Relatório Análise Instrumemntal I

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1 
​INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E 
TECNOLOGIA DA BAHIA Ministério da Educação 
Secretaria de Educação Profissional 
e Tecnológica 
 
 
 
CURSO TÉCNICO EM QUÍMICA INTEGRADO AO ENSINO MÉDIO 
 ​DAQ - DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUÍMICA 
 
 
RELATÓRIO DE EXPERIMENTOS DA Iª UNIDADE 
 
 
 
 EDUARDA ALVES CHAGAS - nº 13 
 ESDRAS SANTOS DA SILVA - nº 15 
MARIANA DOS SANTOS SILVA - nº 21 
 TURMA: 8841 / G2-B 
 
 
 
 
SALVADOR, BA 
AGOSTO DE 2018 
 
2 
​INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E 
TECNOLOGIA DA BAHIA Ministério da Educação 
Secretaria de Educação Profissional 
e Tecnológica 
 
CURSO TÉCNICO EM QUÍMICA INTEGRADO AO ENSINO MÉDIO 
DAQ - DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUÍMICA 
 
RELATÓRIO DE EXPERIMENTOS DA Iª UNIDADE 
 
Relatório dos experimentos referentes às Técnicas 
Cromatográficas realizados no ​IFBA - Instituto 
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia da Bahia 
nos meses de Junho e Julho, para fins de avaliação, 
como parte integrante do currículo do Curso Técnico 
em Química Integrado ao Ensino Médio. 
 
EDUARDA ALVES CHAGAS - nº 13 
 ESDRAS SANTOS DA SILVA - nº 15 
MARIANA DOS SANTOS SILVA - nº 21 
 TURMA: 8841 / G2-B 
 
Professora Orientadora:​ ​Dra. Rosângela Novaes de Jesus. 
 
 
SALVADOR, BA 
AGOSTO DE 2018 
 
3 
 
 
RESUMO 
 
Este relatório apresenta tanto os resultados quantos as discussões 
relacionados ao estudo da técnica da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE). Os experimentos realizados tinham como objetivo compreender a 
aplicabilidade e a função de cada procedimento relativo a CLAE, analisar os 
diferentes métodos, seus resultados, os fatores que interferem diretamente nisto. 
Desta maneira foi observado o efeito da variação de fluxo e do comprimento de 
onda de detecção na análise de uma amostra de naftaleno, posteriormente, foi 
observado o efeito do tipo de fase móvel e o tipo de eluição em análises utilizando 
cromatografia líquida de alta eficiência e foi construída uma curva de calibração. 
 
 
 
 
4 
 
 
SUMÁRIO 
Páginas 
1. OBJETIVOS……...…………………....………………………………………………...​06 
1.1 Objetivo Geral………..……………………………………………….……….​06 
1.2 Objetivos Específicos…….………………………………………………….​06 
1.2.1 Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solventes…………..…………………....06 
1.2.2 Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de 
Onda de Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por CLAE…….…....06 
1.2.3 Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na 
Análise de Hidrazonas por CLAE…..…………………………………....……….06 
1.2.4 Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, 
com 04 pontos por CLAE….………………………………………………...…….06 
2. INTRODUÇÃO…………………………………………...……………………………...​07 
3. MATERIAIS E REAGENTES UTILIZADOS……………………..…...……………...​10 
3.1 Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solventes…………….....…………………....​10 
3.2 Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de Onda 
de Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por 
CLAE……….………….........​10 
3.3 Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na 
Análise de Hidrazonas por CLAE………..……………………....…………....……….​11 
3.4 Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, com 04 
pontos por CLAE……….……………………………....………………………......…….​11 
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL……………………………………….………...​13 
4.1 Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solventes……………………...…..………....​13 
4.2 Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de Onda 
de Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por CLAE…………..……..….​13 
4.3 Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na 
Análise de Hidrazonas por CLAE………..…………………………………....……….​14 
 
5 
4.4 Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, com 04 
pontos por CLAE………………………………….……………………………......…….​14 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO……………………...……………………….……….​16 
5.1 Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solventes………………………...………......​16 
5.2 Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de Onda 
de Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por 
CLAE…..…………..………...​17 
5.3 Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na 
Análise de Hidrazonas por CLAE………..………………....………………....……….​24 
5.4 Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, com 04 
pontos por CLAE……………………….………………………………………......…….​29 
6. CONCLUSÃO…………………………………………………………………………....​32 
7. REFERÊNCIAS………………………………………………………………………….​33 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
1. OBJETIVOS 
1.1 
Objetivo Geral 
Realizar operações com o Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE), 
observando os efeitos que as variações (no fluxo, comprimento de onda, tipo de fase 
móvel e tipo de eluição) provocam no resultado final. 
1.2 
Objetivos Específicos 
1.2.1 
Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solvente. 
❖ Identificar os módulos e acessórios de um cromatógrafo líquido; 
❖ Realizar operações de filtração e desgaseificação do solvente. 
1.2.2 
Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de Onda de 
Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por CLAE. 
❖ Observar o efeito da variação de fluxo e de comprimento de onda de detecção 
na análise de amostra de naftaleno por CLAE. 
1.2.3 
Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na 
Análise de Hidrazonas por CLAE. 
❖ Observar o efeito da variação do tipo de fase móvel e do tipo de eluição na 
análise de Hidrazonas por CLAE. 
1.2.4 
Prática 05: Construção de curva de calibração do naftaleno, com 4 
pontos, por CLAE. 
 
7 
❖ Construir uma curva de calibração do naftaleno, com 04 pontos, por CLAE e 
determinar a concentração do naftaleno em uma amostra desconhecida. 
2. INTRODUÇÃO 
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é um método de separação 
de compostos amplamente utilizado na bioquímica e análise química, sendo este um 
tipo versátil de cromatografia de eluição. Surgiu a partir da Cromatografia Líquida 
Clássica (CLC), onde se utilizava colunas de vidro à pressão atmosférica, como fluxo 
de fase móvel devido à ação da gravidade, desenvolvendo-se até chegar à 
tecnologia atual -colunas metálicas e altas pressões da fase móvel obtidas por 
bombas-. Nasce a busca e necessidade de tornar a técnica mais rápida, o que é 
possível por sua grande vazão, e de alta resolução, decorrente do pequeno tamanho 
de partículas da fase estacionária. 
Figura 01:​ Esquema simplificado de CLAE. 
 
Fonte:​ Lucas Marianno. 
 
O que eluato da coluna é submetido a uma certa faixa de comprimento de 
onda. Tendo, os materiais, diferentes espectros de absorção, ou seja, absorvendo 
cada um de forma melhor a cada comprimento. 
Sendo assim, a relação é de que quanto mais analito saindo da coluna, maior 
a absorção da radiação emitida e, consequentemente, a indicação do detector de 
maior concentração da substância passando por sua cela. Nesse sentido, é possível 
visualizar melhor os resultados obtidos a partir dos cromatogramas gerados, como o 
da figura abaixo. 
Figura 02:​ Cromatograma genérico. 
 
 
8Fonte:​ Associação Brasileira de Química. 
 
Nesses gráficos, quanto maior for o pico, maior a concentração do 
componente na amostra. Outra característica é a diferença entre as larguras das 
bandas, que quanto maior significa grande dispersão do composto, podendo até 
ocorrer sobreposição de bandas em caso de duas ou mais bandas largas. 
Esse espalhamento decorre dos caminhos diferenciados que o analito toma 
através da fase estacionária. Isso, é resultado de uma FE não homogênea - com 
regiões de maior e menor empacotamento - ou da utilização de um fluxo de fase 
móvel ineficiente, dificultando o arraste das partículas e, consequentemente, 
dispersando-as. 
Em CLAE, o conjunto de informações da corrida constituem o método. A 
mudança numa das grandezas (vazão, comprimento de onda etc.) resulta em dado 
diferenciado. Dessa forma, a variação do fluxo do solvente, a aplicação de diferentes 
comprimentos de onda, a mudança do solvente da fase móvel e seu eluente, 
modificam (para mais ou para menos) o tempo de retenção e a eficiência dos 
componentes. 
Existem diversos detectores capaz de medir a absorbância de determinado 
comprimento de onda num material. A relação disso com a emissão do comprimento 
pode ser quantizada através da equação de Beer-Lambert. 
Equação 01:​ Lei de Beer-Lambert. 
 
Os estudos de Beer também trouxeram compreensão à existência de outro 
conceito, a de transmitância, ou a de não absorbância, que pode ser expressa na 
equação abaixo. 
Equação 02:​ Beer-Lambert. 
 
Em suma, através do CLAE pode-se quantificar a concentração de 
determinado componente em uma amostra partir da curva de calibração, que 
 
9 
relaciona concentração e a área do pico. Nessa, feita a partir de soluções padrão do 
mesmo componente, pode-se encontrar a equação da reta e, consequentemente, a 
concentração do analito. 
A separação de componentes na CLAE pode ser realizadas por mecanismos 
distintos, a escolha deste se baseia nas características físicas e químicas que os 
componentes da amostra apresentam, desta forma os mecanismos utilizados na 
CLAE : 
● Adsorção: Quando o mecanismo de separação se baseia na 
competição das moléculas da amostra e da fase móvel pelos sítios da 
fase estacionária 
● Partição: Este mecanismo se baseia nas diferentes solubilidades do 
analitos na fase estacionária e na fase móvel. 
● Troca iônica: A fase estacionária é ligada com grupos iônicos, onde o 
contra-íon pode ser substituído pelo analito, causando a sua retenção. 
● Bioafinidade: Este mecanismo ocorre através de reações bioquímicas 
específicas. 
● Exclusão: Ocorre por meio de um mecanismo mais físico, se baseia no 
tamanho das partículas, geralmente as menores são retidas pela fase 
estacionária e as maiores são arrastadas pela fase móvel. 
Na escolha do método a ser utilizado na cromatografia deve-se levar em 
consideração a solubilidade do analito em água e em solventes orgânicos, a 
polaridade deste e a sua massa molar. 
Já na escolha da fase móvel deve-se procurar as seguintes características 
no solvente: ser inerte, solubilizar o analito, ser isenta de impurezas que possam 
contaminar a amostra, não deve interagir com a fase estacionária. 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
3. MATERIAIS E REAGENTES UTILIZADOS 
3.1 
Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solvente. 
Tabela 01:​ Demonstração do cromatógrafo líquido, banho de ultrassom e sistema de 
filtração de solvente. 
Material Quantidade Capacidade 
Cromatógrafo Líquido 
(composto por bomba 
quaternária, 
compartimento de 
colunas com 
aquecimento, detector) 
01 - 
Banho de Ultrassom 01 - 
Sistema de Filtração de 
Solvente 
01 - 
Software 01 - 
Vaso de Descarte 01 2 L 
3.2 
Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de Onda de 
Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por CLAE. 
Tabela 02:​ Equipamentos utilizados na Prática 02. 
Equipamento Quantidade Capacidade 
Cromatógrafo 
Líquido 
(aparelhagem 
completa) 
01 - 
 Tabela 03:​ Reagentes utilizados na Prática 02. 
Reagente Quantidade Concentração 
Metanol 20 mL Grau HPLC 
Solução de 
Naftaleno em 
Hexano 
9 µL 0,01 mol/L 
Água - Ultra-Pura 
 
 
11 
3.3 
Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na Análise 
de Hidrazonas por CLAE. 
Tabela 04:​ Materiais utilizados na Prática 03. 
Material Quantidade Capacidade 
Cromatógrafo 
Líquido 
(aparelhagem 
completa) 
01 - 
 Tabela 05:​ Reagentes utilizados na Prática 03. 
Reagente Quantidade Concentração 
Acetonitrila 
- 
Pura e na 
proporção 6:4 
ACN:H₂O 
Água - Ultra-Pura 
Solução de 
Hidrazonas em 
Etanol 
≅ ​10 mL - 
3.4 
Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, com 04 
pontos por CLAE. 
Tabela 06:​ Materiais utilizados na Prática 05. 
Material Quantidade Capacidade 
Cromatógrafo 
Líquido 
(aparelhagem 
completa) 
01 - 
Béquer 01 25 mL 
Pipeta de Pasteur 04 3 mL 
Balão Volumétrico 04 5 mL 
Micropipetador 01 1000 µL 
Tabela 07: ​Reagentes Utilizados na Prática 05. 
Reagente Quantidade Concentração 
Solução de 
Naftaleno em 
0,150 mL 0,0012 mol/L 
 
12 
Hexano 
Solução de 
Naftaleno em 
hexano 
0,200 mL 0,0016 mol/L 
 
Solução de 
Naftaleno em 
Hexano 
0,250 mL 0,0020 mol/L 
 
Solução de 
Naftaleno em 
Hexano 
0,300 mL 0,0024 mol/L 
Água ≅ ​20 mL Ultra-Pura 
 
 
 
13 
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
4.1 
Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solvente. 
1. Primeiramente localizou-se os acessórios do equipamento e realizou-se o 
mapeamento dos controles que envolvem o cromatógrafo da AGILENT: 
pressão, fluxo, comprimento de onda entre outros; 
2. Configurou-se o sistema de software para uma possível análise qualitativa ou 
quantitativa e criou-se um método; 
3. Verificou-se as tubulações e retirou-se bolhas de ar; 
4. Ligou-se o banho de ultrassom e realizou-se o procedimento para 
desgaseificação do solvente. 
4.2 
Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de Onda de 
Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por CLAE (Equipamento de 
CLAE da Agilent). 
1. A fase móvel foi desgaseificada e colocou-se os recipientes nos respectivos 
lugares com os tubos de conexão e filtros; 
2. Ligou-se o computador e os módulos e checou-se a comunicação entre estes; 
3. Removeu-se as bolhas de ar entre as válvulas de purga, para isso purgou-se 
as linhas com fluxo elevado de fase móvel; 
4. Fechou-se a válvula de purga; 
5. Aguardou-se a estabilização do sistema; 
6. Construiu-se um método de análise; 
7. Ligou-se a lâmpada UV; 
8. Realizou-se as três análises da amostra de naftaleno 0,01 mol/L em hexano 
nas condições mostradas na ​Tabela 08 abaixo, registou-se os respectivos 
tempos de retenção e larguras de bandas do pico do naftaleno. 
Tabela 08: ​Resultados referentes à Prática 02. 
Corrida Fase 
Móvel 
Fluxo 
(mL/mi
n) 
Compri
mento 
de onda 
de 
detecçã
Volume de 
amostra 
injetado 
(µL) 
Tempo de 
retenção 
(minutos) 
Largura de 
banda 
(minutos) 
 
14 
o (nm) 
1 MeOH 1 260 3 3,292 0,0564 
2 MeOH 1 600 3 4,026 0,0498 
3 MeOH 0,5 260 3 6,559 0,0961 
4.3 
Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na Análise 
de Hidrazonas por CLAE. 
1. A fase móvel foi desgaseificada e colocou-se os recipientes nos respectivos 
lugares com os tubos de conexão e filtros; 
2. Removeu-seas bolhas de ar entre a válvula de purga através da purga; 
3. Ligou-se o computador e os módulos e checou-se a comunicação entre estes; 
4. Fechou-se a válvula de purga; 
5. Construiu-se um método de análise; 
6. Aguardou-se a estabilização do sistema nas condições do método; 
7. Realizou-se as três análises da amostra nas condições especificadas na 
Tabela 09​ abaixo e aguardou-se a estabilização do sistema entre as análises. 
Tabela 09:​ Especificações das análises da Prática 03. 
Análise Fluxo 
(mL/min) 
Tempo 
(min) 
% ACN % 
ACN:H​₂​O 
6:4 
Comprime
nto de 
onda de 
detecção 
(nm) 
01 1 
1 
0 
10 
100 
100 
0 
0 
350 
350 
02 1 
1 
0 
10 
0 
0 
100 
100 
350 
350 
03 1 
1 
1 
0 
2 
10 
10 
50 
50 
90 
50 
50 
350 
350 
350 
 
4.4 
Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, com 04 
pontos por CLAE. 
1.Preparo das soluções para a curva de calibração: 
 
15 
a) Preparou-se 04 soluções, em balões volumétricos de 05 mL, tomando 
alíquotas da solução-estoque conforme a ​Tabela 10​ abaixo. 
Tabela 10:​ Preparo de soluções referente à Prática 05. 
Solução desejada Concentração desejada 
(mol/L) 
Volume necessário para 
balão volumétrico de 5 
mL 
01 0,0012 0,150 
02 0,0016 0,200 
03 0,0020 0,250 
04 0,0024 0,300 
2. Criou-se o método de análise no CLAE; 
3. Injetou-se as 04 soluções preparadas, em duplicata, e obteve-se a médio 
da área do pico de cada solução; 
4. Injetou-se a amostra de concentração desconhecida e calculou-se sua 
concentração. 
 
 
 
16 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
5.1 
Prática 01: Demonstração do Cromatógrafo Líquido, Banho de 
Ultrassom e Sistema de Filtração de Solventes. 
A cromatografia, como já foi dito, é um método físico-químico de separação 
dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses 
componentes em duas fases, uma das quais permanece estacionária, enquanto a 
outra se move através dela. No caso da cromatografia líquida de alta eficiência, a 
fase móvel é líquida e a fase estacionária, que é acondicionada em colunas, pode 
ser sólida ou líquida. 
No laboratório de Análise Instrumental tem-se dois equipamentos de 
cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography – 
HPLC): 
● HPLC marca Agilent, modelo 1200 Infinity, com injetor automático e detector 
de arranjo de diodos (DAD). 
● Cromatógrafo líquido de alta eficiência 01 Varian Modelo Polaris, com 
detector UV-Vis. 
O detector DAD é capaz de detectar vários comprimentos de onda 
simultaneamente. Já o detector UV-Vis é capaz de variar o comprimento de onda de 
detecção, mas apenas uma leitura é feita a cada tempo. Os detectores de 
absorbância, sob condições ótimas, e para compostos que absorvem intensamente 
na faixa observada, podem detectar amostras na ordem de 10​-10 g. O detector RID 
acompanha continuamente a diferença no índice de refração entre o efluente que sai 
da coluna, contendo os componentes da amostra, e a fase móvel pura. A sua 
resposta é universal, desde que o índice de refração da fase móvel seja diferente do 
índice de refração da substância analisada, mas sua detectabilidade é moderada, da 
ordem de 10​-6​ g. (UFRGS, 2018) 
Já o Cromatógrafo VARIAN, com do tipo UV-Vis, cujo detector é um dos mais 
utilizados em HPLC, pois apresentam o mais baixo custo, aceitam o uso de 
gradiente e geralmente não são afetados por pequenas mudanças de fluxo e 
 
17 
temperatura. Ele consiste em um fotômetro que mede a absorção de luz dos 
compostos, em certo comprimento de onda, compreendido entre as regiões visível e 
ultravioleta. 
O princípio da detecção por UV-vis pode ser definido através da concentração 
do analito relacionada à fração da luz transmitida pela célula do detector pela lei de 
Beer-Lambert. A lâmpada, também chamada de fonte luminosa, pode ser de 
tungstênio, deutério, mercúrio, zinco, cádmio, xenônio ou outros, que será aplicada 
de acordo com a configuração do detector e comprimento de onda desejado. As 
configurações mais comuns dos detectores de UV-vis são: Detector de comprimento 
de onda fixo, detector de comprimento de onda variável e detector de rede de diodos 
(diode array). Este último permite determinar os espectros das substâncias 
presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda durante a 
análise cromatográfica. A detecção por UV-vis é geralmente aplicada em compostos 
cujas moléculas possuam algumas características para a absorção na região de 
UV-vis. 
5.2 
Prática 02: Efeito da Variação de Fluxo e de Comprimento de Onda de 
Detecção na Análise de Amostra de Naftaleno por CLAE. 
A segunda prática efetuada em laboratório destinou-se a analisar as 
consequências da variação de fluxo – vazão da fase móvel – e do comprimento de 
onda na detecção de naftaleno em uma solução de hexano. Na primeira etapa do 
processo, a desgaseificação foi realizada a fim de se eliminar a presença de gases 
dissolvidos, como o O​2 e o N​2​, os quais se encontram em maior quantidade na 
atmosfera. As ondas emitidas pelo degaseificador, com frequência acima de 20.000 
Hz, transporta energia para a fase móvel dentro do recipiente. A agitação molecular 
gerada por toda a extensão do líquido permite que os gases solubilizados sejam 
liberados. Caso continuassem presentes, as bolhas formadas pelo ar afetariam a 
reprodutibilidade do fluxo, assim como a estabilidade da linha de base ao se 
inserirem no detector. Um ruído da linha de base do espectro seria ocasionado caso 
o comprimento de onda utilizado fosse condizente com o que algum desses gases 
absorve. 
 
18 
Após a realização de três análises da amostra de naftaleno 0,001 mol/L 
através da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizando um 
Cromatógrafo Líquido da marca Agilent, com detector por arranjo de diodos 
(UV-Visível), tendo como fase estacionária a sílica ligada ao octadecil e como fase 
móvel o Metanol, obteve-se três cromatogramas apresentados nas figuras a seguir: 
Figura 03:​ Cromatógrafo referente à 1ª corrida da Prática 02. 
 
Figura 04:​ Cromatógrafo referente à 1ª corrida da Prática 02. 
 
19 
Figura 05:​ Cromatógrafo da 3ª corrida, 2ª prática. 
 
 
20 
 
Estas análises foram realizadas efetuando-se algumas alterações nos dados 
do método de análise para fins de comparação entre os resultados obtidos e para 
estudo dos efeitos de alguns aspectos sobre os mesmos. Variou-se então, o valor do 
fluxo (em mL/min) e o valor do comprimento de onda de detecção (em nm), mas 
mantendo-se sempre o volume de amostra injetado constante, o que corroborou em 
diferentes resultados para o tempo de retenção e para a largura de banda, conforme 
pode ser observado na ​Tabela 08​ (p. 13). 
Inicialmente, mantendo-se o fluxo em 1 mL/min, alterou-se o valor do 
comprimento de onda de detecção aumentando-o para 600 nm após a primeira 
corrida, em que a análise foi feita utilizando comprimento de onda de 260 nm. Essa 
 
21 
mudança acarretou em uma variação mínima no tempo de retenção (que passou de 
3,292 a 4,026 min) e na largura de banda (que foi de 0,0564 a 0,0498 min), cujos 
valores finais de ambas as variações podem ser desconsiderados vistoque o 
naftaleno não é detectado no comprimento de onda de 600 nm. 
O naftaleno é um hidrocarboneto aromático composto por dois anéis 
benzênicos unidos, conforme demonstrado na figura abaixo (CARDOSO, 2016). 
Figura 06:​ Estrutura do naftaleno. 
 
A presença de pares de elétrons em conjugação nos anéis está intimamente 
ligada com a absorção. Classificado como um cromóforo, o naftaleno apresenta em 
toda sua estrutura insaturações de ligações covalentes que permitem que a banda 
de absorção apareça na região do visível e UV4. Esta propriedade torna possível a 
reprodutibilidade da análise, desde que seja utilizado o comprimento de onda que 
possibilita a máxima absorção da onda pelo composto. 
O detector utilizado no experimento caracterizava-se por medir a resposta 
analítica através da propriedade das substâncias presentes na amostra em absorver 
ondas no campo do visível e do UV. A medida de leitura, em unidades de 
absorbância – a qual mede, basicamente, a depreciação da luz incidente – é então 
relacionada com o tempo. Neste contexto, se o analito absorve determinado 
comprimento de onda de acordo com sua estrutura, há a formação de um pico no 
gráfico que indica a saída do analito da coluna e sua absorção. Se não há formação 
deste indicativo gráfico, conclui-se que o comprimento de onda utilizado não permite 
 
22 
a máxima leitura de absorbância, tornando o detector não sensível à detecção do 
composto em questão. 
Desta maneira, observando-se os resultados gráficos das corridas 
cromatográficas, é possível observar que a corrida cujo comprimento de onda 
utilizado foi de 600 nm não obteve nenhum sinal analítico sensivelmente observável. 
Figura 07:​ Gráfico do espectro de UV-Visível teórico do naftaleno. 
Analisando-se o gráfico do espectro de UV-Visível teórico do naftaleno acima, 
registram-se os comprimentos de onda onde há altas taxas de absorção: 221 nm, 
275 nm, e 375 nm. Influi-se, então, que a variação do comprimento de onda altera 
significativamente a sensibilidade da técnica, gerando alterações que determinam, 
entre outros fatores, o surgimento de um pico. 
Quanto ao fluxo, pôde ser observado uma relação inversamente proporcional 
entre o seu valor e o tempo de retenção, bem como a largura de banda. No 
experimento, diminuiu-se o fluxo de vazão da fase móvel pela metade, de 1 mL/min 
 
23 
na 1ª corrida, para 0,5 mL/min na 3ª corrida, fazendo com com que o tempo de 
retenção e a largura de banda praticamente dobrassem, indo, respectivamente, de 
3,292 min a 4,559 min e de 0,0564 min a 0,0961 min. 
Sobre a diferença do alargamento da banda entre a corrida 1 (0,05964 min) e 
a corrida 3 (0,0961 min) como consequência da variação do fluxo, é importante 
salientar que a teoria cinética da cromatografia descreve as variáveis que afetam a 
largura de uma banda baseada em mecanismos de caminhos aleatórios, explicando 
assim a migração de moléculas através da coluna cromatográfica. O cromatograma 
típico possui um formato gaussiano e isto pode ser atribuído à combinação aditiva 
dos movimentos aleatórios de milhares de partículas de um soluto ou área de 
camada cromatográfica (NASCIMENTO, 2015). As partículas de um mesmo soluto 
se movimentam de maneira diferente, devido ao fato que uma única molécula do 
soluto durante sua eluição, sofre milhares de transferências de fases entre a fase 
estacionária e a fase móvel (BACCAN, 2010). 
Assim, algumas partículas, de forma individual, caminham rapidamente sob 
inclusão acidental na fase móvel durante a maior parte do tempo, enquanto outras, 
pelo contrário, acabam por ser retardadas já que são incorporadas na fase 
estacionária por um tempo mais longo que a média. A consequência destes 
processos aleatórios individuais é uma distribuição simétrica em torno do valor 
médio, o que representa o comportamento mais comum da partícula. Estes 
processos aleatórios dão origem a largura da banda. 
Segundo Van Deemter, alguns fatores contribuem para o alargamento de um 
pico dentro de uma coluna cromatográfica, como por exemplo: diferentes caminhos 
percorridos pelo soluto dentro da coluna em função de irregularidades no 
empacotamento, difusão molecular do soluto na fase móvel e resistência à 
transferência de massa. Como o movimento da molécula só pode ocorrer quando 
esta se encontra na fase móvel, a largura de uma zona aumenta à medida que ela 
se desloca através da coluna, por que é concedido mais tempo para ocorrer a 
migração (UFJF, 2016). 
 
24 
Dessa forma, com a diminuição do fluxo da fase móvel, o resultado é que com 
uma vazão reduzida haverá mais tempo para ocorrer as transferências do soluto 
entre a fase móvel e a fase estacionária, portanto, há um alargamento da banda na 
saída da coluna e um aumento do tempo de retenção. 
É por este motivo que com a diminuição do fluxo de vazão da fase móvel de 
1mL/min para sua metade, houve um aumento, aproximadamente o dobro, da 
largura da banda, evidenciando-se uma relação inversamente proporcional entre o 
fluxo da fase móvel e a largura de banda. 
Com relação aos tempos de retenção da corrida 01, com vazão de 1 mL/min, 
e da corrida 03, com vazão de 0,5 mL/min, estes mostraram valores 
aproximadamente dobrados (3,292 e 6,559 min), também evidenciando-se uma 
relação inversamente proporcional entre o fluxo da fase móvel e o tempo de 
retenção. 
Esse diferencial, como já foi dito, é consequência dos diversos caminhos que 
as moléculas da amostras podem ter através da coluna, e caracteriza um fenômeno 
conhecido como difusão longitudinal: ocorre a dispersão à medida que a amostra 
perpassa o recheio da coluna, aumentando a largura da faixa. Se o fluxo for muito 
elevado, a difusão tende a ser zero. Entretanto, se o fluxo é muito lento, a difusão é 
relativamente alta. 
5.3 
Prática 03: Efeito do Tipo de Fase Móvel e do Tipo de Eluição na Análise 
de Hidrazonas por CLAE. 
Com o intuito de verificar o efeito da fase móvel e do tipo de eluição na 
análise de hidrazonas foi realizado três análises cromatográficas. Sendo que os 
dados coletados dos cromatogramas constam na ​Tabela 11​. Anteriormente a cada 
análise, as fases móveis foram desgaseificadas e filtradas, como já relatado, para 
evitar contaminações e problemas na corrida. 
Tabela 11: ​Resultados e Observações referentes à Prática 03. 
Análise Tempo de retenção 
(min) 
Largura da banda (min) 
 
25 
1 2.438 0.0887 
2.585 0.0776 
2.690 0.0413 
2.780 0.0524 
2 4.035 0.0710 
4.804 0.0774 
5.673 0.0982 
7.276 0.1353 
 3 3.615 0.0607 
4.055 0.0665 
4.439 0.0672 
4.952 0.0624 
 
Figura 08:​ Análise de hidrazonas, fase móvel ACN. 
 
 
Analisando-se os cromatogramas 3 corridas realizadas é possível perceber 
que, estes são distintos apesar de se tratar da mesma amostra. Na primeira 
corrida, não houve uma separação efetiva dos compostos, ocorrendo uma 
sobreposição entre bandas/picos indicando a ocorrência de coeluição, sendo que, 
em um cromatograma, o ideal é que picos sejam definidos, com bandas não muito 
largas, onde seja perceptível o seu início e fim. Isto levando em consideraçãoque as 
condições de corrida, temperatura, volume de amostra injetado, fase estacionária 
foram as mesmas, contudo, foi utilizado uma mistura de solventes de diferentes 
polaridades, variando-se a porcentagem destes na mistura, aumentando assim a 
 
26 
força cromatográfica da fase móvel nas corridas, o que favoreceu diferentes 
resultados tanto para o tempo de retenção das hidrazonas quanto para a largura de 
banda destas. A resolução baixa no cromatograma pode ser explicado pela 
polaridade das hidrazonas, em relação a fase móvel utilizada. Posto que deve-se 
levar em consideração que as hidrazonas analisadas possuem polaridades 
diferentes, já que estas foram formadas a partir de aldeídos distintos, o formaldeído, 
a acetaldeído, e acroleína e o propaldeído, uma vez que a fase móvel era composta 
apenas pela acetonitrila. Segundo (CHANG) a acetonitrila é um composto que 
possui uma alta constante dielétrica, é um solvente polar aprótico miscível em água 
e as moléculas não interagem fortemente entre si, ao contrário da água, que forma 
uma rede de pontes de hidrogênio, ainda segundo CHANG na acetonitrila pura, vide 
figura (), cada molécula de ACN interage com as duas moléculas mais próximas com 
interação dipolo-dipolo. Assim a baixa resolução, e deformidade nos picos pode ser 
explicada pela pouca afinidade das hidrazonas com a fase móvel, afirmada pelo 
curto tempo de retenção dos mesmos picos, vide tabela 11. 
Figura : Fórmula estrutural da ACN. 
 
 
Abaixo tem-se as fórmulas estruturais dos aldeídos dos quais as hidrazonas 
analisadas são derivadas e o esquema da reação de derivatização dos aldeídos com 
a 2,4-DNPH: 
Figura 09:​ Fórmula estrutural do acetaldeído ​Figura ​: Fórmula Estrutural da acroleína 
 
 
Figura 11​: Fórmula Estrutural do propaldeído. ​Figura 10​: Fórmula Estrutural do formaldeído. 
 
27 
 ​ 
Figura : Reação de um aldeído com a 2, 4-dinitrofenilhidrazina 
 
 
Visto as estruturas destas, pode-se concluir que a que tem uma maior 
polaridade é a que foi derivada do ​X , apesar de todas as moléculas possuírem 
como ligação mais polar da molécula é o C = O, pois a diferença de 
eletronegatividade entre os dois grupos é maior em comparação com as outras 
presentes na molécula, assim o átomo de oxigênio por ser o átomo mais 
eletronegativo, ele provoca o efeito indutivo aumentando a densidade eletrônica em 
torno de si, já que a presença radicais alquila "empurram" os elétrons das ligações 
em direção oposta a eles, consequentemente aumenta-se a densidade eletrônica em 
uma região da molécula, considerando os grupos introduzidos durante a 
derivatização, estes têm o mesmo efeito em todas as moléculas,pode estabilizar a 
molécula por ressonância, ou seja, o que afeta diretamente a polaridade é o efeito 
indutivo dos radicais nas moléculas dos aldeídos. 
A ordem de polaridade do mais polar para o de menor polaridade seria 
respectivamente: propaldeido> acroleína> acetaldeído> formaldeído. 
Na segunda análise o modo de eluição também foi isocrático, sendo a fase 
móvel composta por 60% de ACN e 40% de água. Nesta corrida o tempo percorrido 
como um todo foi o mais longo, os picos estavam mais separados, só que a largura 
das bandas foram maiores, o que não é ideal numa análise por CLAE, pois os picos 
alargados implicam diretamente sobre a resolução cromatográfica, uma vez que a 
 
28 
capacidade de picos da separação torna-se comprometida, isto não foi observado no 
2 cromatograma, mas seria um possível fonte de erro. 
Figura 14:​ Análise de hidrazonas, fase móvel ACN: H2O 6:4, modo de eluição isocrático. 
 
Já na 3 corrida foi utilizado o modo de eluição gradiente, durante os 2 min 
iniciais a corrida foi realizada com 10% de ACN e 90% de ACN:H2O 6:4 neste 
período não foi emitido nenhum sinal no detector como consta no na figura ​X ​o 
cromatograma. Quando se passou os dois minutos a composição da fase móvel foi 
alterada para 50% ACN e 50% ACN:H2O 6:4, foi a partir desta mudança que picos 
começam a se formar no cromatograma. Quando comparado este com os outros 2 
cromatogramas, observa-se que o 3 houve uma rápida eluição acompanhando de 
uma boa resolução. Nesta análise os tempos de retenção foram maiores quando 
comparado com a primeira corrida, quanto a segunda deve-se observar cada 
hidrazona separadamente, já que a uma variação entre as proximidades dos picos, 
pode-se inferir isto a polaridade de cada hidrazona. 
Figura 15:​ Análise de hidrazonas, fase móvel ACN: H2O , modo de eluição. gradiente 
 
 
5.4 
 
29 
Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, com 04 
pontos por CLAE. 
Tabela 12: ​Resultados e Observações referentes à Prática 05​. 
Padrões Área do Pico do 
Naftaleno 
Área média 
01 
(0,0012 mol/L) 
 3,224 
3,225 
02 
(0,0016 mol/L) 
 3,225 
 3,225 
03 
(0,0020 mol/L) 
3,226 
 3,226 
04 
(0,0024 mol/L) 
 3,227 
 3,228 
Amostra 
Desconhecida 
 2,230 
 3,231 
A construção da curva de calibração se dá numa relação entre a quantidade 
do analito e o sinal observado. Ao construí-la com concentrações de soluções 
previamente conhecidas, através da equação da reta obtida poderá ser calculado a 
concentração da amostra desconhecida. 
A análise quantitativa na CLAE é baseada na formação dos picos do 
cromatograma, as bandas cromatográficas, que têm suas áreas relacionadas 
diretamente com a concentração do analito (naftaleno). 
Isso quer dizer que quanto mais concentrado for um composto, mais ele será 
detectado, ou seja, maior será seu pico. Assim, faz-se uma relação gráfica linear 
entre a concentração (x) e a área do pico (y). 
A proposta deste experimento foi a construção da curva de calibração do 
naftaleno com 4 pontos de concentração pré-estabelecidos por CLAE e a estimação 
 
30 
da concentração de uma amostra desconhecida a partir da equação da curva de 
calibração obtida. 
Nessa análise cromatográfica foi utilizado: 
Fase estacionária:​ Sílica. 
Fase móvel:​ Metanol. 
Analito:​ Naftaleno dissolvido em Hexano. 
Então, foram preparados 4 soluções de concentrações conhecidas, através 
da diluição de uma de 0,04 mol/L. Em cada solução, a análise foi realizada em 
duplicatas (devido ao tempo disponível não foi possível realizar as triplicatas que 
assegurariam mais confiabilidade ao resultado). 
Os resultados referentes aos picos dessa prática encontram-se na Tabela 12, 
enquanto algumas especificações aplicadas no software situam-se na tabela abaixo. 
Tabela 13: ​Especificações dadas à corrida cromatográfica 
Fluxo (mL/min) 1 
Comprimento de onda (nm) 260 
Volume injetado (​µL) 10 
 
A partir dos resultados construiu-se um gráfico de dispersão, adicionando 
uma regressão linear para conhecimento da equação e da correlação entre eles. 
Tendo como X = concentração do naftaleno e Y = área do pico, o resultado foi: 
 
 
31 
Utilizando-se a equação t = 1853,3X + 27,698 a média para a altura do pico para a 
amostra X, pode-se calcular a concentração desta amostra, conforme expresso em : 
5208,96582 = 1853,3X + 27,698; X=5181,26782/1853,3 = 2,79 mol/L 
Dessa forma, a concentração em mol/L da amostra x é 2,79 mol/L. 
Já o R​2 ​é o coeficiente de relação linear, ou seja, o que indica quanto o eixo Y se 
relaciona com o eixo X. O valor obtido foi um valor próximo do ideal, 0,9972, o que 
significa que os dados possuem uma relação ótima entre si (99,72%). 
 
 
 
 
 
32 
6. CONCLUSÃO 
 
Com a realização dos experimentos, seguido de posterior confecção deste 
relatório técnico-científico, foi possível conhecer o funcionamento prático e teórico da 
aparelhagem completa do Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência, baseando-se na 
identificação funcional de cada parte de seu sistema, como os módulos de bomba, a 
coluna analítica e o detector. Os cuidados relacionados à utilização de cada uma 
destas partes, foram também, de suma importância, pois aprendeu-se acerca de 
fatores importantes como conservação da coluna e sobre se obter uma 
reprodutibilidade de resultados. 
Mais especificamente, na prática 02, com base em análises de perfis 
cromatográficos, pôde-se avaliar a influência da variação de fluxo e de comprimento 
de onda em análises de amostra de naftaleno, observando-se e discutindo-se as 
diferenças dos tempos de retenção e de largura de banda em cada método utilizado 
no experimento. 
O cromatograma obtido experimentalmente permite também discorrer acerca 
da pureza do naftaleno. Não foi notório nenhum pico além do que indicava a 
presença do naftaleno, o que permite afirmar que o reagente se encontrava com um 
baixo índice de impureza. 
Pode-se concluir por meio dos dados coletados e das análises realizadas, que 
a escolha da fase móvel é de suma importância para que se obtenha bons 
resultados nos cromatogramas, e vinculado ao tipo de eluição utilizado, pode-se 
otimizar o processo e obter boas respostas no sistema de cromatografia líquida de 
alta eficiência, como foi observado na combinação da fase móvel na 3 corrida que foi 
do tipo gradiente; otimizando então, os dados e o processo. 
Prática 05: Construção de Curva de Calibração do Naftaleno, com 05 
pontos por CLAE 
Em resumo, pôde-se concluir que a cromatografia líquida de alta eficiência é 
uma técnica bastante versátil e prática, com necessidade, no entanto, de um 
 
33 
conhecimento prévio de utilização. Os resultados obtidos são tanto qualitativos 
quanto quantitativos, o que a viabiliza na investigação de amostras desconhecidas e 
na quantificação de determinados compostos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
7. REFERÊNCIAS 
● UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do SUl. ​Cromatógrafo de 
DAD. ​Disponível em: 
<https://www.enq.ufrgs.br/labs/central-analitica/cromatografo-liquido-de-alta-ef
iciencia-ii>. Acesso em 04 de Agosto de 2018, às 10:37 horas. 
● CARDOSO, Mayara. Infoescola. ​Naftaleno. Disponível em: 
<https://www.infoescola.com/compostos-quimicos/naftalina/>. Acesso em 04 
de Agosto de 2018, às 11:00 horas. 
● NASCIMENTO. Cromatografia Líquida: Aspectos Teóricos e Práticos. 
Disponível em: 
<https://pt.scribd.com/document/310433927/Livro-Cromatografia-Gasosa-Asp
ectos-Teoricos-e-Praticos-2>. Acesso em 04 de Agosto de 2018, às 11:29 
horas. 
● BACCAN (pdf). Univerdade Federal de Juíz de Fora. ​Cromatografia Líquida. 
Disponível em: 
<http://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-7-Cromatografia-gasosa_02-02-
15.pdf>. Acesso em 04 de Agosto de 2018, às 11:50 horas. 
● UFJF - Universidade Federal de Juíz de Fora. ​Introdução a Métodos 
Cromatográficos. Disponível em: 
<http://www.ufjf.br/quimica/files/2016/08/Introdução-a-cromatografia-Marcone-
2016.pdf>. Acesso em 04 de Agosto de 2018, às 12:36 horas. 
● GUIMARÃES, D. G.; GONÇALVES, A. A; ROLIM, L. A. ARAÚJO, C. R. M. 
Investigação do Potencial Biológico de Hidrazonas Obtidas 
Sinteticamente na Última Década (2006-2016): Uma Revisão Sistemática. 
Revisão Virtual Química, 2017. 
● COLLINS, C. H., BRAGA, G .L., BONATO, P.S. ​Fundamentos de 
Cromatografia.​ 2ª edição, São Paulo: Unicamp. 
● ESTUDO DE SISTEMAS MICELARES DE ÁGUA/ACETONITRILA. 
Disponível em < 
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46132/tde-25092014-155309/pub
lico/Chang_Yihwa_Mestrado.pdf>. Acesso em 03 de agosto de 2018.