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Gênero Staphylococcus spp Prof. Marcos JP Gomes ATUALIDADES Atualmente (2013), na List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, organizada pelo pesquisador J.P. Euzéby há citação de 47 espécies e 24 subespécies incluídas no gênero Staphylococcus spp, conforme o site: www.bacterio.cict.fr/s/staphylococcus.html Staphylococcus agnetis (Taponen et al. 2012) e Staphylococcus stepanovicii (Hauschild et al. 2012) S. arlettae S. aureus S. aureus subsp aureus S. aureus subsp anaerobius S. auricularis S. capitis S. capitis subsp capitis S. capitis subsp urealyticus S. caprae S. carnosus S. carnosus subsp carnosus S. carnosus subsp utilis S. caseolyticus S. chromogenes S. cohnii S. cohnii subsp cohnii S. condimenti S. delphini S. epidermidis S. equorum S. equorum subsp equorum S. equorum subsp linens S. felis S. fleurettii S. gallinarum S. haemolyticus S. hominis S. hominis subsp hominis S. hominis subsp novobiosepticus S. hyicus S. hyicus subsp chromogenes S. hyicus subsp hyicus S. intermedius S. kloosii S. lentus S. lugdunensis S. lutrae S. microti S. muscae S. nepalensis S. pasteuri S. pettenkoferi S. piscifermentans S. pseudintermedius S. pulvereri S. saccharolyticus S. saprophyticus S. saprophyticus subsp bovis S. saprophyticus subsp saprophyticus S. schleiferi S. schleiferi subsp coagulans S. schleiferi subsp schleiferi S. sciuri S. sciuri subsp carnaticus S. sciuri subsp lentus---------------- -------------------> S. lentus S. sciuri subsp rodentium S. sciuri subsp sciuri S. simiae S. simulans S. succinus S. succinus subsp casei S. succinus subsp succinus S. vitulinus S. warneri S. xylosus HISTÓRICO Em 1878, o estafilococo foi isolado e descrito, pela primeira vez, por Robert Koch, de um ferimento purulento. Em 1880, o médico escocês Alexander Ogston adotou o nome do gênero da palavra grega staphylo que significa cacho de uvas. Pasteur o multiplicou em meio de cultivo líquido e Ogstron evidenciou sua patogenicidade para cobaias e camundongos. Em 1884, Rosenbach admitiu duas espécies que as chamou de “aureus” e “albus”, relacionando a presença de pigmentos. Nocard, em 1887, isolou um estafilococo de um caso de mastite ovina. Guillebeau, em 1890, sugeriu que este organismo era responsável pela mastite em vacas (Guerreiro, 1984). GENERALIDADES O ADN dos estafilococos possui um percentual de citosina e guanina (C+G) de 30-39 mol%. Outros critérios genéticos para incluir uma espécie desconhecida ao gênero Staphylococcus estão baseadas na árvore filogenética construída pela comparação das sequencias do 16S ARNr e 23S ARNr. São células esféricas com 0,5 - 1,5 μm de diâmetro; apresentação em arranjos individuais, aos pares e em agrupamentos irregulares. São Gram positivos; imóveis; não esporulados; aeróbios ou anaeróbios facultativos; quimiorganotróficos com metabolismo respiratório e fermentativo. As colônias são geralmente opacas, podendo variar sua coloração (branca, creme, amarela ou laranja); geralmente catalase positiva com citocromo presente, mas geralmente oxidase negativa. O teste de nitrato é geralmente reduzido a nitrito. Suscetível à lise pelo lisostafina, mas não à lisozima; geralmente são halotolerantes (crescem a 10% de sal). A temperatura ótima varia entre 30ºC a 37ºC. Estão distribuídos, principalmente na pele e mucosas de vertebrados de sangue quente, mas isolados de produtos alimentares, pó e água. Algumas espécies são patógenos oportunistas nos animais e no homem, onde produzem toxinas extracelulares. Os estafilococos são organismos esféricos e de tamanho geralmente uniforme (0,8 m). No pus, se apresentam sob a forma de massas agrupadas irregulares, lembrando a forma de cachos de uva. A espécie aureus é a espécie típica e principal patógeno dentre as espécies do gênero. A capacidade em produzir coagulase classifica as espécies em dois grupos: os estafilococos coagulase positivos (ECP), incluindo as espécies: S. aureus subsp aureus; S. aureus subsp anaerobius; S. hyicus; S. lutrae; S. intermedius; S. pseudintermedius; S. schleiferi subsp coagulans e S. delphini e os estafilococos coagulase negativos (ECN), incluindo todas as demais espécies. A espécie S. hyicus é variavelmente coagulase positiva e, frequentemente incluída como coagulase negativa. Podem apresentar cápsula de polissacarídeos em amostras clínicas. São coráveis pelos corantes comuns quando recentemente isolados. São Gram positivos. Cultivos velhos podem perder a habilidade de reter o Gram. As principais espécies do gênero Staphylococcus e as principais enfermidades animais estão mostradas nos quadros 1 e 2. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS E RESISTÊNCIA As colônias dos estafilos podem apresentar diversas colorações, isto é, elas podem variar desde a coloração branca porcelana até a coloração laranja, quando cultivadas em meio sólido. O pigmento carotenóide pode ser visualizado, em meios que contenham amido ou ácido graxo. As colônias crescem (1 a 3 mm) no Agar - sangue, após 18 horas. Os estafilococos estão entre os microrganismos não esporulados mais resistentes. Resistem à dessecação; são resistentes ao calor e toleram os desinfetantes comuns melhor que a maioria das bactérias. TIPAGEM DOS ESTAFILOS A fagotipagem dos estafilos é aplicada na epidemiologia das infecções humanas. Existe mais de 22 fagos, distribuídos em quatro grupos (I, II, III e IV) e quatro grupos não classificados. A maioria das amostras humanas é lisadas por um único grupo. Algumas amostras de bovinos e de outras espécies, geralmente não podem ser “tipadas”, segundo os critérios utilizados no esquema desenvolvido para as linhagens humanas. Cepas de animais possuem um grau de adaptação ao hospedeiro. Quadro 1. Associação dos ECP, Hospedeiros e Enfermidades Principais. Espécies coagulase + Hospedeiro Enfermidade Principal S. aureus subsp aureus Bovinos Mastites, lesões supurativas. S. aureus subsp anaerobius Ovinos Mastites, piemia. Suínos Lesões supurativas Eqüinos Botriomicose, artrites, mastites. Caninos Piodermites, infecções urinárias e Discoespondilites Aves Lesões de pele, artrites, Bumblefoot S. pseudintermedius Caninos Otite externa, piodermites, Lesões supurativas. Eqüinos Lesões supurativas S. intermedius Aves Abscessos e artrites S. schleiferi subsp coagulans Caninos Otite externa S. delphini Golfinhos Lesões supurativas de pele S. hyicus Suínos Epidermite exsudativa S. lutrae Lontras Fígado, Baço, Glândula Mamária. * Os estafilos do grupo intermedius (EGI) compreende as espécies S. intermedius; S. pseudintermedius e S. delphini, pois não é possível distingui-los claramente. Quadro 2. Associação dos ECN, Hospedeiros e Enfermidades Principais. Espécies coagulase (-) Hospedeiros Enfermidades Principais S. hyicus Suínos Epidermite exsudativa Bovinos Mastites Aves Lesões supurativas S. chromogenes Bovinos Mastites S. simulans Bovinos Mastites S. xylosus Bovinos Mastites S. epidermidisBovinos Mastites S. cohnii Bovinos Mastites S. sciuri Bovinos Mastites Ovinos, caprinos Mastites Eqüinos Mastites S. gallinarum Aves, bovinos Lesões supurativas de pele. S. lentus Suínos, ovinos Lesões supurativas de pele. Caprinos aves Lesões supurativas de pele S. equorum Eqüinos Infecções do trato genital S. haemolyticus Bovinos Mastites S. warneri Bovinos Mastites S. felis Felinos Otite externa Staphylococcus aureus Prof. Marcos Gomes Foliculites, Furúnculo, Impetigo. INTRODUÇÃO A espécie foi chamada de aureus pela coloração da colônia (amarelo-ouro), entretanto algumas colônias não são pigmentadas ou perderam esta característica, durante os sucessivos subcultivos. FATORES DE VIRULÊNCIA O S. aureus e outros estafilococos coagulase positivos (ECP) produzem muitas proteínas extracelulares associadas às células do hospedeiro. Essas proteínas são importantes na colonização e no crescimento dos estafilos nos vários tecidos. A presença desses organismos e seus produtos extracelulares sobre as superfícies demonstram como estes agentes estabelecem infecções. Muitas toxinas citolíticas (hemolisinas); enzimas (proteases, lipases, hialuronidases) se associam para causar lesão tecidual, fornecendo nutrientes de baixo peso molecular que são assimilados e utilizados para o seu desenvolvimento. A doença resulta de um fenômeno complexo entre as várias proteínas de superfície envolvidas na colonização celular, enzimas, toxinas e o ambiente extracelular. Nenhum fator de virulência sozinho é responsável pela superação da resposta do hospedeiro, exceto no caso da toxina exfoliativa e da toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1) em que o produto bacteriano é responsável primário pelos sinais da doença. Entretanto, certas hemolisinas e enzimas contribuem com o processo da doença. Além disso, mutantes podem perder mais de um fator de virulência (alfa toxina e coagulase). Os fatores de virulência são visualizados no quadro 1 abaixo. Quadro I. Determinantes de Virulência do S. aureus. Determinantes Ação Tecidos do Hospedeiro ______________________________________________________________________________________________ 1. Polissacarídeo capsular Antifagocítica 2. Composição da parede celular Peptidoglicano Piogênico, quimioatrativo. Ácido teicóico Liberado, pode proteger contra o Complemento 3. Proteínas da superfície celular Proteína A Interage com a região Fc da IgG Proteína de ligação ao fibrinogênio Liga-se ao fibrinogênio Proteína de ligação à fibrinonectina Liga-se à fibrinonectina Proteína de ligação à laminina Liga-se à laminina Proteína de ligação ao colágeno Liga-se ao colágeno Proteína de ligação à vitronectina Liga-se à vitronectina 4. Toxinas extracelulares Alfa, Beta, Gama e Delta toxinas Citotóxica para tecidos e leucócitos. Leucocidina P-V Destrói leucócitos (leucocida) Toxina da Síndrome do Choque Tóxico (TSCT) Liga-se às moléculas do MHC da classe ll induz síntese de citocinas causando múltiplas disfunções orgânicas Enterotoxinas Emética e diarréia Toxina Epidermolítica Lisa a ligação da célula com estrato granuloso 5. Enzimas Coagulase Catalisa a conversão de fibrinogênio em fibrina Lipase Degrada os lipídios Enzima Modificadora de Ácidos Graxos Modifica ácidos graxos liberados na degradação lipídica e Contribuí com a formação de Abscessos. Proteases Degrada proteínas, incluindo proteínas de defesa hospedeiro. Fosfolipases Degrada fosfolipídios Estafiloquinase Converte plasminogênio plasmina fibrinolítica Hialuronidase Degrada o ácido hialurônico Nuclease Cliva tanto o DNA quanto o RNA 1. Superfície Celular 11. Peptidoglicano O principal, polímero da parede celular do S. aureus e dos ECN é o peptidoglicano (glicopeptídeo ou mureína). Este polímero é liberado em grandes quantidades no local da infecção (pele, abscesso muscular e articulações). O peptidoglicano estimula a produção endógena de pirógenos e quimiotaxia para os leucócitos. 12. Cápsula de polissacarídeo A cápsula do S. aureus tem sido classificada em muitos imunotipos. A produção de cápsula verdadeira pode ser visualizada pela microscopia, após a coloração com tinta Nankin ou da Índia. Ela é rara entre as linhagens do S. aureus, tanto do homem quanto dos animais. Macrocápsula produzida pela linhagem do sorotipo 1 impede a opsonização e fagocitose, estando associadas à virulência. Uma fina microcápsula de polissacarídeo é produzida pela maioria das amostras isoladas de S. aureus. A maioria delas produz o sorotipo 5 ou 8. Estas linhagens tendem a resistir à fagocitose em estudos “in vitro”. O papel da cápsula sobre a virulência parece variar, conforme o tipo de infecção investigada. Cepas mutantes do S. aureus que perderam a habilidade de produzir cápsula mostram uma perda da virulência no quadro da mastite bovina. Por outro lado, mutantes (defectivos) quanto à produção de microcápsula, não mostraram diferenças entre as amostras capsuladas. As amostras mutantes (cápsula negativas) são 50% menos eficazes na produção de endocardite experimental induzida por cateterismo, em ratos. 13. Ácidos Teicóicos Esses ácidos são fosfatos de poliribitol e poliglicerol que estão, tanto associados ao peptidoglicano quanto extracelularmente. Os anticorpos aos ácidos teicóicos estão presentes no soro de animais hígidos (normais); ácidos teicóicos extracelulares protege os organismos da opsonização pela ativação do complemento e reduz os componentes necessários à interação com as bactérias. 2. Proteínas de Ligação 21. Proteína A A proteína A é a principal proteína de ligação à imunoglobulina. Ela está presente em mais de 98% das amostras de origem animal e do homem. A proteína A liga-se à porção Fc das IgGs (IgG1, IgG2 e IgG4), inibindo a opsonização e fagocitose. Estudos com amostras não produtoras de proteína A resultaram numa redução da virulência na infecção subcutânea e intraperitoneal, mas não houve diferenças nas mastites. 22. Proteínas de Ligação à Fibrinonectina (Fn-binding Proteins) As fibrinonectinas estão presentes na maioria das amostras do S. aureus. Os estudos sobre a ligação da fibrinonectina às proteínas tissulares e soro induzem uma proteína do hospedeiro que inibe a fagocitose. Recentemente, foi demonstrado que o pré-tratamento com anticorpo à fibrinonectina estimulou a fagocitose. 23. Proteínas de Ligação ao Fibrinogênio A maioria dos S. aureus, assim como S. pseudintermedius e, possivelmente o S. hyicus, aglutina o fibrinogênio extraído de animais e do homem. Há, pelo menos, três proteínas de superfície já identificadas, sendo provável que o número de proteínas de ligação ao fibrinogênio aumente. É provável que as linhagens de origem animal ou humana possuam diferentes proteínas de ligação, visto que têm sido observadas diferenças entre os S. aureus de vários hospedeiros. Parece lógico definir as enzimas estafilocócicas que promovem a coagulação sanguínea como as coagulases e aquelas que ativam a dissolução do coágulo sanguíneo como estafiloquinases. 24. Outras Proteínas de Ligação Proteína de ligação ao colágeno e à vitronectinasão duas proteínas de ligação dos estafilococos à matriz extracelular que tem sido recentemente descrita; identificada; purificada e caracterizada. Essas proteínas de ligação foram detectadas no S. aureus e, em várias linhagens de ECN; são patogênicas para o úbere bovino e para o homem. Alem disso, outras estruturas de ligação ao plasminogênio, à tromboespondina e à laminina foram caracterizadas por diferentes laboratórios, mas o seu papel na adesão tissular ainda não foi bem esclarecido. 25. Fatores de Virulência pouco Definidos Produção de muco por espécies coagulase negativas (ECN), especialmente isoladas de infecções causadas pelo S. epidermidis. Após o crescimento, a bactéria produz grandes quantidades de muco que são predominantemente polissacarídeos extracelulares e pouco definidos quimicamente, incluindo vários açúcares, tais como, ácido manurônico e o ácido galacurônico. O muco dos ECN cresce sobre a superfície de instrumentos intramamários, equipamentos de ordenha e cateteres; tornam-se misturados as proteínas do hospedeiro, formando um biofilme amorfo. Biofilme e infecções associadas a este material são difíceis de tratar pela fraca penetração dos ATMs que, geralmente ligam-se ao polímero do biofilme. Alem disso, os fagócitos não podem penetrar com eficiência no biofilme. Assim o agente fica protegido. Além disso, o muco mostrou propriedades imunossupressoras quando inoculadas em animais. 26. Regulação do Ferro e Crescimento “in vivo” O S. aureus, S. epidermidis e outros ECN crescidos “in vivo” mostraram uma grande diferença na produção de proteínas de superfície, quando comparadas com a mesma cepa, crescida em meio convencional de laboratório. Os estafilococos crescidos em meios sintético “in vitro” suplementados com fluido peritonial, leite bovino ou frações do leite, tais como lactoferrina, sugeriram que os íons ferrosos (Fe++) e, possivelmente outros cátions divalentes podem estar envolvidos na regulação de genes às várias proteínas de superfície, bem como proteínas extracelulares e intracelulares. 3. Toxinas Extracelulares e Enzimas 31. Toxina α (Alfa) A toxina mais caracterizada é a toxina α (α hemolisina), uma proteína de 34kDa, produzida pela maioria das amostras de S. aureus. Conhecida como α hemolisina, ela lisa hemácias de algumas espécies animais. A toxina α liga-se a membrana da célula alvo (plaquetas e mastócitos), induzindo a formação de poros na membrana. A célula perde íons rapidamente quando lisada. A morte das células alvo pela toxina formadora de poros promove a liberação de prostaglandina e outros mediadores de inflamação. Há evidências que a α toxina altera a função do macrófago, promovendo lesão tecidual no local do abscesso. A toxina α é dermonecrótica, após a inoculação na derme de coelhos e de outros animais. Alem disso possui uma poderosa ação sobre a musculatura lisa dos vasos. A inoculação de pequenas quantidades da toxina α no úbere de caprinos e ovinos resulta em necrose tecidual. A α toxina detoxicada (α toxóide) induz uma proteção parcial contra mastite por S. aureus em caprinos, ovinos e no modelo experimental da mastite, em coelhos. Alguns fatores de virulência estão descritos no Quadro I, abaixo. 32. Toxina β (Beta) A toxina β induz a clássica “hot cold hemolysis” nas hemácias de ovinos pela degradação da esfingomielina da membrana. A toxina β é uma enzima tóxica, denominada de esfingomielinase. A susceptibilidade das células às diferentes espécies animais depende da quantidade de esfingomielina da membrana celular. Esta enzima tóxica age sinergicamente com outras toxinas e enzimas destruidoras da membrana, permitindo a degradação tecidual. Amostras isoladas de bovinos produzem toxina β, mas dificilmente as linhagens humanas. A β toxina parece ter uma participação particular na mastite, pois a toxina aumenta o crescimento bacteriano na glândula mamária. O toxóide beta produziu alguma proteção contra a mastite experimental em coelhos. 33. Toxina γ (Gama) Recentemente, a toxina γ tem sido estudada em detalhes e sua importância nas infecções animais não tem sido muito explorada. A toxina é composta de duas proteínas, uma delas é uma protease que pode estar encoberta por estruturas de ligação à membrana celular específica para o segundo componente. 34. Toxina δ (Delta) A toxina δ comporta-se como um detergente, produzindo lesão em todas as células do hospedeiro. Entretanto, os lipídios da pele podem rapidamente ligar-se e neutralizar a toxina delta, especialmente em coelhos e camundongos inoculados experimentalmente. 35. Leucocidina Um pequeno número de S. aureus produz leucocidina (Panton-Valentine leukocidin) que é composta de duas proteínas chamadas de F (Fast) e S (Slow), tendo com base a sua mobilidade eletroforética em agarose. A toxina liga-se aos polimorfonucleares (PMN) e, os destrói, após rápida desgranulação. Há evidência de que linhagens bovinas do S. aureus produzem uma leucocidina que é tóxica para PMN de bovinos, porém bem menos tóxica para PMN do homem. 36. Toxina da Síndrome do Choque Tóxico 1 (TSCT-1) e 37. Enterotoxinas estafilocócicas (EEs) A Síndrome do Choque Tóxico (SCT) é uma doença sistêmica causada por toxinas do S. aureus e descrita, pela primeira vez, em 1978, por Todd e colaboradores. Ela é uma proteína estafilocócica originalmente conhecida como enterotoxina F e uma exotoxina C pirogênica. Mais tarde, ela foi denominada de SCT-1, por Bergdoll e colaboradores, em 1981. Algumas linhagens do S. aureus produzem uma proteína de 22 kDa denominada em inglês de “Toxic Shock Syndrome Toxin” (TSST) ou toxina da síndrome do choque tóxico (TSCT); pode ser absorvida pelas mucosas, através da circulação, assim como as endotoxinas das bactérias Gram negativas. A TSST-1 pertence à superfamília das enterotoxinas estafilocócicas e toxinas eritrogênicas dos estreptococos do grupo A. O S. aureus secretam enterotoxinas/enterotoxina like toxina e a toxina TSS (TSST-1), que possuem ou podem possuir atividade de superantígeno (SAg). O termo superantígeno foi denominado, em 1989, por John Kappler, para descrever a propriedade de estimular um grande número de células T. Estudos com enterotoxinas estafilocócicas (EEs), exotoxinas pirogenicas estreptocócicas (EPEs) e TSCT comprovaram que estas exotoxinas compartilhavam duas funções comuns, incluindo habilidade de ligar-se como molécula completa diretamente ao MHC classe II e também aos receptores da cadeia β das células T, fora da interface de ligação normal ao antígeno (Ortega et al. 2010). Esses superantígenos estimulam inespecificamente às células T sem o reconhecimento antigênico normal. Os SAgs ligam-se diretamente à região da porção variável dos receptores beta das células T com moléculas da classe II do principal complexo de histocompatibilidade (MHC), resultando numa forte estimulação de células T, que responde com a proliferação exagerada e liberação maciça de citoquinas. Estas toxinas ligam-se às regiões conservadas do complexo de histocompatibilidade da classe II da célula do hospedeiro, induzindo uma superprodução de linfocinas, resultando em lesão tecidual. Os superantígenos ativam 20-30% de todas as células T enquanto que os antígenos convencionais somente estimulam aproximadamente 0,001% das células T. Assim, a liberação de quantidades maciças de citocinas desencadeia os sinais da SCT (Grumann et al. 2008; Fraser et al. 2000). Estas toxinas liberaram o fator de necrose tumoral ou “Tumor Necrosis Factor” (TNF) e outras citocinas que induzem o choque cardiovascular associado com a formação de microtrombos nos capilares.Alem disso, as células ligadas às toxinas são destruídas pelas células T. O papel destas toxinas ou dos superantígenos nas infecções animais (mastite bovina) é limitada. As linhagens bovinas do S. aureus que produzem TSST-1 são idênticas às TSST-1 do homem. As cepas dos ovinos e caprinos produzem uma variante com massa molecular e antigenicidade semelhante, mas com diferente ponto isoelétrico. Outras enterotoxinas estafilocócicas (EEA-EEE e EEG-EEJ) e enterotoxinas estafilocócicas “like toxins” (EElK–EElR e EElU) foram identificadas no S. aureus. As doenças causadas por estas toxinas tem importância no homem, mas também descritas em bovinos, caprinos e ovinos (Ho et al. 1989). Nos cães, as enterotoxinas produzidas pelo S. pseudintermedius foram descritas, especialmente a enterotoxina estafilocócica tipo C canina (EECcanina) a qual foi caracterizada biologicamente, imunologicamente e molecularmente (Edwards et al. 1997). As enterotoxinas causam diarreia e vômito quando ingeridas e responsáveis pelo quadro de intoxicação alimentar. As enterotoxinas podem também causar SCT se alcançar a corrente circulatória. A SCT pode ocorrer como sequela de qualquer infecção estafilocócica se a enterotoxina ou TSCT-1 for liberada sistemicamente ou se o hospedeiro perdeu a capacidade de produzir anticorpos neutralizantes. Valle e colaboradores em 1991 estudaram a produção da TSCT-1 em amostras isoladas de diferentes regiões corporais de 133 caprinos saudáveis, detectando a presença de anticorpos para esta toxina no soro e leite, através do ensaio imunoenzimatico (ELISA). Das 342 cepas de estafilo, 86 (25,2%) eram produtoras de TSCT-1. Os anticorpos para TSCT-1 foram detectados no soro de 57 (42,9 %) dos animais e em 63 (47,4%) das amostras de leite, sugerindo que os caprinos estão em contato com cepas produtoras da TSCT-1, a mesma responsável pela doença no homem. Os estudos focados na produção de enterotoxinas pelas linhagens de ECN de origem animal são raros (Nemati et al. 2008). Valle et al. (1990) identificaram a produção de enterotoxinas estafilocócicas (EEs) em ECNs. As EEs foram produzidas por 70 (75%) das cepas de ECPs e por 22% das linhagens ECNs. Algumas espécies ECNs como S. chromogenes, S. warneri, S. sciuri, S. saprophyticus e S. lentus produziram EEs identificadas como SEA, SEB, SEC, e SEE, no grupo de ECN, isolados do leite de caprinos sugeriram que os caprinos são importantes reservatórios de estafilos enterotoxigênicos. Outros pesquisadores descreveram a presença de enterotoxinas nos ECN (Orden et al 1992; Cunha et al 2006; Cunha et al 2007). As lesões causadas pelo ECNs e sua persistência no úbere pode ser provocada pela produção de exotoxinas. Algumas linhagens isoladas de ovinos, caprinos e bovinos com mastite produziram a TSCT-1 e enterotoxina estafilocócica (Orden et al 1992). Entretanto investigações mais profundas, incluindo o numero total de enterotoxinas e os genes dos superantígenos nas linhagens de ECN isolados do úbere não foram relatadas. Nemati e colaboradores, em 2012, testaram e detectaram, através da PCR, a presença de 20 exotoxinas, dentre 102 cepas de 10 diferentes espécies de ECNs isoladas de casos de mastite clinica e subclinica. Os autores analisaram a presença de genes que codificam a presença de enterotoxinas/enterotoxin-like toxins (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, selk, sell, selm, seln, selo, selp, selq and selu); a TSCT-1 e a toxina exfoliativa A e B (TEA e TEB). Nenhuma sequência foi ampliada para o superantígeno nas amostras testadas de ECNs, indicando que não foram envolvidos das mastites. Os sinais/sintomas da Síndrome do Choque Tóxico (SCT) variam dependendo da origem. A SCT-1 resulta da infecção com o S. aureus, que pode ser caracterizada por febre alta acompanhada de pressão arterial baixa, fraqueza, confusão mental que rapidamente progride para estupor, coma e falência de múltiplos órgãos. A lesão de rash cutâneo é frequentemente observada no início do curso da doença, parecendo queimadura solar, mas pode envolver qualquer região do corpo, incluindo lábios, boca, olhos, palma e sola dos pés. O rash cutâneo evolui para descamação e este processo pode durar 10-14 dias, em pacientes que superam a fase inicial da infecção. A infecção pelo estreptococo apresenta menor rash cutâneo do que o apresentado pelo S. aureus. A primeira caracterização da enterotoxina estafilocócica A (SEA) e da enterotoxina estafilocócica B (SEB) foi realizada por Casman (1959) e Bergdoll (1960). Posteriormente, foram detectadas outras espécies de estafilococos, produzindo enterotoxinas relacionadas às proteínas responsáveis às muitas doenças, incluindo a SCT, septicemia e intoxicação alimentar. Há 23 diferentes tipos de enterotoxinas identificadas além da TSCT-1, distribuídas entre 5 grupos filogenéticos (Vasconcelos e Cunha, 2010). As enterotoxinas foram descritas e designadas de SEA até SEV em ordem cronológica a sua descoberta. Algumas delas foram renomeadas como “SE like toxins”, pois não causavam vômito nem foram testadas em modelos experimentais. As Enterotoxinas estafilocócicas são enterotoxinas proteicas de cadeia única e baixo peso molecular (27.000-34.000D). São produzidas por espécies de estafilococos, principalmente o S. aureus, S. intermedius, S. hyicus, S. xylosus e S. epidermidis. As enterotoxinas são produzidas em torno de 30% das linhagens do S. aureus, isoladas de várias infecções humanas, provenientes de alimentos contaminados. Há muitos tipos antigênicos destacando-se seis tipos principais de enterotoxinas (A, B, C1, C2, D e E). As toxinas são semelhantes na estrutura protéica; são termoestáveis, resistindo a 100º C por minutos. PATOGENIA A toxina preformada nos alimentos quando ingerida, microgramas (μg) da toxina pode causar náusea, vômito e diarreia (todos os sinais de intoxicação alimentar por estafilococos, no homem). O nome da doença aguda é intoxicação alimentar estafilocócica ou estafiloenterotoxicose ou estafiloenterotoxemia. Inicialmente, os sinais são súbitos e agudos, dependendo da suscetibilidade individual à toxina; da quantidade alimento ingerido com a toxina; da quantidade da toxina presente no alimento ingerido e na saúde geral do individuo. Os sinais mais comuns incluem: náusea, vômito, cólica abdominal e prostração. Alguns indivíduos podem não demonstrar todos os sinais associados à doença. Em casos mais graves podem ocorrer: dor de cabeça, dores musculares e alterações transitórias da pressão arterial e frequência cardíaca. A recuperação, geralmente leva de 2-3 dias, exceto nos casos mais graves. A dose capaz de produzir sinais de intoxicação estafilocócica é menor que 1,0 µg do alimento contaminado que corresponde a uma população de S. aureus superior a 10 5 / grama. Entrevista com os doentes; colheita de dados e a análise epidemiológica são essenciais no diagnóstico da intoxicação alimentar estafilocócica. Os alimentos incriminados devem ser recolhidos e analisados para os estafilococos. A presença de estafilos enterotoxigênicos é prova circunstancial que o alimento contém toxina. O teste conclusivo é a ligação da intoxicação com um alimento específico ou nos casos de vários ingredientes, a detecção da toxina na amostra do alimento(s). A observação microscópica direta do alimento pode auxiliar o diagnóstico, no caso em que o alimento foi pasteurizado ou aquecido. Métodos sorológicos para a determinação do enterotoxinas do S. aureus isoladas de alimentos, bem como métodos para a separação e detecção de toxinas em alimentos têm sido desenvolvidos e utilizados como auxílio no diagnóstico da intoxicação.A fagotipagem pode ser útil quando estafilococos viáveis podem ser isolados dos alimentos incriminados; da(s) vítima(s) e a suspeita do(s) portador (es) como manipuladores de alimentos. Os alimentos incriminados na toxinfecção alimentar incluem: carnes e produtos derivados; aves e ovos; saladas com ovo, atum, frango; batata; macarrão, produtos de padaria, como pastéis de nata; torta de creme e chocolate; recheios de sanduíche, leite e produtos lácteos. Os alimentos que necessitam de tratamento durante a preparação e mantidos em temperaturas elevadas, após o preparo são frequentemente envolvidos na toxinfecção alimentar. Os estafilococos estão presentes no ar, leite em pó, esgoto, água e comida ou de equipamentos de alimentos, superfícies ambientais, no homem e animais. O homem e os animais são os reservatórios primários. Os estafilococos estão presentes nas fossas nasais e garganta; no cabelo e na pele de 50% ou mais dos indivíduos hígidos. Esta prevalência é ainda maior para aqueles que associam ou que entrem em contacto com pessoas doentes e ambientes hospitalares. Os manipuladores de alimentos são as principais fontes de contaminação de alimentos em surtos de intoxicação alimentar. A intoxicação humana é causada pela ingestão de enterotoxinas em alimentos produzidos (S. aureus) que não foram mantidos suficientemente quentes (60°C ou acima) ou frio suficiente (7,2°C ou abaixo). Todas as pessoas são consideradas suscetíveis a esse tipo de intoxicação bacteriana, porém, a intensidade dos sinais pode variar. As espécies animais, em sua maioria, são resistentes às enterotoxinas, exceto macacos e gatinhos. A verdadeira prevalência/incidência de a intoxicação alimentar estafilocócica é desconhecida por uma série de razões, incluindo a resposta das vítimas às entrevistas com os agentes de saúde; diagnóstico errôneo da doença, pois há sinais semelhantes aos de outros tipos de intoxicação alimentar (como vômitos causados pela toxina do B. cereus); coleta inadequada para análises laboratoriais e exames laboratoriais impróprios. Na análise do alimento é necessário detectar vestígio de enterotoxina estafilocócica nos alimentos incriminados. A toxina deve ser separada dos constituintes dos alimentos e concentrada por precipitação com antissoro específico (antienterotoxina). Dois princípios são utilizados para esse fim: 1-Adsorção seletiva da enterotoxina do extrato alimentar para as resinas de troca iônica e; 2-Utilização de processos físicos e químicos para a remoção seletiva de componentes alimentares a partir do extrato, deixando a enterotoxina (s) em solução. A utilização dessas técnicas e da concentração dos produtos resultantes tornou possível a detecção de pequenas quantidades de enterotoxinas nos alimentos. Há métodos rápidos baseados em anticorpos monoclonais como ELISA, ou aglutinação passiva reversa em látex que estão sendo avaliados quanto à sua eficácia na detecção de enterotoxinas em alimentos. Estes métodos rápidos podem detectar cerca de 1,0 nanograma de toxina / g de alimento. Surto Cerca de 1364 crianças adoeceram de um total de 5.824 que tinham comido o almoço servido em 16 escolas primárias do Texas. Os almoços foram preparados em uma cozinha central e transportados para as escolas de caminhão. Estudos epidemiológicos revelam que 95% das crianças que adoeceram tinham comido salada de frango. Na tarde do dia anterior ao almoço, os frangos congelados foram fervidos por 3 horas. Após o cozimento, os frangos foram desossados, resfriados a temperatura ambiente com um ventilador; cortados em pequenos pedaços e colocados em panelas de alumínio com l2 cm de profundidade e armazenados, durante a noite no refrigerador a 8-9°C. Na manhã seguinte, os ingredientes da salada foram adicionados e misturados em batedeira. A comida foi colocada em caixas térmicas e transportadas para as várias escolas de 9h30-10h:30, onde foi mantido em temperatura ambiente até servido entre as 11:30 e 12h. O exame bacteriológico da salada de frango revelou presença de grande número de S. aureus. A contaminação do frango, provavelmente ocorreu quando foi desossado. A galinha não foi resfriada com rapidez suficiente, porque fora armazenada em camadas de l2 cm de profundidade. Crescimento do Staphylococcus provavelmente ocorreu também durante o período em que o alimento foi mantido na sala de aula. A prevenção deste incidente incluiria: a) Rastreamento dos indivíduos que manipularam o frango como portadores do Staphylococcus b) Resfriamento mais rápido do frango; c) Refrigeração adequada da salada e d) Tempo de preparação para o seu consumo. 38. Toxinas Exfoliativas (Toxinas Epidermolíticas) Há dois tipos de toxina exfoliativa; a ETA e a ETB. Elas pertencem ao fago do grupo II, responsável por lesões vesiculares em crianças e adultos com a ocorrência de alterações imunológicas posteriores. ETA é um produto de gene cromossomial e ETB é produto de um gene plasmídico. As duas toxinas possuem aproximadamente 30k Da, mas diferem antigenicamente. As duas rompem o encaixe de uma célula à outra, no estrato granuloso. A inoculação da toxina A ou B em camundongo neonatos induz lesão vesicular semelhante ao que é visto em pênfigo neonatal ou impetigo, no homem. Surto da doença envolve geralmente alta percentagem de crianças nas enfermarias. 39. Outras Toxinas Muitas linhagens de ECNs causam infecções nos animais e no homem. Elas produzem um polipeptídio, com peso molecular de 12 kDa, que lesiona a membrana semelhantemente a melitina, veneno encontrado no picada de abelhas. 4. Enzimas 41. Coagulase O S. aureus produz duas coagulases; uma ligada à célula ou ”clumping factor” e outra extracelular ou coagulase livre. A proteína de ligação ao fibrinogênio na superfície dos estafilococos e sem ação enzimática pode converter diretamente fibrinogênio em fibrina insolúvel, causando “grumos” ou “clumping”. Por outro lado, a exoenzima livre causa ativação específica da trombina plasmática, levando a conversão de fibrinogênio em fibrina. A formação de fibrina próxima à infecção estafilocócica localiza o processo, impedindo a fagocitose. O papel da coagulase na virulência não é muito claro. Quando o gene para a produção de coagulase foi alterado pela biologia molecular, os organismos coagulases negativos não demonstraram redução da virulência em modelos experimentais (camundongos). 42. Lipases, Esterases e Enzima Modificadora de Ácidos Graxos (EMAG). As linhagens do S. aureus são capazes de multiplicarem-se rapidamente sobre a pele, produzindo enzimas que degradam lipídios (lipases e esterases) e uma enzima chamada de “Fatty Acid-Modifying Enzyme” (FAME) ou “Enzima Modificadora de Ácidos Graxos” (EMAG). Os ácidos graxos bactericidas liberados pela degradação lipídica são quimicamente modificados pela EMAG, perdendo suas propriedades bactericidas. Deste modo, essa enzima é importante, especialmente em amostras capazes de formar abscessos eficientemente. 43. Catalase A maioria das linhagens do S. aureus produz catalase, enzima que catalisa a conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. A catalase protege o S. aureus do peróxido de hidrogênio que se acumula durante o metabolismo bacteriano, durante a fagocitose. 44. Proteases O S. aureus produz, pelo menos, 4 proteases e uma enzima de degradação específica da lesão. Essas proteases, assim como outras exoenzimas hidrolíticas, tais como a hialuronidase e a nuclease são importantes no início do processo, degradando o pus no abscesso, permitindo a liberação de nutrientes para a multiplicação das células jovens,levando a cronificação da infecção. Entretanto, um abscesso local com barreira de fibrina e microrganismos com pequena produção de estafiloquinase e protease, frequentemente tornam-se estéreis. FATORES PREDISPONENTES Traumas, esmagamentos, estado imune do animal, remoção da flora competitiva, virose primária, produção de lipases etc. PATOGENIA A virulência dos ECP e ECN não pode ser explicada apenas por um único fator de virulência. Interações complexas ocorrem entre os diversos mecanismos, toxinas extracelulares, proteínas de superfície, enzimas etc todas contribuem na virulência dos estafilococos, incluindo: a) Colonização do S. aureus (pele, nariz, orofaringe). b) Penetração e infecção. c) Resistência à fagocitose mediada pela proteína A e ao material capsular. d) Sobrevivência intracelular em células fagocíticas. e) Resistência mediada pela coagulase ao fator antibactericida. f) Produção de hialuronidase. g) Produção de alfa toxina. h) Produção de outras leucocidinas. i) Desenvolvimento de reação de hipersensibilidade retardada. j) Adesão às células epiteliais. ENVIO DE AMOSTRAS CLÍNICAS Amostras clínicas incluindo pus, secreção láctea, sêmen ou tecidos de diversas origens devem ser enviados em recipientes estéreis (vidro, plástico ou suábios), bem fechados; dentro de sacos de plástico, em caixa térmica sob-refrigeração. Algumas vezes, o material pode ser congelado até o envio ao laboratório de diagnóstico. Mesmo que as espécies do gênero sejam resistentes às condições adversas é boa prática tomar essas medidas uma vez que outros agentes podem estar associados à causa, porem menos resistentes. O material deve se possível chegar ao laboratório dentro das primeiras 24 horas (Guerreiro et al. 1984). DIAGNÓSTICO CLÍNICO O diagnóstico clínico não é difícil e tem como base: a anamnese, a apresentação e os sinais clínicos. A especialização e experiência do veterinário são importantes na elaboração da suspeita. O laboratório somente confirma ou refuta o diagnóstico do veterinário clínico. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O diagnóstico laboratorial é uma tarefa complexa, exigindo do laboratorista, treinamento especializado, pois há espécies com as mesmas características fenotípicas, as quais podem variar, conforme as técnicas utilizadas. As características fenotípicas variam, conforme as técnicas e testes utilizados, todos preconizados pelo subcomitê de taxonomia de estafilococos e estreptococos. As principais características que permitem diferenciar os oito ECP estão contidas nos quadro 2 abaixo Quadro2. Diferenciação entre espécies dos ECP 1) S. aureus subsp aureus; 2) S. aureus subsp anaerobius; 3) S. delphini; 4) S. hyicus; 5) S. intermedius; 6) S. lutrae; 7) S. pseudintermedius; 8) S. schleiferi subsp coagulans. Testes/espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 Coagulase* + + + d + + + + “Clumping factor” + - - - d - - - Cresc. aerobiose + -/ + tardio + + + + + + Cresc. à 15° C + - + + Cresc. à 45° C + - + - fraco retardado + + Diâmetro Colonial > 5 mm** + - + + + - + d Pigmentação Colonial + - - - - - - - Redução de Nitratos + - + + + + + + Testes/espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 1) S. aureus subsp aureus; 2) S. aureus subsp anaerobius; 3) S. delphini; 4) S. hyicus; 5) S. intermedius; 6) S. lutrae; 7) S. pseudintermedius; 8) S. schleiferi subsp coagulans. 1) S. aureus subsp aureus; 2) S. aureus subsp anaerobius; 3) S. delphini; 4) S. hyicus; 5) S. intermedius; 6) S. lutrae; 7) S. pseudintermedius; 8) S. schleiferi subsp coagulans. Testes/espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 DNAse termoestável + + - + + + + + Hialuronidase + + + - - - Hemólise (sangue ovino) + + + - d + + + VP*** + - - - - - + + Beta- Galactosidase - - + - + + + d Beta- Glucuronidase - - geral m + tardio - - Pirrolidonil Arilamidase - - - ?+ ?+ Testes/espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 1) S. aureus subsp aureus; 2) S. aureus subsp anaerobius; 3) S. delphini; 4) S. hyicus; 5) S. intermedius; 6) S. lutrae; 7) S. pseudintermedius; 8) S. schleiferi subsp coagulans. Testes/espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 DGalactose**** + - + + + + + Maltose**** + + + - - ou fraca m + + + - Dmanitol**** + - + - + + - d Sacarose + Dtrealose**** + - - + + + + - Dribose**** + - + + + + Dxilose**** - - - - - +***** - - Resistência 8 µg/mL de acriflavina + - - - - - - Resistência a polimixina B + - + - - - - Testes/espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 1) S. aureus subsp aureus; 2) S. aureus subsp anaerobius; 3) S. delphini; 4) S. hyicus; 5) S. intermedius; 6) S. lutrae; 7) S. pseudintermedius; 8) S. schleiferi subsp coagulans. * Plasma de coelho. ** No agar P após 3 dias de incubação a 37 °C. Composição do agar P (g/L) : 15g de agar; 10g de peptona; 5g de NaCl; 5g de extrato de levedura e 1g de glicose. *** Técnica derivada daquela de Davis e Hoyling. A cepa estudada é semeada em agar BHI, contendo 1 % de glicose. Após 24 h de incubação a 37°C, se deposita sobre o agar um disco impregnado de uma solução a 10% de piruvato de sódio. Após 3 h de incubação, colocar sobre o disco uma gota de solução de potássa a 40%; uma gota de solução de creatinina a 1% e uma gota de solução alcoólica a 1% de alfa naftol . Esperar 1 hora e se houver o aparecimento de uma coloração rosa ou vermelha o teste é positivo. **** Acidificação em aerobiose. ***** Segundo Brun & Bes, a característica de acidificação da xilose não existe quando utilizamos o API Staph. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA) O teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) é de importância, pois pode e deve orientar a tomada de decisão quanto ao tratamento medicamentoso. Entretanto, o comportamento da linhagem isolada frente ao tratamento imposto pode ser diferente, pois a amostra foi testada “in vitro” e não “in vivo”. As 84 cepas estudadas por La Fuente e colaboradores, em 1985, foram sensíveis à eritromicina, à vancomicina, à novobiocina, à penicilina G, à meticilina, às cefalosporinas e às tetraciclinas, PROFILAXIA Há vacinas disponíveis, mas a profilaxia é sanitária. Ela baseia-se no isolamento dos animais infectados; na desinfecção dos locais e dos objetos e nas boas práticas de criação (higiene e tratamento das feridas etc.). Animais introduzidos no plantel deve ser objeto de controle restrito e nos animais gravemente enfermos devem ser sacrificados. Mastite Estafilocócica Prof. Marcos Gomes INTRODUÇÃO Mastite é a principal inflamação da glândula mamária e o S. aureus, o agente mais importante como causa de mastites no mundo. Os ECN são considerados patógenos menores, mas responsáveis por mastites severas. Há diferenças entre os ECN em vários países. Entretanto, o S. epidermidis, S. chromogenes, S. simulans, S. xylosus, S. hyicus e S. haemolyticus são as espécies mais comuns. Mastite estafilocócica pode clínica ou subclínica. O S. aureus é encontrado em lesões supurativas de bovinos, especialmente nas mastites. Em muitas regiões criatórias do mundo é o principal agente relacionado coma glândula mamária. O sistema moderno de ordenha assim como o confinamento favorece a penetração do agente na glândula pelo canal da glândula. O microrganismo é um ativo colonizador do canal galactófago. A transmissão pode ocorrer, através da ordenhadeira e pelas mãos do ordenhador. Os estafilococos alcançam o tecido mamário, através de lesões ou feridas na superfície do teto. Após a entrada, há o desenvolvimento de lesões agudas ou crônicas, estando associadas a diversos fatores, incluindo o fator de aderência à superfície interna do canal do teto; presença de anticorpo para a alfa toxina; número de neutrófilos na secreção mamária; produção de beta toxina e coagulase; freqüência de ordenhamento; capacidade nutricional e multiplicativa da bactéria na utilização de nutrientes dentro da glândula mamária, entre outros. A fagocitose e a morte intracelular do S. aureus pelo leucócito no leite é inibida pela gordura do leite. A caseína inibe a destruição intracelular, pelo bloqueio do efeito bactericida do sistema de lactoperoxidase e das histonas. Embora a eficiência do sistema fagocítico de defesa possa ser reduzida, ela é importante na manutenção dos mecanismos de defesa à infecção subclínica do S. epidermidis, S. agalactiae ou E. coli pelo aumento no número de células produzidas em resposta a presença de S. epidermidis. A mastite pelo S. aureus pode variar de subclínica a gangrenosa. A maioria dos casos é subclínica e crônica. São formas inaparentes, mas com prejuízo econômico grande. A mastite gangrenosa superaguda causada pelo S. aureus ocorre em vacas de primeira cria (1ª lactação), acarretando perda de grande quantidade de tecido mamário. A lesão tóxica aos vasos resulta numa necrose coagulativa isquêmica dos tecidos adjacentes. A pele torna-se púrpura sobre a área afetada, podendo se desprender. Os animais têm febre alta, podendo morrer por toxemia em 2 a 3 dias. A mastite estafilocócica crônica resulta no endurecimento do úbere, aumento na contagem celular e coagulação ocasional do leite. O S. aureus causa mastite em ovelhas, cabras, éguas, porcas, gatas e martas. Staphylococcus hyicus Prof. Marcos JP Gomes Epidermite Exsudativa SINONIMIA "Micrococcus hyicus", Staphylococcus hyicus subsp hyicus. HISTÓRICO Em 1978, Devriese e colaboradores publicaram um estudo com 168 amostras identificadas como S. hyicus, isoladas de suínos, bovinos e aves. A homologia de ADN- ADN, assim como as características fenotípicas permitiu dividir as amostras em dois grupos como duas subespécies de uma única espécie. Os autores validaram os nomes de S. hyicus para S. hyicus subsp hyicus (132 linhagens não pigmentadas) e de S. hyicus subsp chromogenes (36 amostras pigmentadas). Em 1º de janeiro de 1980, essas denominações foram aceitas no “Approved Lists of Bacterial Names”. CARACTERPISTICAS GERAIS O S. hyicus apresenta as características do gênero Staphylococcus spp. As amostras desta espécie são cocos Gram positivos; possuem 0,6 - 1,3 µm de diâmetro; agrupados em 2 ou em 4 ou em pequenos grumos; imóveis; não esporulados; aeróbios ou anaeróbios (o crescimento pode ser melhor em anaerobiose); catalase positivos; nitrato redutase positivos; oxidase negativos; sensíveis à novobiocina; resistentes à polimixina B; resistentes à lisozima; sensíveis à lisostafina. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E CULTURAIS Apresentam resposta positiva para os testes: ADNase, Termonuclease, Hialuronidase, Gelatinase, Lecitinase, Hidrólise da caseína, Fosfatase alcalina, Arginina di-hidrolase, Hidrólise do hipurato, Hidrólise de Tween 80. Acidificação em aerobiose do beta-D-frutose, do D-galactose, da N- acetilglucosamina, da glicose, do glicerol, da lactose, da D-manose, da D-ribose, da sacarose e da D-trealose. Apresentam resposta negativa para os testes: Produção de VP (acetoína), “clumping factor” Indol, Fenilalanina desaminase, Ornitina descarboxilase, Beta-galactosidase, Arginine arilamilase, Pirrolidonil arilamilase, Hidrólise da esculina, redução do telurito, produção de H2S, Acidificação em anaerobiose do Manitol, Acidificação em aerobiose do Adonitol, Amidalina, L- arabinose, Arabitol, D-celobiose, Dulcitol, D-fucose, beta-gentiobiose, Lixose, Maltose, D-manitol, Melibiose, D-melezitose, Rafinose, Ramnose, Salicina, Sorbitol, Sorbose, Tagatose, D-turanose, Xilitol e D-xilose. Apresentam resposta variável aos testes: Coagulase, Urease, Beta-glucosidase e Beta-glucuronidase (resposta, geralmente positiva). Para as cepas (linhagens) coagulases positivas, a coagulação em tubo contendo plasma de coelho não é observada antes das 18 a 24 horas de incubação; menos de 10% delas dão uma resposta positiva em 4 horas. O S. hyicus é cultivado na presença de 0,5%, 7,5% ou 10% de Sal a 15°C. O crescimento é fraco na presença de 15% Sal ou a 45°C. A temperatura ótima de crescimento está entre 30 e 35°C. As colônias obtidas em gelose possuem um diâmetro superior a 5 mm e não são pigmentadas. No AS de bovino ou ovino, as colônias não são hemolíticas. No Tripticase Soy Agar (TSA), as colônias são circulares, com bordos regulares, ligeiramente convexas, opacas, com superfície brilhante e com diâmetro entre 3 a 5 mm. No caldo, o crescimento produz um turvamento uniforme e a formação de um sedimento. Aproximadamente 90% das linhagens do S. hyicus isolados de suínos e bovinos produzem CAMP positivo com amostra beta hemolítica de S. aureus subsp aureus. Fagos lisogênicos estão presentes nas amostras de S. hyicus, existindo um sistema de lisotipia que utilizam mais de 23 fagos, permitindo o rastreamento epidemiológico das linhagens. As amostras de S. hyicus não são lisadas pelos fagos utilizados na fagotipagem das amostras do S. aureus subsp aureus. HABITAT Nos animais hígidos, o S. hyicus é isolado da pele e cavidades nasais das aves domésticas ou silvestres; da pele, cavidades nasais, tonsilas e vagina de suínos; da pele e tonsilas de bovinos; da glândula mamária e leite de cabras e pele de gatos. O S. hyicus ainda não foi isolado do homem. PATOGENICIDADE Este agente é responsável por diversas infecções animais e de numerosos casos de infecções cutâneas de cavalos, bovinos, suínos; metrite e vaginites em suínos. A doença pode ser reproduzida experimentalmente. Há duas subespécies do S. hyicus, incluindo o S. hyicus subsp hyicus, agente da epidermite exsudativa do suíno e o S. hyicus subsp chromogenes um microrganismo de virulência questionável, geralmente isolado de mastite bovina. Epidermite exsudativa é uma infecção aguda e generalizada da derme de leitões. A doença é caracterizada pelo excesso de secreção sebácea, exfoliação e exsudação. Essas mudanças resultam em perda da função que, geralmente compromete toda a superfície do corpo. INFECÇÃO DOS SUÍNOS Nos suínos, o S. hyicus é responsável por artrites (idade inferior a 6 semanas), abortos, metrites e vaginites. É responsável pela epidermite exsudativa (exudative epidermitis), igualmente chamada de eczema seborréico do suíno (seborrhoic eczema), doença gordurosa do suíno (“greasy pig disease”) ou impetigo contagiosa suis. A dermatite exsudativa é uma doença de importância, especialmente nas granjas com boa sanidade. Os leitões se infectam facilmente, após o nascimento pelo contato com as mães. Os fatores de risco são constituídos pelos traumatismos resultantes da manipulação dos animais jovens (castração, corte de dentes, caudectomia, tatuagem) ou brigas. As infecções pelo porcine respiratory e reproductive syndrome virus (gêneroArterivirus, família dos Arteriviridae, ordem dos Nidovirales) ou pelo porcine circovirus tipo 1 (gênero Circovirus, família dos Circoviridae) ou pelo porcine parvovirus (gênero Parvovirus, sub-família dos Parvovirinae, família dos Parvoviridae) predispõem igualmente ao aparecimento da doença. A forma clássica ocorre principalmente nos leitões. A doença não é pruriginosa, começando no ventre, orelhas e ao redor dos olhos. A pele aparece gordurosa; os pelos ficam colados e as pálpebras edemaciadas. A infecção torna-se generalizada, atingindo os rins, fígado, articulações e sistema nervoso central. A infecção pode atingir de 30- 50% da leitegada. Ela pode tornar-se epidêmica. A infecção é acompanhada pelo enfraquecimento e mortes. As formas localizadas se manifestam, após o período de desmama e início da engorda. Elas surgem como crostas circulares, elevadas com 1 a 2 cm de diâmetro, disseminadas por toda a superfície do corpo mesmo que sejam pouco numerosas, na região da cabeça e pescoço. A doença não é acompanhada de prurido, evoluindo para a cura mesmo na ausência de tratamento. O S. hyicus é a espécie mais associada à síndrome da mordedura do flanco (flank biting syndrome) e "necrose das orelhas" (necrotic ear syndrome). Essas síndromes resultam de uma superinfecção de feridas causada pelas mordeduras. Na vaca e na cabra, o S. hyicus é responsável por mastites subclínicas e infecções subcutâneas. No gato, a presença do S. hyicus está associada às lesões subcutâneas. Nas aves, o S. hyicus é responsável por artrites, sinovites, osteomielites e espondilites. Nos eqüinos, o S. hyicus á origem de diversas lesões cutâneas, abscessos, podendo ser isolado de lesões de dermatofilose. FATORES DE VIRULÊNCIA Coagulase Aproximadamente, 24 a 56% das linhagens do S. hyicus produzem coagulase. A coagulase é uma proteína extracelular que se liga à protrombina para formar um complexo chamado “estafilotrombina” que transforma o fibrinogênio em fibrina. As bactérias presentes no interior do coágulo tornam-se protegidas contra as defesas do hospedeiro. Cerca de 80 % das linhagens do S. hyicus isoladas de suínos possuem uma proteína comparável à proteína A do S. aureus. Esta proteína é capaz de ligar-se ao fragmento Fc das imunoglobulinas G e impedir a opsonização dessas imunoglobulinas. As linhagens de origem bovina ou de origem aviária são desprovidas de proteína A. As cepas de origem suína, especialmente aquelas isoladas da enfermidade (aprox. 51 %) produzem estafiloquinase. A estafiloquinase se liga ao plasminogênio, convertendo-se em plasmina. A plasmina, por sua ação fibrinolítica, desempenha um papel na disseminação da cepa e, pela ação proteolítica, permite a disponibilização de aminoácidos úteis em seu crescimento. O S. hyicus excreta uma lipase, única dentro do mundo bacteriano com atividade enzimática sobre os lipídios e fosfolipídios. A importância dessa enzima dentro da patogenia da infecção ainda não é bem conhecida. A lipase pode permitir a persistência da bactéria dentro da pele em oposição à fagocitose. O S. hyicus sintetiza duas metaloproteases: a ShpI e ShpII. Seu papel na patogenicidade é incerto, mas pode ser responsável pela citotoxicidade. A protease ShpII é mais necessária na maturação extracelular da lipase que é excretada sob a forma de uma prolipase. As amostras isoladas de suínos produzem exfoliatinas, com peso molecular entre 27-30 kDa, chamadas ExhA (Ex para exfoliatina e h para hyicus), ExhB e ExhC. A toxina ExhA é uma metaloproteína com zinco e a toxina ExhB uma metaloproteína com cobre ou cobalto. Os genes codificadores para a toxina ExhB estão em um plasmídio de grande tamanho enquanto que a toxina ExhA é codificado em genes cromossômicos. A inoculação por via SC das toxinas ExhA ou ExhB em leitões ou pintos de um dia provocaram lesão epidérmicas. Nos leitões, a inoculação de uma cepa não produtora de exfoliatina não produziu eritema persistente por 48 horas enquanto que a inoculação de uma cepa produtora provocou exfoliação, exsudação e a formação de crostas. ETIOPATOGENIA O S. hyicus subsp hyicus difunde-se facilmente de um grupo de suínos para outro. O trânsito de animais tem sido um fator importante na difusão da doença. A doença tem um período de duas semanas, após a introdução de um animal infectado. Leitões de 1 a 7 semanas são geralmente acometidos. A mortalidade e morbidade são variáveis. Os microrganismos penetram através de soluções de continuidade na pele (mordida dos leitões), devido à competição pelo alimento/espaço. A doença pode se apresentar com o corpo inteiro coberto com exsudato úmido ou sob a forma crônica onde o começo é lento e a pele enrugada. As lesões surgem poucos dias após a inoculação experimental. Inicialmente, surgem as vesículas nas regiões da superfície da pele sem pelos, bandas coronarianas e atrás das orelhas. A doença progride pelo corpo todo; a pele torna-se espessada e a camada da epiderme pode descamar-se. Os suínos recuperam-se em duas semanas, após o início da doença, tornando recuperados, após 30-40 dias. O exame histológico da pele revela acúmulo de material protéico, células inflamatórias e bactérias sobre a camada superficial. Na necropsia, os ureteres estão aumentados e o rim cístico pelo acúmulo de detritos e bloqueio do fluxo normal da urina. Surtos podem ocorrer (aproximadamente 50% dos animais) com mortes, após apresentarem anorexia, febre e sinais de intensa sede. A pele apresenta alopecia, fissura e paraqueratose. O tratamento com complexo B, nos animais infectados pode contribuir para sua recuperação, parecendo que as necessidades de biotina nesta doença estão alteradas, ou seja, a doença pode ser agravada pela carência de biotina. COLHEITA DE AMOSTRAS Devemos enviar leitões vivos ou recentemente mortos. Podemos remeter swabs das lesões cutâneas. As amostras colhidas nas granjas distantes do laboratório devem ser enviadas em refrigeração em caixa de isopor. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL As amostras colhidas são inoculadas no AS (ovinos ou bovinos). Incubação em estufa a 37ºC, durante 24 horas. Reconhecimento das colônias de Staphylococcus spp. Em amostras contaminadas indica-se inoculação em meios seletivos (sais de Manitol, Columbia CNA agar). A identificação do agente afora suas características morfológicas e culturais tem como base, o tipo respiratório e a pesquisa da catalase. As galerias API Staph não permitem o diagnóstico preciso, a menos, que haja recursos para testes complementares. A cartela API ID 32 STAPH permite assegurar o diagnóstico, mas caros. A amplificação do espaço intergênico ARNr 16S-ARNr 23S permite a diferenciação entre S. hyicus das outras espécies do gênero Staphylococcus isoladas de mamites de bovinos (com exceção do S. intermedius). A natureza da espécie e subespécie faz parte do diagnóstico diferencial, levando em consideração a origem da amostra e eventual produção de coagulase. A identificação das diferentes espécies está contida no Quadro. 1 abaixo. TESTE DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA (TSA) As linhagens isoladas de suínos são geralmente resistentes à penicilina, à estreptomicina, às tetraciclinas, à trimetoprima, às sulfonamidas, à clindamicina e à eritromicina. Os antimicrobianos ativos incluem: novobiocina, enrofloxacina, ampicilina, ceftiofur, associação sulfonamida-trimetoprima e cloranfenicol. VACINAS Não há imunógenos disponíveis no comércio para prevenir epidermite exsudativa. Somente vacinas autógenas são utilizadas nas criações de suínos. Como as linhagens de S. hyicus avirulentas podem ser isoladas da pele, somente ascepas potencialmente patogênicas (provindas de casos clínicos) devem ser incluídas na autovacina. Quadro I. Características bacteriológicas de espécies de Staphylococcus, sensíveis à novobiocina, coagulase negativas (ou podem ser coagulase negativas), oxidase negativa isoladas dos animais. 1) S. auricularis; 2) S. capitis subsp urealyticus; 3) S. caprae; 4) S. chromogenes; 5 ) S. epidermidis; 6 ) S. felis; 7 ) S. haemolyticus; 8) S. hominis subsp hominis; 9) S. hyicus; 10) S. muscae; 11) S. pasteuri; 12) S. simulans; 13) S. warneri. Testes / Espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Coagulase* - - - - - - - - d - - - - Ø colonial ≥ 5 mm** - d d + - + + - + + + + d Pigmento colonial - d - d - - d d - - f - d Cresc. em 10 % Sal + + f + + f + + + + + Cresc. em 15 % Sal f -f - + d - -f + + f f Cresc. à 15°C - + -f +f -f -f + (+) + + d Cresc. à 45°C + + -f + + + + -f - + + + Resist. 2U/mL Bacitracina + + - + - - - + + - Red. Nitratos d + + + +f + d d + + -f VP d d + - + - d d - - - -f + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1) S. auricularis; 2) S. capitis subsp urealyticus; 3) S. caprae; 4) S. chromogenes; 5 ) S. epidermidis; 6 ) S. felis; 7 ) S. haemolyticus; 8) S. hominis subsp hominis; 9) S. hyicus; 10) S. muscae; 11) S. pasteuri; 12) S. simulans; 13) S. warneri. * : Plasma de coelho. ** : No agar P apos 3 dias de incubação a 37 °C. 1) S. auricularis; 2) S. capitis subsp urealyticus; 3) S. caprae; 4) S. chromogenes; 5 ) S. epidermidis; 6 ) S. felis; 7 ) S. haemolyticus; 8) S. hominis subsp hominis; 9) S. hyicus; 10) S. muscae; 11) S. pasteuri; 12) S. simulans; 13) S. warneri. Testes / Espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Hialuronidase - - d - + DNase -f + f -f d -f + - - -f d Nuclease Termoestável - - - -f -f -f - - + - - -f - ADH d + + + +f + + d + - - + d Urease - + + d + + - + d - + + + Fosfatase alcalina - - + + + + - - + + - f - Beta-glucosidase - - - d d - d - d + - + Bêta-glucuronidase - - - - - - d - d + d d Beta-galactosidase d - - - - + - - - - - + - Testes / Espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1) S. auricularis; 2) S. capitis subsp urealyticus; 3) S. caprae; 4) S. chromogenes; 5 ) S. epidermidis; 6 ) S. felis; 7 ) S. haemolyticus; 8) S. hominis subsp hominis; 9) S. hyicus; 10) S. muscae; 11) S. pasteuri; 12) S. simulans; 13) S. warneri. 1) S. auricularis; 2) S. capitis subsp urealyticus; 3) S. caprae; 4) S. chromogenes; 5 ) S. epidermidis; 6 ) S. felis; 7 ) S. haemolyticus; 8) S. hominis subsp hominis; 9) S. hyicus; 10) S. muscae; 11) S. pasteuri; 12) S. simulans; 13) S. warneri. Espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 L-arabinose*** - - - - - - - - - - - - - D-celobiose*** - - - - - - - - - - - - - D-fucose*** - - - - - - - - - - Beta-D-fructose*** + + + + + d + + + + + D-galactose*** - + + d d d d + - + -f d Lactose*** - d + + d + d d + - + d Maltose*** (+) + d d + - + + - - f -f (+) D-manitol*** - + d d - d d - - - f + d D-manose*** - + + + (+) + - - + - - d - Testes/Especies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1) S. auricularis; 2) S. capitis subsp urealyticus; 3) S. caprae; 4) S. chromogenes; 5 ) S. epidermidis; 6 ) S. felis; 7 ) S. haemolyticus; 8) S. hominis subsp hominis; 9) S. hyicus; 10) S. muscae; 11) S. pasteuri; 12) S. simulans; 13) S. warneri. *** : acidificação em aerobiose Testes/Espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 D-Melezitose*** - - d - - d - - - d Rafinose*** - - - - - - - - - - - - - D-Ribose*** - - + d -f d - + - - d d Sacarose*** d + - + + d + (+) + + + + + Salicina*** - - - - - - - - - - - D-Trealose*** (+) - + + - + + d + + + d + D-Turanose*** d d - - d d d - + - d Xilitol*** - - - - - - - - - - - D-Xilose*** - - - - - - - - - + - - - * : Plasma de coelho (Difco). ** : No agar P apos 3 dias de incubação a 37° C. Composição do agar P (em g/L): agar: 15g; peptona: 10g; NaCl: 5g; extrato de levedura: 5g; glicose: 1g. *** : acidificação em aerobiose + : ao menos 90 % das cepas são positivas. - : ao menos 90 % das cepas são negativas. d : 11 a 89 % das cepas são positivas. ( ) : reação tardia. f : reação fracamente positiva. +f : reação positiva a fracamente positiva. -f : reação negativa a fracamente positiva. Staphylococcus pseudintermedius Prof. Marcos JP Gomes Dermatites; Otites; Piodermites. HISTÓRICO Todas as cepas de estafilococos capazes de produzir coagulase foram colocadas, antes de 16 de Janeiro de 1985, foram colocadas em subespécies S. aureus subsp aureus. Desde esta data, os avanços taxonômicos permitiram identificar outras espécies ou subespécies que produziam ou podiam produzir coagulase, tais como: S. aureus subsp aureus/anaerobius; S. delphini; S. hyicus; S. intermedius; S. lutrae e S. schleiferi subsp coagulans. O S. pseudintermedius foi incluído nesta lista em 11 de julho de 2005. Esta nomenclatura foi validada e publicada para um grupo de quatro linhagens (cepas) originalmente identificadas com base no perfil de restrição intergênicas dentre os genes para tRNA. As seqüências dessas quatro linhagens eram idênticas e a análise filogenética mostrou que as cepas eram aparentadas do S. delphini, S. intermedius e ao S. schleiferi subsp schleiferi (homologia superior a 99%). Os estudos de hibridização ADN-ADN realizada com duas dessas cepas, incluindo a linhagem LMG 22219 que será designada como a cepa típica do S. pseudintermedius revelou que estas duas linhagens formam um único grupo genômico distinto do S. delphini, S. intermedius e S. schleiferi subsp schleiferi. O S. pseudintermedius é um comensal da pele e mucosas e o mais importante patógeno isolado em amostras clínicas dos cães. Esta bactéria coagulase positiva está primariamente associada com infecções da pele e ouvido, mas pode estar associado com todo tipo de infecção comunitária e hospitalar com difusão de amostras resistentes aos antimicrobianos que deram origem ao termo S. pseudintermedius Resistente à Meticilina (SPRM) ou sua versão inglesa Methicilin-resistant S. pseudintermedius (MRSP) as quais tem complicado o tratamento consideravelmente. A introdução de novos produtos antibacterianos no mercado veterinário foi reduzida, pois a resistência aos antimicrobianos aumentou assustadoramente entre os animais e no homem. É necessário que medidas eficazes sejam adotadas na prevenção e controle da infecção pelo S. pseudintermedius nos cães. A aplicação dessas medidas necessita o conhecimento da epidemiologia do agente, do hospedeiro e do ambiente, todos envolvidos na patogenia da infecção pelo S. pseudintermedius. Taxonomia As recentes mudanças na taxonomia e o surgimento da resistência à meticilina renovaram o interesse da veterinária sobre o S. pseudintermedius, resultando no desenvolvimento e na aplicação de novas ferramentas diagnósticas, incluindo: tipificação de linhagens e, conseqüentemente obtenção de conhecimento quanto à ecologia, à epidemiologia, à estrutura populacional e à virulência das espécies. O S. intermedius, foi descrito foi descrita, pela primeira vez, em 1976, por Hájek como espécie coagulase positiva, tendo como base o conteúdo C+G e os testesfenotípicos. O autor isolou amostras de pombos, cães, martas e cavalos. Por mais de 30 anos, o S. intermedius foi considerado a causa mais comum das infecções de pele e tecidos moles no cão. A cepa típica NCTC 11048 ou ATCC 29663 ou CCM 5739 ou LMG 13351 isoladas de pombos foram utilizadas como representante do S. intermedius nos estudos de diferenciação entre as espécies. Entretanto muitos pesquisadores detectaram uma grande diversidade fenotípica e genotípica entre as amostras, sugerindo a existência de outras espécies. (2,13-16) Recentemente, foi demonstrado que as amostras isoladas como S. intermedius, através dos testes fenotípicos era, na verdade, uma mistura de três espécies diferentes: o S. intermedius, o S. pseudintermedius e o S. delphini que foram colocados no Grupo do Staphylococcus intermedius (GSI). Em 1988, o S. delphini foi isolado, pela primeira vez, de ferida purulenta de golfinhos e raramente registrado desde lá. O tipo S. intermedius tem origem numa cepa de pombo, possui taxonomia distinta e não representativa da maioria dos isolados comumente identificados como S. intermedius no passado. A nova espécie descrita como S. pseudintermedius e não S. intermedius é a causa mais comum de infecções cutâneas em cães. Desde a reclassificação das espécies, foi proposto que toda a amostra isolada de cães fosse denominada de S. pseudintermedius, a menos que seja provado o contrário por métodos moleculares (Bannoehr et al 2007; Sasaki et al. 2007) CARACTERÍSTICAS CULTURAIS O S. pseudintermedius foi tradicionalmente identificado pela morfologia colonial e testes fenotípicos padronizados. As colônias são elevadas; de tamanho médio e despigmentadas; evidencia grande β hemólise e incompleta; completa e pequena δ hemólise, tanto só como combinadas no agar sangue (hemácias ovinos e bovinos). Entretanto, uma grande α hemólise completa não é observada nesta espécie e o uso de sangue eqüino não é recomendado no isolamento inicial, pois não há hemólise nesse meio. Um olho treinado pode, na maioria das vezes, diferenciar a morfologia colonial do S pseudintermedius do S. aureus que possui coloração e padrões hemolíticos variáveis assim como aquelas cepas coagulase negativas as quais são menores e geralmente não hemolíticas. A diferenciação definitiva das espécies coagulase negativas requerem o teste da coagulase em tubo. O S. pseudintermedius geralmente é negativo para o “clumping factor” em lâmina e o teste comercial de aglutinação em látex que detecta o clumping factor, proteína A e/ou antígeno de superfície do S. aureus. Consequentemente há o risco do S. pseudinteremdius ser falsamente identificado como ECN nos laboratório de diagnóstico humano, onde o laboratorista pode não estar famililiarizado com esta espécie e com os testes comerciais rotineiramente utilizados na rápida discriminação entre o S. aureus e os ECN. Os testes fenotípicos mais discriminatórios diferenciando o S. pseudintermedius das outras espécies de estafilococos isolados de cães incluem: coagulase, produção de acetoína, pirrolidonil arilamilase, β-galactosidase, resistência à polimixina B e acidificação do D-manitol, conforme a Quadro 1. Quadro1. Testes fenotípicos diferenciais entre membros do Grupo Estafilococos intermedius (GEI) e outras espécies do gênero Staphylococcus isolados de cães. Staphylococcus espécies Coagulase PYR* ΒGalactosidase** VP Polimixina B*** Prod. D- Manitol GEI(intermedius) + - + - S (d) S. aureus + - - + R + S. schleiferi d + (+) + S - S. epidermidis - - - + R - S. haemolyticus - + - + S d *Pirrolidonil arilamilase foi determinada pelo kit comercial recomendado na identificação de estreptococcus.**Atividade foi determinada pelos testes comerciais utilizando 2naftol-β-D-galactopiranosídeo como substrato. ***Resistência (R) foi definida como inibição de um Ø < 10 mm, utilizando disco de polimixina B de 300 Unidades. A identificação fenotípica do S. pseudintermedius foi complicada pelas recentes mudanças na taxonomia das espécies bem como pelo reconhecimento do S. schleiferi subsp. coagulans como patógeno em infecções de cães, especialmente nas otites externas. Os novos desafios na identificação das espécies foram acompanhados da necessidade de métodos padronizados de caracterização que torne possível a investigação epidemiológica e o monitoramento de linhagens resistentes à meticilina ou SPRM. A consequência foi o desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas na identificação de amostras e tipificação de linhagens do S. pseudintermedius nos últimos cinco anos (Tabela 2). Tabela 2. Métodos genotípicos e genômicos utilizados na identificação do S. pseudintermedius e tipagem de linhagens. S pseudintermedius Nome do Método Referências Espécie PCR-RFLP Bannoehr et al. 2009. MALDI-TOF MS Decristophoris et al. 2011. PCR Multiplex Sasaki et al. 2010. Tipagem linhagens PFGE Perreten et al. 2010. Ruscher et al. 2010. Black et al. 2009. Fazakerley et al. 2010. Soedarmanto et al. 2011. Vincze et al. 2010. Multilocus seq (4genes) Bannoehr et al. 2007. MLST (8genes) Solyman et al. 2011. SCCmec Kondo et al. 2007 spa typing Moodley et al. 2009 __________________________________________________________________________________________________________ A identificação fenotípica do S. pseudintermedius não pode ser diferenciada claramente dos outros membros do GEI. O S. intermedius pode ser diferenciado do S. pseudintermedius e do S. delphini fenotipicamente pela reação da arginina desidrolase (S. intermedius é negativo); produção de ácido pela β gentobiose em condições aeróbias (S. intermedius é positivo) e pelo D-manitol anaerobicamente (S. intermedius é positivo). O S. pseudintermedius e o S. delphini não podem ser diferenciados pelos testes fenotípicos pela falta de confiança nos testes comerciais e kits, Assim a identificação do S. pseudintermedius na rotina dos laboratórios atuais se baseia no fato de que as espécies do GEI exceto o S. pseudintermedius estão virtualmente ausentes em cães. Entretanto para a correta identificação das espécies do GEI é necessário métodos moleculares. O uso de meios cromogênicos (S. aureus Select e o S. aureus ID agar (SAID)/chrom ID) pode diferenciar o grupo GEI do S. aureus. O meio se cora de azul ou verde para as espécies do grupo GSI (em oposição aos outros estafilococos patogênicos) que combinados com a fermentação de açúcares possibilitam a identificação de espécies do GEI; já que o S. pseudintermedius é manitol negativo e trealose positivo; o S. delphini é manitol positivo e trealose negativo e o S. intermedius é manitol e trealose positivos. Um PCR-RFLP foi recentemente desenvolvido tendo como base um único site de restrição MboI do gene pta do S pseudintermedius que está ausente no S. intermedius e no S. delphini. Bannoehr e colaboradores examinaram 112 amostras de campo de ECP, incluindo 86 de origem canina foram testadas pelo PCR- RFLP e todas as cepas caninas, exceto uma foram identificadas como S. pseudintermedius (Bannoehr et al. 2009). As linhagens remanescentes mostraram um perfil de restrição do gene pta que indicou identidade com o S. aureus. Outros ECP alem do GEI podem ser isolados de cães, tais como o S. aureus e S. schleiferi subsp. coagulans. A identificação correta do S. schleiferi subsp. coagulans é problemática, pois os meios comerciais disponíveis não são direcionados à identificação deste patógeno canino. Segundo Chanchaithong e Prapasarakul, em 2011, as espécies coagulases positivas isoladas de cães podem ser diferenciadas pela PAGE-SDS e por testes
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