas na pesquisa de validação.
7.3.2. Conceitos
Com o objetivo de garantir uma correta compreensão deste texto, 
são apresentados a seguir os termos técnicos aqui empregados, com suas 
respectivas definições.
Nome notação descrição
Analito Substância-problema.
Amostra Qualquer material, independentemente de 
sua origem, que contenha o analito.
Padrão O analito, comercializado com alta pureza.
United States Pharmacopea USP Farmacopéia Americana. Fonte de consulta.
Concentração c Concentração do analito (ou do padrão).
Solução Estoque SE Solução do padrão a alta concentração (pode 
ser guardada por alguns meses, dependendo 
da natureza da substância).
Solução Intermediária SI Solução do padrão, necessária para se chegar 
à Solução de Trabalho.
Solução de Trabalho ST Solução do padrão com concentração 
semelhante ao que se espera da amostra.
Faixa de Linearidade FL Intervalo de concentração em que existe 
relação linear com a área do pico.
Curva de Calibração Curva construída com os dados da Faixa de 
Trabalho.
Coeficiente de Correlação r Parâmetro que mede a precisão com que a Curva 
de Calibração relaciona as áreas com as 
respectivas concentrações. É usado para avaliar o 
fim da região linear na construção da FL.
Faixa de Trabalho FT Intervalo contido na FL, compreendendo as 
concentrações usuais da amostra.
Limite de Detecção do 
Equipamento
LDE Concentração mínima detectável do analito 
no extrato injetado.
Limite de Detecção da 
Amostra
LDA Concentração mínima detectável do analito na 
amostra.
Limite Efetivo LE Concentração mínima do analito que 
corresponde a um erro máximo aceitável.
Seletividade α Capacidade de separar a substância-problema 
dos demais componentes da amostra.
Resolução Rs Mede a seletividade.
Precisão Avalia a repetibi l idade ou a 
reprodutibilidade de um método analítico, 
44
Alexandre Schuler - Cromatografia
por medida da 1a ou da 2a estimativa do 
desvio padrão (Apêndice 6).
Exatidão Grau de fidelidade com que o resultado 
exprime o valor real da concentração do 
analito. Avaliado com auxílio do teste t1 (de 
Student), por comparação com uma solução 
padrão (Apêndice 6).
Recuperação Nos casos em que se faz uma extração, é 
necessário determinar o percentual de 
extração e sua repetibilidade. Recomenda-se 
que a solução padrão seja submetida à 
mesma operação.
Repetibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por 
repetição da análise, num mesmo Laboratório, 
com o mesmo equipamento e mesmo analista. 
Ver Precisão.
Reprodutibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por 
repetição da análise, em diferentes Laboratórios, 
diferentes equipamentos ou diferentes analistas. 
Usa o teste F (Apêndice 6).
Consistência Mede a influência sobre a repetibilidade, das 
diversas operações constantes do método.
Robustez Mede a influência sobre a Reprodutibilidade, 
das diversas operações constantes do método.
7.3.3. Procedimento
a) Seletividade / Identificação
A principal fase do trabalho é aquela em que é testada a confiabilidade da 
identificação. Isso inclui a determinação do tempo de retenção de toda e qualquer substância 
que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam:
• impurezas de síntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poderá ser bastante 
penoso);
• impurezas de degradação (essas informações podem ser obtidas de estudos shelf-
life);
• excipientes, conservantes, aditivose outros princípios ativos constantes da 
formulação (no caso de associações);
Deve ser lembrado que a identificação pura e simples por 
cromatografia (método não validado) não tem valor científico. Assim, o ideal, o 
recomendado mesmo, é associar à técnica cromatográfica, a técnica de Espectrometria de 
Massas. Essa associação pode ser manual, através da separação física, por coleta na 
saída da coluna, seguida da obtenção do espectro de massas . A identificação pode ser 
45
Alexandre Schuler - Cromatografia
ainda complementada com auxílio de outra técnica analítica, como a Espectrometria 
de Ressonância Magnética Nuclear, Espectrofotometria no Ultravioleta-Visível ou a 
Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem cromatógrafos (CFG ou 
HPLC) acoplados a um espectrômetro de massas, o qual substitui o detetor tradicional 
do cromatógrafo.
Embora os exemplos aqui apresentados sejam típicos da indústria 
farmacêutica, os diversos procedimentos são igualmente aplicáveis a qualquer outro tipo de 
amostra. De um modo geral, produtos de síntese (de uso farmacêutico ou não) podem ter seu 
método analítico validado sem auxílio da espectrometria (embora seu emprego dê maior 
credibilidade à validação). Por outro lado, qualquer outro material (inclusive de uso 
farmacêutico) exige a associação de métodos espectrométricos.
Já se sabe que a eficiência (n) de uma coluna é diretamente proporcional ao 
tempo de retenção. Portanto, quanto maior for o tempo de eluição, maior será a sua 
eficiência. Assim, a seletividade pode ser medida como a razão dos tempos de retenção:
α = tr1/tr2
Essa relação é também denominada retenção relativa (p. 12) ou ainda fator de separação e 
demonstra-se que é equivalente às relações dos coeficientes de partição:
α = kp1/kp2
Entretanto, esse critério é algo insatisfatório, posto que colunas com diferentes eficiências 
podem apresentar mesmos fatores de separação, conforme pode ser visto na Figura 7.1.a,b. 
Porisso, em vez da seletividade, emprega-se a resolução (Rs), como medida efetiva da 
capacidade de separação:
Rs = 2(tr2 – tr1)/(L1 + L2)
ou seja, a resolução é igual à diferença entre os tempos de retenção dividida pela média da 
larguras na base (Figura 2.14, p. 13).
É óbvio que a resolução diminui com o alargamento do pico e 
evidentemente também diminui se a cauda, resultante de uma interação excessiva com a fase 
estacionária, é bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformação do pico deve ser 
considerada quando da seleção da coluna. Chama-se fator de deformação ou fator de 
assimetria (TF, do inglês tailing factor) a relação
TF = 
BC
AB
onde a distância BD é igual a 10 % da altura do pico ( DE ). O TF máximo admissível é 3.
46
Alexandre Schuler - Cromatografia
Figura 7.2 – Pico com cauda (deformação)
Figura 7.1 – Resolução a) baixa; b) alta
b) Detalhamento da Metodologia
A metodologia analítica inclui todos os parâmetros explicitados na Seção 
7.2 (página 41).
c) Avaliação estatística
Para realização dos testes estatísticos, sugere-se que qualquer 
operação (preparação da solução padrão, tomada de alíquotas, etc) seja realizada 
em triplicata (ou mais) e que cada solução obtida seja injetada pelo menos cinco 
vezes. Nesses casos, deve ser empregada a 2a estimativa do desvio padrão (sR; 
Apêndice 6). A 1a estimativa (s) só deve ser empregada em conjuntos de dados com 
mais de 10 itens.
d) Exemplo
A seguir, é apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operação. Para 
este exemplo, foi selecionado o produto aspirina. A aspirina é comercializada em várias 
formas, sendo selecionado como amostra o comprimido.
A aspirina (ácido acetilsalicílico) é produzida industrialmente a partir do 
ácido salicílico:
47
Alexandre Schuler - Cromatografia
Desse modo, é de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante 
comum no produto (AAS). Consequentemente, o AS é uma das substâncias que devem ter 
seu tempo de retenção medido, para verificar se coincide ou não com o do AAS.
Uma vez completada a etapa de identificação (vale repetir: confirmação de 
que nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo de 
retenção do AAS), parte-se para as avaliações estatísticas.
i. Condições analíticas :
♦ Cromatógrafo a líquido modelo CG 480E, com detetor de ultravioleta CG 437B.
♦ Comprimento de onda: 254 nm.
♦ Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 µm; temperatura ambiente.
♦ Fase Móvel: H2O:Metanol:Ácido Acético (46:52,5:1,5); 1,5 mL/min (isocrático).
Preparação das soluções padrão (para AAS e AS):
A solução estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais soluções foram de 200, 100, 20, 10 e 5 
mg/100 mL.
Preparação da amostra:
A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alíquota pesando 55 
mg (10% do peso médio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da fase 
móvel, com auxílio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 µm).
Injeção da amostra: válvula Rheodyne, com loop de 20 µL.
ii. Faixa de Linearidade e Limite de Detecção 
As soluções padrão foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluída foi injetada 
dez vezes. A partir da médias das áreas obtidas, foram construídas as respectivas Faixas de 
Linearidade (Gráficos 7.4 e 7.5), onde evidencia-se que as massas injetadas conforme prescrito em 
Preparação da amostra permanecem dentro da região linear. O ruído (medido com atenuação 
mínima necessária para uma altura não inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por comparação com 
48
Alexandre Schuler - Cromatografia
a média das alturas dos picos das dez injeções da solução mais diluída resultou em um Limite de 
Detecção (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.
0 500 1000 1500 2000
0,0
2,0x102
4,0x102
6,0x102
8,0x102
r = 0,99996
Á
re
a 
do
 p
ic
o
Concentração (mg/L)
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
r = 0,99999
Á
re
a 
do
 p
ic
o
Concentração (mg/L)
Gráfico 7.4 – FLD do AAS. Gráfico 7.5 – FLD do AS.
iii. Precisão e expressão dos resultados 
A partir dos dados (áreas) das dez injeções da solução mais diluída referida no item 
ii acima, pode ser calculado o erro analítico (de repetibilidade) e a partir deste (1,2%), 
determinar a forma correta de expressão do resultado (válida para ambos os compostos):
Re = X ± 0,01 mg/L
49
Alexandre Schuler - Cromatografia
8 – TÉCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAÇÃO
8.1. Tempo de retenção e retenção relativa
A identificação é feita tradicionalmente através da medição do tempo de 
retenção (tr). Entretanto, a essa forma de medição está associado um erro, decorrente de uma 
natural variação no tempo transcorrido entre a injeção e o acionamento do sistema de 
registro. Esse erro costuma ser da ordem de 2 % em relação ao tempo de retenção. É pequeno 
demais, na maioria das vezes. Mas há casos em que a diferença de tr entre dois componentes é 
dessa mesma ordem de grandeza. Em tais casos é recomendável o emprego da Retenção 
Relativa (RR). Um dos componentes é tomado como referência (RR = 1) e as RR’s dos 
demais são calculadas com auxílio da relação:
RRb = trb/tra ,
onde tra e trb são, respectivamente, os tempos de retenção da referência e de outro componente.
8.2. Índice de retenção
Outro parâmetro utilizado para identificação, o Índice de Retenção (Ir) é 
determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i) 
com duas parafinas normais com n e m (m = n + 1) átomos de carbono, desde que:
Vrn < Vri <Vrm onde Vr = volume de retenção = F.tr
A relação
pode ser substituída 
por:
Nesse sistema, assume-se que: 
Padrões para determinação