Fundamentos de Biologia Molecular Apostila

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS 
INSTITUTO DE BIOLOGIA 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
Fundamentos de Biologia Molecular 
 
 
 
 
Autores: 
 
 Profa. Dra. Carmen Veríssima Ferreira (UNICAMP) 
Profa. Dra. Fernanda Ramos Gadelha (UNICAMP) 
Prof. Dr. Alexandre D. Martins Cavagis (UFSCAR) 
Ms. Daisy Machado 
Dr. Antonio Hernandes Chaves-Neto 
 
 
- Campinas (SP) - 2010 
Fundamentos de Biologia Molecular 2
 
 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
Biologia molecular é a área de conhecimento que estuda diversos aspectos 
da função do material genético (genoma) e seus produtos de expressão, as 
proteínas. Na Disciplina Fundamentos de Biologia Molecular serão abordadas todas 
as etapas da informação gênica, além das aplicações da biologia molecular em 
diversos aspectos na área de saúde e finalmente, como alterações no fluxo da 
informação gênica podem causar patologias como câncer. 
O genoma caracteriza-se por toda a informação hereditária de um organismo 
que está codificada em seu DNA (ou, em alguns vírus, no RNA). Isto inclui tanto os 
genes como as sequências não-codificadoras (Figura 1). No ser humano o genoma 
é constituído de 23 cromossomos diferentes. O genoma é transmitido, com 
variações individuais, de geração em geração e determina a espécie do ser vivo. 
Desta forma, as doenças hereditárias também estão definidas no genoma. No caso 
específico dos humanos, a metade do genoma que se herda provém do pai e a outra 
metade, da mãe. No contexto químico, o genoma é definido pela seqüência de 
desoxiribonucleotídeos na molécula do ácido desoxiribonucléico (DNA). 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Representação simplificada de um cromossomo. O cromossomo é 
constituído de duas cromátides, cada uma contendo uma dupla fita de ácido 
desoxiribonucléico. No cromossomo existem seqüências codificantes e não 
codificantes (como por exemplo, os íntrons) 
Fundamentos de Biologia Molecular 3
 
 
ÁCIDOS NUCLEICOS 
 
A elucidação da estrutura tridimensional de proteínas, de ácidos nucleicos e 
outras biomoléculas bem como a elucidação do fluxo de informação do gene à 
proteína, o esclarecimento das vias metabólicas centrais e dos mecanismos de 
conversão de energia, tem contribuído muito, nos últimos anos, para a nossa 
compreensão da base molecular da vida. Nesta disciplina abordaremos como 
organismos tão diferentes quanto à bactéria Escherichia coli e os seres humanos 
utilizam os mesmos blocos de construção para fabricar macromoléculas. 
As proteínas, diferentemente das outras macromoléculas lipídeos e 
polissacarídeos, não são sintetizadas através da ligação pura e simples de seus 
monômeros constituintes, os aminoácidos. No caso das proteínas, os aminoácidos 
são ligados uns aos outros obedecendo a uma ordem, cuja informação está contida 
em uma outra classe de macromoléculas denominadas ácidos nucleicos (DNA e 
RNA). 
A informação genética para sintetizar uma proteína com uma sequência 
correta de aminoácidos está contida no DNA, através da sequência correta de seus 
monômeros, os desoxirribonucleotídeos. Esta informação genética ou gênica é 
passada de uma geração para outra, através de um processo denominado 
replicação. Esta informação passa do DNA para o RNA através de um processo 
denominado transcrição. Finalmente, a informação contida no RNA, através da 
sequência de seus nucleotídeos constituintes é passada para a proteína, em um 
processo denominado tradução, que é a própria síntese protéica (Figura 2). 
 
Fundamentos de Biologia Molecular 4
 
 
 
Figura 2. Fluxo da informação gênica. O gene é transcrito dando origem a um 
RNA primário, o qual para ter sua função biológica necessita sobre modificações 
pós-transcrição se tornando maduro (funcional). Em seguida, o RNAm se translocará 
para os ribossomos e será traduzido pela maquinaria responsável pela síntese 
protéica. Alguns proteínas após serem sintetizadas já se encontram na forma ativa, 
outras necessitam sofrer modificações pós-tradução para poderem exercer a função 
biológica. 
 
 
 
Transcrito primário 
RNAm 
Proteína inativa 
Proteína ativa 
TRANSCRIÇÃO 
MODIFICAÇÃO 
PÓS-TRANSCRIÇÃO 
MODIFICAÇÃO 
PÓS-TRADUÇÃO 
TRADUÇÃO 
Fundamentos de Biologia Molecular 5
Para se entender melhor todos estes processos, devemos conhecer um 
pouco sobre os constituintes dos ácidos nucleicos, os desoxirribonucleotídeos e os 
ribonucleotídeos, monômeros constituintes de DNA e de RNA, respectivamente. 
 
I. ESTRUTURA E SÍNTESE DO DNA 
 
Os ácidos nucleicos são requeridos para o armazenamento e expressão da 
informação genética. Existem dois tipos quimicamente distintos de ácidos nucleicos: 
DNA (ácido desoxirribonucléico) e o RNA (ácido ribonucléico). 
O DNA está presente não somente nos cromossomos no núcleo dos 
organismos eucarióticos, mas também na mitocôndria e nos cloroplastos de 
vegetais. As células procarióticas, que não possuem núcleo, possuem um 
cromossomo único, mas também podem conter DNA não-cromossômico em forma 
de plasmídeo. O DNA é responsável pela codificação das informações, sendo capaz 
não somente de replicar-se precisamente cada vez em que a célula se divide, como 
também fazer com que a informação que contém seja expressa seletivamente. 
O RNA participa na expressão da informação genética armazenada no DNA. 
O RNA difere do DNA por apresentar uma molécula polimérica simples de 
mononucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster. O DNA é consideravelmente 
maior que o RNA e contém o açúcar desoxirribose em vez de ribose e a base 
nitrogenada timina em vez de uracil. 
O DNA é um polidesoxirribonucleotídeo constituído de 
monodesoxirribonucleotídeos covalentemente unidos por ligações 3’,5’-fosfodiéster 
(o grupo 5’-hidroxila da desoxipentose de um nucleotídeo liga-se ao grupo 3’-
hidroxila da desoxipentose de outro nucleotídeo através de um grupo fosfato), e as 
bases nitrogenadas localizadas junto ao esqueleto de desoxirribose-fosfato, são por 
convenção, escrita em sequência do 5’-terminal da cadeia ao 3’-terminal (Figura 3). 
 
 
Fundamentos de Biologia Molecular 6
 
 
 
 
 
 Ligação de hidrogênio entre as bases nitrogenadas 
 
 
 
 
 
Figura 3: A Cadeia de DNA dupla fita, com a seqüência de nucleotídeos mostrada 
sendo escrita na direção 5’-3’. Uma ligação 3’-5’ fosfodiéster é destacada. As bases 
A e T estão ligadas por duas pontes de H, e as bases C e G, por tres pontes de H. 
Observar que o terminal 5’ encontra-se fosforilado e o terminal 3’ possui um 
grupamento hidroxila (OH) livre. 
 
 C 5’ 
C 3’ 
C 5’ 
C 3’ 
Ligação 
fosfodiéster 
3’ 
5’ 
3’ 
5’ 
Fundamentos de Biologia Molecular 7
Com exceção de uns poucos vírus que contêm DNA de fita simples, o DNA 
existe como uma molécula de fita dupla, formando uma dupla hélice. Na dupla 
hélice, as duas cadeias são dobradas em torno de um eixo comum, sendo pareadas 
de modo antiparalelo – isto é, o 5’-terminal de uma fita é pareado com o 3’-terminal 
de outra fita. As bases de uma fita são pareadas de acordo com as bases da 
segunda fita, de modo que uma Adenina (A) é sempre pareada com a Timina (T), 
enquanto a Citosina (C) é sempre pareada com a Guanina (G). Assim, uma cadeia 
polinucleotídica da dupla hélice de DNA é sempre o complemento da outra (Figura 
4). 
 
 
 
 
Figura 4: Dupla Hélice do DNA. A dupla hélice do DNA é mantida por interações 
fracas tais como: pareamento das bases por ligações de hidrogênio, interações 
hidrofóbicas, interações iônicas e interações de Van der Waals. Outro ponto que 
pode ser observado é que as fitas sempre estarão na forma antiparalelas e são 
complementares (G e C; A eT). 
 
 
Fundamentos de Biologia Molecular 8
Desnaturação de DNA - Efeitohipercrômico 
 
O DNA pode ser desnaturado pela adição de ácidos, bases, remoção de 
Mg2+, ou pelo calor. Na desnaturação do DNA pelo calor, as duas fitas se separam, 
no entanto, caso haja resfriamento, as duas fitas podem voltar a se parear (processo 
chamado de renaturação) (Figura 5A). 
A desnaturação de uma molécula de DNA pela temperatura pode ser 
acompanhada por um parâmetro denominado por temperatura de fusão (Tm), que 
corresponde a ponto de equivalência na curva de fusão do DNA (gráfico de A260 em 
função da temperatura), a absorbância a 260 nm (A260) também aumenta, mostrando 
um perfil semelhante ao de uma curva de titulação ácido-base. Este comportamento 
consiste no chamado efeito hipercrômico, onde a A260 do DNA dupla fita nativo é 
menor que a soma das A260 dos nucleotídeos constituintes, devido às interações 
(van der Waals e hidrofóbicas) entre as bases empilhadas no DNA desnaturado, 
promovendo nuvens eletrônicas distintas das existentes no DNA nativo (Figura 5B). 
Devido aos diferentes conteúdos dos DNAs temos diferentes valores de 
temperaturas de fusão. Assim, por exemplo, a Tm de um DNA viral pode ser maior 
que a Tm de um DNA de bactérias. Como a desnaturação do DNA consiste na 
abertura das duas fitas, que são mantidas pareadas por pontes de hidrogênio, e 
sabendo-se que o pareamento A-T envolve duas pontes e G-C, três pontes, um DNA 
com maior conteúdo de G e C, terá uma temperatura de fusão maior. A 
determinação da Tm de um DNA pode fornecer uma estimativa de sua composição 
de bases. Com aumento controlado da temperatura é possível abrir uma região rica 
em A-T, sem comprometer a abertura de trechos ricos em G-C. A Figura 5C mostra 
diferentes perfis de desnaturação do DNA da E. coli e do M. phlei. De acordo com as 
curvas, podemos supor que o conteúdo de C e G do M. phlei é maior que o da E. 
coli, pois a temperatura necessária para que o DNA deste último seja desnaturado, é 
maior. 
 
Fundamentos de Biologia Molecular 9
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Desnaturação do DNA. (a) Desnaturação e renaturação do DNA; (B) 
Efeito hipercrômico; (C) DNAs de fontes diferentes podem requerer temperaturas 
diferentes para causar desnaturação dos mesmos. As curvas mostras em (C) 
sugerem que o conteúdo de C e G do M. phlei é maior que na E. coli, por isto é 
necessária uma temperatura maior, para observamos aumento da absorbância a 
260 nm. 
 
 
 
 
 
Calor
Resfriamento
lento
DNA nativo (dupla fita) DNA desnaturado
A
B C
Calor
Resfriamento
lento
DNA nativo (dupla fita) DNA desnaturado
A
B C
Fundamentos de Biologia Molecular 10 
 
REPLICAÇÃO DO DNA 
 
Os mecanismos que regulam a replicação do DNA e a divisão celular estão 
relacionados. A replicação e o ciclo celular devem ser conectados de tal forma que a 
frequência dos ciclos de replicação se ajuste à velocidade do crescimento da célula 
e o término da replicação seja relacionado à divisão celular. Devem existir, portanto, 
sinais celulares para o crescimento da célula, tais como velocidade de síntese 
protéica, resposta à falta de aminoácidos ou fontes de carbono, que induzem os 
ciclos de eventos da divisão celular. 
Em células eucarióticas, o processo de replicação do DNA ocorre durante a 
fase do ciclo celular denominada período de síntese (S). A replicação apresenta 
algumas características típicas: a) a replicação ocorre de forma semiconservativa; b) 
requer um grande consumo de energia, na forma de nucleotídeos trifosfatados (ATP, 
GTP, CTP e TTP); c) a reação catalisada pela DNA polimerase (enzima responsável 
para unir um nucleotídeo ao outro) se dá no sentido 5’ para 3’. 
 
Replicação é semiconservativa 
 
A hipótese Watson-Crick propõe que cada fita de dupla hélice do DNA seja 
usada como um molde para a replicação das fitas-filhas complementares. Desta 
forma, duas moléculas de fitas duplas de DNA, idênticas ao DNA parental, serão 
formadas, cada uma contendo uma fita intacta do DNA parental (Figura 6). 
 
 
 
Figura 6: Replicação Semiconservativa do DNA. Após a replicação, a dupla hélice 
formada conterá uma fita parental pareada com a fita recém-sintetizada (fita nova) 
 
Fundamentos de Biologia Molecular 11
 
Etapas na Síntese do DNA 
 
1) Início da Replicação 
 
A. Separação das duas fitas de DNA complementares: 
 
Para que as duas fitas da dupla hélice parental de DNA sejam replicadas, 
elas devem ser primeiramente separadas, pois as polimerases usam somente DNA 
fita simples como molde. Nos procarióticos, a replicação do DNA inicia em uma 
sequência de nucleotídeos específica que representa a origem única de replicação. 
Nos eucarióticos, a replicação inicia em múltiplos sítios (origens de replicação) ao 
longo da hélice de DNA. Estes sítios incluem sequência curtas de pares de bases 
AT. 
 
B. Formação da zona de replicação 
 
A medida que as duas fitas se desenrolam e se separam, formam uma 
região parecida com um “V” designada forquilha de replicação, onde as proteínas 
que participarão da síntese da fita nova, incluindo a DNA polimerase, irão se ligar. A 
partir da origem, a replicação prossegue ao longo da fita de DNA. A replicação do 
DNA de dupla fita é bidirecional e a forquilha de replicação se move em ambas as 
direções a partir da origem. 
Algumas proteínas são requeridas para o reconhecimento da origem de 
replicação e/ forquilha de replicação, formando um Complexo. Proteínas estas que 
são responsáveis por manter a separação das fitas parentais (fitas que serão 
utilizadas como molde) e por desenrolar a dupla hélice. Estas proteínas incluem 
(Figura 7): 
- Proteína DNA: é responsável pela separação das fitas, formando regiões 
localizadas de DNA de fita simples. 
- DNA Helicases: Enzimas que tem como função a quebra das pontes de 
hidrogênio entre as bases, separando as duas fitas de DNA. As helicases requerem 
energia, fornecida pelo ATP. 
- Proteínas SSB ou proteínas que se ligam à DNA fita simples: Também 
denominadas de proteínas desestabilizadoras da hélice, ligam-se somente em DNA 
Fundamentos de Biologia Molecular 12 
fita simples impedindo o “repareamento” da dupla fita. A presença de proteínas SSB, 
durante a replicação, é extremamente importante, pois evitam que regiões 
despareadas sofram torções. Desta forma, as SSBs garantem uma conformação do 
DNA ideal para a replicação e pareamento da fita recém sintetizada, além de 
proteger as fitas simples de degradação por nucleases. 
- Topoisomerases: são enzimas que promovem quebras transitórias nas 
ligações fosfodiésteres, gerando uma forma intermediária, onde a proteína 
permanece ligada covalentemente ao DNA, permitindo que as fitas do DNA passem 
umas sobre as outras, alterando, assim, o superenrolamento da molécula. 
 
 
Figura 7: Proteínas responsáveis por manter separação das fitas parentais e 
desenrolar da hélice dupla adiante da zona de replicação avançada. 
 
 
 
5'
5'
3'
3'
DNA Girase
Helicase
Direção do movimento da 
forquilha de replicação
Proteínas que se ligam ao
DNA simples fita (SSB)
SSB
Fita líder (contínua)
Fita seguidora
(descontínua)
Fundamentos de Biologia Molecular 13 
 
2) Adição do primer 
As DNA polimerases (enzimas responsáveis pela síntese da nova fita do 
DNA) não podem iniciar a síntese de uma fita complementar através de um molde 
totalmente composto de fita simples. Elas requerem um primer ou iniciador que são 
regiões curtas de RNA sintetizadas pela DNA primase ou iniciase (uma RNA 
polimerase), estes primers são complementares e antiparalelos ao molde de DNA. A 
fita contínua necessita somente de um primer inicial enquanto a fita descontínua 
utilizavários primers (Figura 7). 
 
3) Elongação 
 
DNA polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA, 
possuindo a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH, 
possibilitando o crescimento da cadeia no sentido 5’-3’. São constituídas de três 
tipos: DNA polimerase I, DNA polimerase II e DNA polimerase III. 
- DNA poli I: possui atividades de síntese (DNA polimerase) e atividade de 
degradação 5’-3’ exonuclease, sendo capaz de remover hidroliticamente o primer de 
RNA e atividade 3’-5’ exonuclease, importante para que a replicação ocorra livre de 
erro (Figura 6). 
- DNA poli II: sua principal função em extratos celulares está relacionado aos 
processos de reparo do DNA. 
- DNA poli III: é a principal enzima responsável pelo elongamento da cadeia 
do DNA em procariotos, possuindo atividade de síntese e degradação. 
As DNA polimerases responsáveis por copiar o molde de DNA somente são 
capazes de ler as seqüências de nucleotídeos no sentido 3’-5’, polimerizando a fita 
em direção oposta ao sentido da zona de replicação 5’-3’(continua). Esta fita que 
está sendo copiada na direção da zona de replicação é denominada Fita Líder e a 
outra fita que está sendo sintetizada na direção oposta (5’- 3’) de modo descontínuo, 
é Fita secundária. A fita secundária é sintetizada descontinuamente, em fragmentos 
curtos de DNA, denominados de Fragmentos de Okazaki (Figura 8). 
 
O alongamento da cadeia de DNA é catalisada pela DNA polimerase III, 
utilizando o grupo 3’-hidroxila do primer de RNA como aceptor do primeiro 
desoxirribonucleotídeo. A DNA polimerase III começa a adicionar os nucleotídeos ao 
Fundamentos de Biologia Molecular 14 
longo do molde de fita única, que especifica a sequência de bases da cadeia recém-
sintetizada (Figura 9). À medida que o nucleotídeo está sendo adicionado, a DNA 
polimerase III faz correção (atividade 3’-5’ exonuclease). É importante para a 
sobrevivência dos organismos que a sequência de nucleotídeos seja replicada com 
mínimo de erros, para evitar mutações. 
A DNA polimerase III continua a sintetizar o DNA até ser bloqueada pela 
proximidade ao primer de RNA. Quando isso ocorre, o RNA é excisado e a lacuna 
preenchida pela DNA polimerase I que remove os nucleotídeos de RNA. A ligação 
fosfodiéster final entre o grupo 5’-hidroxila na cadeia de DNA sintetizada pela DNA 
polimerase III e o grupo 3’-hidroxila da cadeia feita pela DNA polimerase I é 
catalizada pela DNA-ligase. A junção destas duas fitas de DNA requer energia, a 
qual, em seres humanos, é fornecida pela clivagem de ATP em AMP+2Pi. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8: Alongamento das fitas líder e secundária. 
5'
5'
3'
3'
3'5'
DNA Girase
Helicase
Direção do movimento da 
forquilha de replicação
Proteínas que se ligam ao
DNA simples fita (SSB)
SSB DNA primase
RNA iniciador
RNA iniciador
DNA polimer.III
DNA Polimer. I
DNA ligase
Fita líder (contínua)
Fita seguidora
(descontínua)
 
 
 
Figura 9: Formação da ligação fosfodiéster catalisada pela DNA polimerase.
 
Fundamentos de Biologia Molecular
Formação da ligação fosfodiéster catalisada pela DNA polimerase.
O grupo hidroxila livre, no C 3’, do 
primeiro nucleotídeo, através de seu par de 
elétrons, ataca o grupamento fosfato 
(substituição nucleofílica) do
nucleotídeo, no C 5’, que se encontra com 
carga parcialmente positiva, devido ao 
deslocamento de elétrons para o oxigênio, 
mais eletronegativo
Liberação do grupamento 
pirofosfato 
Formação da ligação fosfodié
entre o oxigênio do C3’ do primeiro 
nucleotídeo, e o oxigênio do C5’ do 
segundo nucleotídeo. 
O dinucleotídeo formado possui uma 
hidroxila livre no C 3’, necessário 
para a formação da próxima ligação 
fosfodiester. 
Fundamentos de Biologia Molecular 15 
Formação da ligação fosfodiéster catalisada pela DNA polimerase. 
O grupo hidroxila livre, no C 3’, do 
primeiro nucleotídeo, através de seu par de 
elétrons, ataca o grupamento fosfato 
(substituição nucleofílica) do segundo 
nucleotídeo, no C 5’, que se encontra com 
carga parcialmente positiva, devido ao 
deslocamento de elétrons para o oxigênio, 
mais eletronegativo. 
Liberação do grupamento 
Formação da ligação fosfodiéster, 
entre o oxigênio do C3’ do primeiro 
nucleotídeo, e o oxigênio do C5’ do 
segundo nucleotídeo. 
O dinucleotídeo formado possui uma 
hidroxila livre no C 3’, necessário 
para a formação da próxima ligação