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4 Anatomia funcional das células eucariotas Resumo I - Microbiologia Tortora As células procarióticas e eucarióticas são similares em sua composição e reações químicas. As células procarióticas não possuem organelas revestidas por membrana ( estando ausente inclusive o núcleo). O peptídeo-glicano é encontrado nas paredes celulares procarióticas, mas não nas paredes celulares eucarióticas. As células eucarióticas possuem um núcleo limitado por uma membrana e outras organelas. Eucariotos Flagelos e cílios Os flagelos são poucos e longos em relação ao tamanho da célula; os cílios são menores e curtos. Os flagelos e os cílios são usados para a motilidade, e os cílios também movem substâncias ao longo da superfície das células. Ambos os flagelos e os cílios consistem de um arranjo de nove pares e de dois microtúbulos isolados. A parede celular e o glicocálice As paredes celulares de muitas algas e alguns fungos contêm celulose. O principal material das paredes celulares fúngicas é a quitina. As paredes celulares fúngicas consistem de glicana e manana. As células animais são circundadas por um glicocálice, que reforça a célula e fornece um meio de fixação para outras células. A membrana plasmática Assim como a membrana plasmática procariótica, a membrana plasmática eucariótica é uma camada dupla de fosfo-lipídeos contendo proteínas. As membranas plasmáticas eucarióticas contêm carboidratos aderidos a proteínas e esteróis não encontrados nas células procarióticas (exceto nas bactérias Mycoplasma). As células eucarióticas podem mover materiais através da membrana plasmática pelos processos passivos usados pelos procariotos, além do transporte ativo e da endocitose (fagocitose e pinocitose). Citoplasma O citoplasma das células eucarióticas inclui tudo que está dentro da membrana plasmática e que é externo ao núcleo. As características químicas do citoplasma das células eucarióticas lembram as do citoplasma das células procarióticas. O citoplasma eucariótico tem um cito-esqueleto e exibe corrente citoplasmática. Organelas As organelas são estruturas especializadas revestidas de membrana no citoplasma das células eucarióticas. O núcleo, que contém DNA em forma de cromossomos, é a organela eucariótica mais característica. O envelope nuclear está conectado a um sistema de membranas no citoplasma, denominado retículo endoplasmático. O RE fornece uma superfície para reações químicas, serve como uma rede de transporte e armazena as moléculas sintetizadas. A síntese proteica e o transporte ocorrem no RE rugoso; a síntese de lipídeos ocorre no RE liso. Os ribossomos 80S são encontrados no citoplasma ou aderidos ao RE rugoso. Os complexos de Golgi consistem de sacos achatados denominados cisternas. Eles atuam na formação da membrana e secreção de proteínas. Os lisossomos são formados a partir dos complexos de Golgi. Eles armazenam poderosas enzimas digestivas. Os vacúolos são cavidades revestidas por membrana, derivadas dos complexos de Golgi ou endocitose. Eles são geralmente encontrados em células de plantas, que armazenam várias substâncias, ajudam a trazer o alimento para dentro da célula, aumentam o tamanho das células e fornecem rigidez para as folhas e caules. As mitocôndrias são os locais primários de produção de ATP. Elas contêm ribossomos 70S e DNA, e se multiplicam por fissão binária. Os cloroplastos contêm clorofila e enzimas para a fotossíntese. Assim como as mitocôndrias, eles contêm ribossomos 70S e DNA, e se multiplicam por fissão binária. Uma variedade de componentes orgânicos são oxidados nos peroxissomos. A catalase nos peroxissomos destrói a H2O2. O centrossomo é constituído pelo material peri-centriolar e os centríolos. Os centríolos são 9 microtúbulos triplos envolvidos na formação do fuso mitótico e dos microtúbulos. A evolução dos eucariotos - De acordo com a teoria endossimbiótica, as células eucarióticas evoluíram de procariotos simbióticos vivendo dentro de outras células procarióticas. Anatomia funcional das células procariotas Resumo I – Microbiologia Tortora As células procarióticas e eucarióticas são similares em sua composição e reações químicas. As células procarióticas não possuem organelas revestidas por membrana ( estando ausente inclusive o núcleo). O peptídeo-glicano é encontrado nas paredes celulares procarióticas, mas não nas paredes celulares eucarióticas. As células eucarióticas possuem um núcleo limitado por uma membrana e outras organelas. Procariotos As bactérias são unicelulares e a maioria delas se multiplica por fissão binária. As espécies bacterianas são diferenciadas pela morfologia, pela composição química, pelas necessidades nutricionais, pelas atividades metabólicas e pela fonte de energia. A maioria das bactérias tem de 0,2 a 2 micrômetros de diâmetro e de 2 a 8 micrômetros de comprimento. As três formas bacterianas básicas são cocos (esféricos), bacilos (forma de bastão) e espirais. As bactérias pleomórficas podem assumir várias formas. Glicocálice O glicólise (cápsula, camada viscosa ou poli-sacarídeo extra-celular) é um poli-sacarídeo gelatinoso e/ou revestimento poli-peptídico. As cápsulas podem proteger os patógenos da fagocitose. As cápsulas permitem a adesão a superfícies, impedem a dessecação e podem fornecer nutrientes. Flagelos Os flagelos são apêndices filamentosos relativamente longos consistindo de um filamento, alça e corpo basal. Os flagelos procarióticos rotam para empurrar a célula. As bactérias móveis apresentam taxia; taxia positiva é o movimento em direção a um atraente, e taxia negativa é o movimento para longe de um repelente. A proteína flagelar (H) atua como um antígeno. Filamentos axiais As células espirais que se movem por meio de um filamento axial (endo-flagelo) são denominadas espiroquetas. Os filamentos axiais são similares aos flagelos, exceto que eles se enovelem em torno da célula. Fímbrias e Pili As fímbrias e pili são apêndices curtos e delgados. As fímbrias auxiliam as células a aderirem ás superfícies. Os pili unem as células para a transferência de DNA de uma célula para outra. A Parede celular Composição e características A parede celular circunda a membrana plasmática e protege a célula das alterações na pressão de água. A parede celular bacteriana consiste de peptídeo-glicana, um polímero composto de NAG e NAM e cadeias curtas de aminoácidos. A penicilina interfere com a síntese de peptídeo-glicana. As paredes celulares gram-positivas consistem de muitas camadas de peptídeo-glicanas e também contêm ácidos teicoicos. As bactérias gram-negativas possuem uma membrana externa de lipoproteína- lipopolissacarídeo-fosfolipídeo, circundando uma fina camada de peptídeo-glicana. A membrana externa protege a célula da fagocitose e da penicilina, lisozima e de outras substâncias químicas. As porinas são proteínas que permitem ás moléculas pequenas passar através da membrana externa; proteínas específicas permitem que outras moléculas se movam através da membrana externa. O componente lipo-polissacarídico da membrana externa consiste de açúcares (polissacarídeos O) que atuam como antígenos e de lipídeo A, que é uma endo-toxina. Paredes celulares e mecanismos de coloração de Gram O complexo cristal violeta-iodo se combina a peptídeo-glicana. O descolorante remove o lipídeo da membrana externa das bactérias gram-negativas e lava a violeta de genciana. Paredes celulares atípicas O Mycoplasma é um gênero bacteriano que não apresenta paredes celulares naturalmente. As arquibactérias possuem pseudo-mureína; elas não apresentam peptídeo-glicanas. Dano á parede celular Em presença de lisozima, as paredes celulares gram-positivas são destruídas e o conteúdo celular restante é denominado protoplasto. Em presença de lisozima, as paredes celulares gram-negativas não são completamente destruídas e o conteúdo celular restante é denominado esferoplasto. As formas L são bactérias gram-positivas ou gram-negativas que não produzem uma parede celular. Os antibióticos como a penicilina interferem com a síntese da parede celular. Estruturas internas á parede celular A membrana plasmática (citoplasmática) A membrana plasmática reveste o citoplasma e é uma camada dupla de fosfo-lipídeo com proteína (modelo de mosaico fluido). A membrana plasmática é seletivamente permeável. As membranas plasmáticas conduzem enzimas para reações metabólicas, como a degradação dos nutrientes, a produção de energia e a fotossíntese. Os mesossomos, dobras irregulares da membrana plasmática, são artefatos, não estruturas celulares verdadeiras. As membranas plasmáticas podem ser destruídas por álcoois e polimixinas. O movimento através da membrana pode ser por processos passivos, em que os materiais se movem de áreas de maior concentração para menor concentração, sem gasto de energia pela célula. Na difusão simples, as moléculas e os íons se movem até o equilíbrio ser atingido. Na difusão facilitada, as substâncias são transportadas por proteínas transportadoras através das membranas, de áreas de alta para baixa concentração. Osmose é o movimento de água de áreas de alta para baixo concentração, através de uma membrana seletivamente semi-permeável, até o equilíbrio ser atingido. No transporte ativo, os materiais se movem das áreas de baixa para alta concentração através das proteínas transportadoras, e a célula precisa gastar energia. Na translocação de grupo, a energia é gasta para modificar as substâncias químicas e as transportar através da membrana. Citoplasma Citoplasma é o componente líquido dentro da membrana plasmática. O citoplasma é principalmente água, com moléculas inorgânicas e orgânicas, DNA, ribossomos e inclusões. A área nuclear A área nuclear contém o DNA do cromossomo bacteriano As bactérias também podem conter plasmídeos, que são moléculas circulares de DNA extra- cromossômicos. Ribossomos O citoplasma de um procarioto contém numerosos ribossomos 70S; os ribossomos consistem de rRNA e proteína. A síntese proteica ocorre nos ribossomos ela pode ser inibida por certos antibióticos. Inclusões Inclusões são depósitos de reserva encontrados nas células procarióticas e eucarióticas. Entre as inclusões encontradas nas bactérias, estão os grânulos metacromáticos (fosfato inorgânico), os grânulos de poli-sacarídeos (normalmente glicogênio ou amido), inclusões lipídicas, os grânulos de enxofre, os carboxissomos (ribulose 1,5-difosfato carboxilase), os magnetossomos (Fe3O4) e os vacúolos de gás. Endosporos Os endosporos são estruturas de repouso, formadas por algumas bactérias para a sobrevivência durante condições ambientais diversas. O processo de formação de endosporos é denominando esporulação; o retorno de um endosporo a seu estado vegetativo é denominado germinação. 5 Metabolismo microbiano Resumo I – Microbiologia Tortora Reações catabólicas e anabólicas A soma de todas as reações químicas em um organismo vivo é conhecida como metabolismo. Catabolismo se refere ás reações químicas que resultam na quebra de moléculas orgânicas mais complexas em substâncias mais simples. As reações catabólicas geralmente liberam energia. Anabolismo se refere ás reações químicas em que substâncias simples são combinadas para formar moléculas mais complexas. As reações anabólicas geralmente requerem energia. A energia das reações catabólicas é utilizada para conduzir as reações anabólicas. A energia para as reações químicas é armazenada em ATP. Enzimas Enzimas são proteínas, produzidas por células vivas, que catalisam reações químicas pela diminuição da energia de ativação. Enzimas são geralmente proteínas globulares com formas tri-dimensionais características. Enzimas são eficientes, podem atuar em temperaturas relativamente baixas e estão sujeitas a vários controles celulares. Nomenclatura das enzimas A maioria das enzimas são holo-enzimas, consistindo de uma porção proteica (apo-enzima) e uma porção não-proteica (co-fator). O co-fator pode ser um íon metálico (ferro, cobre, magnésio, manganês, zinco, cálcio e cobalto) ou uma molécula orgânica complexa conhecida como co-enzima (NAD+, NADP+, FMN, FAD e co-enzima A). O mecanismo de ação enzimática Quando uma enzima e um substrato se combinam, o substrato é transformado e a enzima é recuperada. Enzimas são caracterizadas pela especificidade, que é uma função de seus sítios ativos. Fatores que influenciam a atividade enzimática A altas temperaturas, as enzimas sofrem desnaturação e perdem suas propriedades catalíticas; a baixas temperaturas, a taxa de reação diminui. O pH em que a atividade da enzima é máxima é conhecido como pH ótimo. Dentro de limites, a atividade enzimática aumenta com o aumento da concentração do substrato. Inibidores competitivos competem com o substrato normal pelo sítio ativo da enzima. Os inibidores não-competitivos atuam em outras partes da apo-enzima (parte proteica) ou no co-fator e diminuem a capacidade da enzima de se combinar com o substrato normal. Inibição por retro-alimentação A inibição por retro-alimentação ocorre quando o produto final de uma via metabólica inibe uma atividade da enzima quase no começo da via. Ribozimas As ribozimas são moléculas de RNA que cortam e religam RNA em células eucarióticas. Produção de energia Reações de oxidação-redução Oxidação é a remoção de um ou mais elétrons de um substrato. Os prótons (H+) são frequentemente removidos com os elétrons. A redução de um substrato se refere ao ganho de um ou mais elétrons. Cada vez que um substrato é oxidado, um outro é simultaneamente reduzido. NAD+ é a forma oxidada; NADH é a forma reduzida. Glicose é uma molécula reduzida; a energia é liberada durante a oxidação da glicose na água. A geração de ATP A energia liberada durante certas reações metabólicas pode ser capturada para formar ATP a partir de ADP e P (fosfato). A adição de um P a uma molécula é chamada de fosforilação. Durante a fosforilação em nível de substrato, um P de alta energia de um intermediário no catabolismo é adicionado ao ADP. Durante a fosforilação oxidativa, a energia liberada como elétrons é passada a uma série de aceptores de elétrons (uma cadeia transportadora de elétrons) e finalmente ao O2 ou outro composto inorgânico. Durante a foto-fosforilação, a energia da luz é capturada pela clorofila, e elétrons são passados por meio de uma série de aceptores de elétrons. O elétron transferido libera a energia utilizada para a síntese de ATP.Vias metabólicas de produção de energia Uma série de reações químicas catalisadas enzimaticamente denominadas vias metabólicas armazena e libera energia a partir de moléculas orgânicas. Catabolismo de carboidratos A maior parte da energia de uma célula é produzida a partir da oxidação de carboidratos. A glicose é o carboidrato mais comumente utilizado. Os dois principais tipos de catabolismo de glicose são a respiração, em que a glicose é completamente quebrada, e a fermentação, em que ela é parcialmente quebrada. Glicólise A via mais comum para a oxidação da glicose é a glicólise. O ácido pirúvico é o produto final. Dois ATPs e duas moléculas de NADH são produzidas a partir de uma molécula de glicose. Alternativas á glicólise A via pentose fosfato é utilizada para metabolizar açúcares de cinco carbonos; um ATP e 12 moléculas de NADPH são produzidos a partir de uma molécula de glicose. A via Entner-Doudoroff rende um ATP e duas moléculas de NADPH a partir de uma molécula de glicose. Respiração celular Durante a respiração, moléculas orgânicas são oxidadas. Energia é gerada a partir da cadeia de transporte de elétrons. Na respiração aeróbica, O2 funciona como o aceptor final de elétrons. Na respiração anaeróbica, o aceptor final de elétrons é uma molécula inorgânica que não o O2. Respiração aeróbica O clico de Krebs A descarboxilação do ácido pirúvico produz uma molécula Co2 e um grupo acetil. Grupos acetil de dois carbonos são oxidados no ciclo de Krebs. Elétrons são capturados pelo NAD+ e FAD para a cadeia de transporte de elétrons. A partir de uma molécula de glicose, a oxidação produz seis moléculas de NADH, duas moléculas de FADH2 e duas moléculas de ATP. A descarboxilação produz seis moléculas de CO2. A cadeia (sistema) de transporte de elétrons Os elétrons são conduzidos á cadeia de transporte de elétrons pelo NADH. A cadeia de transporte de elétrons consiste de transportadores, incluindo flavo-proteínas, citocromos e ubiquinas. O mecanismo quimiosmótico de geração de ATP Prótons sendo bombeados através da membrana geram uma força próton motivo enquanto os elétrons se movem por meio de uma série de aceptores ou transportadores. A energia produzida a partir do movimento dos prótons pela membrana é utilizada pela ATPsintase para fazer ATP a partir de ADP e P. Em eucariotos, transportadores de elétrons estão localizados na membrana mitocondrial interna; em procariotos, transportadores de elétrons estão na membrana plasmática. Um resumo da respiração aeróbica Em procariotos aeróbicos, 38 moléculas de ATP podem ser produzidas pela oxidação completa de uma molécula de glicose na glicólise, no ciclo de Krebs e na cadeia de transporte de elétrons. Em eucariotos, 36 moléculas de ATP são produzidas da oxidação completa de uma molécula de glicose. Respiração anaeróbica Os aceptores finais de elétrons na respiração anaeróbica incluem NO3-, (SO4)2- e (CO3)2-. O rendimento total de ATP é menor que na respiração aeróbica porque somente parte do ciclo de Krebs trabalha sobre condições anaeróbicas. Fermentação A fermentação libera energia de açúcares ou outras moléculas orgânicas através da oxidação. O2 não é necessário para a fermentação. Duas moléculas de ATP são produzidas pela fosforilação em nível de substrato. Elétrons removidos do substrato reduzem NAD+. O aceptor final de elétrons é uma molécula orgânica. Na fermentação do ácido lático, ácido pirúvico é reduzido pelo NADH a ácido lático. Na fermentação alcoólica, acetaldeído é reduzido pelo NADH para produzir etanol. Fermentadores heteroláticos podem utilizar a via pentose fosfato para produzir ácido lático e etanol. Catabolismo de lipídeos e de proteínas As lipases hidrolisam lipídeos em glicerol e ácidos graxos. Ácidos graxos e outros hidrocarbonetos são catabolizados através da beta-oxidação. Produtos catabólicos podem ser posteriormente quebrados na glicólise e no ciclo de Krebs. Antes de os aminoácidos poderem ser catabolizados, ele devem ser convertidos em várias substâncias que entram no ciclo de Krebs. Reações de trans-aminação, descarboxilação e desidrogenização convertem os aminoácidos para serem catabolizados. Testes bioquímicos de identificação bacteriana Bactérias e leveduras podem ser identificadas pela detecção da ação de suas enzimas. Testes de fermentação são utilizados para determinar se um organismo pode fermentar um carboidrato para produzir ácido e gás. Fotossíntese Fotossíntese é a conversão de energia luminosa do sol em energia química; a energia química é utilizada para a fixação do carbono. As reações dependentes de luz: foto-fosforilação Clorofila a é utilizada por plantas verdes, algas e ciano-bactérias; ela é encontrada nas membranas tilacoides. Elétrons da clorofila passam por uma cadeia de transporte de elétrons, a partir do que ATP é produzido através da químio-síntese. Na foto-fosforilação cíclica, os elétrons são utilizados para reduzir NADP+, e elétrons retornam á clorofila a partir de H2O ou H2S. Quando H2O é oxidado por plantas verdes, algas e ciano-bactérias, O2 é produzido. As reações independentes de luz: o ciclo de Calvin-Benson CO2 é utilizado para sintetizar açúcares no Ciclo de Calvin-Benson. Um resumo dos mecanismos de produção de energia A luz solar é convertida em energia química em reações de oxidação-redução realizadas por foto-tróficos. Químio-tróficos podem utilizar essa energia química. Nas reações de oxidação-redução, a energia é derivada da transferência de elétrons. Para produzir energia, a célula necessita de um doador de elétrons (orgânico ou inorgânico), um sistema de transportadores de elétrons e um aceptor final de elétrons (orgânico ou inorgânico). Diversidade metabólica entre os organismos Foto-auto-tróficos obtêm energia através da foto-fosforilação e fixam carbono a partir de CO2 através do ciclo de Calvin-Benson para sintetizar compostos orgânicos. Ciano-bactérias são foto-tróficos oxigênicos. Bactérias verdes e bactérias púrpuras são foto- tróficos anoxigênicos. Foto-heterotróficos utilizam luz como uma fonte de energia e um composto orgânico como fonte de carbono e doador de elétrons. Químio-autotróficos utilizam compostos inorgânicos como sua fonte de energia e dióxido de carbono como sua fonte de carbono. Químio-heterotróficos utilizam moléculas orgânicas complexas como suas fontes de carbono e energia. Vias metabólicas do uso de energia Biossíntese de poli-sacarídeos Glicogênio é formado a partir de ADPG. UDPNAc é o material inicial para a biossíntese de peptídeo-glicano. Biossíntese de lipídeos Lipídeos são sintetizados a partir de ácidos graxos e colesterol. Glicerol é derivado de diidroxiacetona fosfato, e ácidos graxos são formados de acetil CoA. Biossíntese de aminoácidos e proteínas Aminoácidos são requeridos para a biossíntese de proteínas. Todos os aminoácidos podem ser sintetizados direta ou indiretamente a partir de intermediários do metabolismo de carboidratos, particularmente do ciclo de Krebs. Biossíntese de purinas e pirimidinas Os açúcares que compõem os nucleotídeos são derivados da via pentose fosfato ou da via Entner-Doudoroff. Átomos de carbono e nitrogênio de certos aminoácidos formam os esqueletos de purinas e pirimidinas. A integração do metabolismo Reações anabólicase catabólicas estão integradas por um grupo de intermediários comuns. Tais vias metabólicas integradas são referidas como vias anfibólicas. 6 Crescimento Microbiano Resumo I - Microbiologia Tortora Fatores necessários para o crescimento OO crescimento de uma população é o aumento do número de células Tanto os fatores físicos como os químicos são necessários para o crescimento. Fatores físicos necessários Os microrganismos são classificados, conforme as preferências nas variações na temperatura de crescimento, em psicrófilos (vivem em baixas temperaturas), mesófilos (vivem em temperaturas moderada) e termófilos (vivem em altas temperaturas). A temperatura mínima de crescimento é a temperatura mais baixa que permite o crescimento da espécie; a temperatura ótima de crescimento é aquela em que o organismo melhor se reproduz; a temperatura máxima é a maio temperatura em que o crescimento da espécie ainda é possível. A maioria das bactérias cresce melhor entre os valores de pH 6,5 e 7,5. Em solução hiper-tônica, a maioria dos microrganismos entra em plasmólise. Os organismos halofílicos, no entanto, podem tolerar elevadas concentrações de sais. Fatores químicos necessários Todos os organismos necessitam de fonte de carbono. Os organismos químio-heterotróficos utilizam moléculas orgânicas e os auto-tróficos usam tipicamente dióxido de carbono. O nitrogênio é necessário para a síntese de ácidos nucleicos e proteínas. O nitrogênio pode ser obtido pela decomposição de proteínas ou da transformação de NH4+ em NO3-. Poucas bactérias realizam a fixação do nitrogênio (N2). Os microrganismos são classificados como aeróbicos obrigatórios, anaeróbicos facultativos, anaeróbicos obrigatórios, anaeróbicos aerotolerantes e micro-aerófilos em relação ás necessidades de oxigênio para o crescimento. Os organismos aeróbicos, anaeróbicos facultativos e anaeróbicos aerotolerantes devem conter as enzimas superóxido dismutase (2 O2 + 2 H = O2 + H2O2) e catalase (2H2O2 2 H20 + O2) ou peroxidase (H2O2 + 2 H+ = 2 H2O). Outros elementos químicos necessários para o crescimento são enxofre, fósforo, oligoelementos, e para alguns microrganismos, fatores orgânicos de crescimento. Meio de cultura Um meio de cultura é qualquer material preparado em laboratório para o crescimento de microrganismos. Os microrganismos crescendo em meio de cultura são denominados cultura bacteriana. Agar é o agente solidificante utilizado nos meios de cultura. Meio químico definido No meio quimicamente definido, a concentração exata de cada composto químico é conhecida. Meio complexo No meio complexo, a concentração exata dos compostos químicos varia de cultura para cultura. Meios e metodologia para o crescimento de anaeróbicos A eliminação do oxigênio molecular (O2), que pode afetar o crescimento dos organismos anaeróbicos, é realizada utilizando compostos químicos como redutores no meio de cultura. As placas de Petri podem ser incubadas em jarras de anaerobiose, em câmaras anaeróbicas ou no OxyPlate. Técnicas especiais de cultivo Algumas bactérias parasitas ou fastidiosas devem ser cultivadas em animais vivos ou em culturas de células. Os incubadores de CO2 ou jarras contendo vela são utilizados para o crescimento de bactérias que necessitam de concentrações mais altas de CO2. Meios de cultivo seletivo e diferencial Ao inibir organismos indesejados através da adição de sais, corantes ou outros compostos químicos no meio de cultura, o meio seletivo permite o crescimento somente de um organismo específico. O meio diferencial é utilizado para distinguir diferentes organismos. Meio de enriquecimento Um cultivo de enriquecimento é utilizado para favorecer o crescimento de um determinado microrganismo presente em uma cultura mista. Obtenção de culturas puras Uma colônia é uma massa de células bacterianas visíveis, originadas, teoricamente, a partir de uma única célula. As culturas puras normalmente são obtidas através do método de semeadura em placa. Preservação de cultura bacterianas As bactérias podem ser conservadas por longos períodos de tempo através dos métodos de congelamento em baixas temperaturas ou liofilização. Crescimento de culturas bacterianas Divisão bacteriana A fissão binária é o método normal de reprodução bacteriana, em que uma única célula se divide dando origem a duas células idênticas. Algumas bactérias se reproduzem por brotamento, formação de esporos aéreos ou por fragmentação. Tempo de geração O tempo necessário para uma célula se dividir ou uma população se duplicar é denominado tempo de geração. Representação logarítmica das populações bacterianas A divisão bacteriana ocorre conforme uma progressão logarítmica (2 células, 4 células, 8 células, etc). Fases de crescimento Durante a fase lag, ocorre pouca ou nenhuma variação no número de células, no entanto existe muita atividade metabólica. Durante a fase log, a bactéria se multiplica em alta velocidade considerando as condições fornecidas pelo meio. Durante a fase estacionária, existe um equilíbrio entre a divisão celular e a morte. Durante a fase de morte celular, existe um número maior de células mortas em relação ás novas células formadas. Métodos para quantificar diretamente o crescimento bacteriano O método-padrão de contagem em placa determina o número de células viáveis assumindo que cada célula bacteriana se desenvolverá em uma única colônia; as contagens em placa são consideradas como número de unidades formadoras de colônias (UFC). O método de contagem em placa pode ser realizado através da técnica de pour plate ou da técnica de espalhamento em placa. No método de filtração, a bactéria fica retida na membrana de filtração sendo, então, transferida para o meio de cultura para possibilitar seu crescimento e contagem. O método do número mais provável (MNP) é utilizado para microrganismos que crescem em meio líquido. Esse método utiliza a estatística para estimar o número de bactérias. O método de contagem direta no microscópio utiliza uma lâmina especialmente adaptada, onde será determinado o número de células em um volume conhecido de uma suspensão bacteriana. Métodos indiretos para determinação do número de células O espectofotômetro é utilizado na determinação de turbidez, estimando a quantidade de luz que atravessa uma suspensão de células. Uma maneira indireta de se determinar o número de células é através da sua atividade metabólica (por exemplo determinando-se a produção de ácido ou consumo de oxigênio). Para organismos filamentosos como fungos a determinação do peso seco é um método utilizado na estimativa de seu crescimento. 7 Controle do crescimento microbiano Resumo I - Microbiologia Tortora A terminologia do controle bacteriano O controle do crescimento microbiano pode prevenir infecções e deterioração de alimentos. A esterilização é o processo de destruir toda a vida microbiana em um objeto. A esterilização comercial é o tratamento com calor dos alimentos enlatados paradestruir os esporos de C. Botulinum. A desinfecção é o processo de reduzir ou inibir o crescimento microbiano em um superfície inanimada. Anti-sepsia é o processo de reduzir ou inibir os microrganismos em tecido vivo. O sufixo-cida significa matar; o sufixo -statico significa inibir. Sepse é a contaminação bacteriana. A taxa de morte bacteriana As populações bacterianas sujeitas ao calor ou a produtos químicos anti-microbianos normalmente morrem em uma taxa constante. Esta curva de mortalidade, quando representada logaritmicamente, mostra a taxa constante de morte como uma linha reta. O tempo que leva para matar uma população microbiana é proporcional ao número de micróbios. As espécies microbianas e fases do ciclo de vida (e.g., endosporos) possuem diferentes suscetibilidades aos controles físico e químico. A matéria orgânica pode interferir com os tratamentos de calor e agentes de controle químico. A exposição mais longa a menos calor pode produzir o mesmo efeito que o período mais curto sob calor intenso Ações dos agentes de controle microbiano Alteração da permeabilidade da membrana A sensibilidade da membrana plasmática se deve a seus componentes lipídicos e proteicos. Certos agentes de controle químico lesam a membrana plasmática, alterando sua permeabilidade. Dano ás proteínas e aos nucleicos Alguns agentes de controle microbiano lesam as proteínas celulares ao romper as pontes de hidrogênio e as ligações covalentes. Outros agentes interferem com a replicação do DNA e RNA e com a síntese proteica. Métodos físicos de controle microbiano Calor O calor é frequentemente usado para eliminar os microrganismos. O calor úmido mata os microrganismos por desnaturação das enzimas. O ponto de morte térmica (PMT) é a menor temperatura em que todos os micróbios de uma cultura líquida serão mortos em dez minutos. O tempo de morte térmica (TMT) é a duração de tempo necessária para matar todas as bactérias em uma cultura líquida em uma dada temperatura. O tempo de redução decimal (TRD) é a duração de tempo necessária para que 90% de uma população bacteriana seja morta em uma dada temperatura. A fervura (100ºC) mata muitas células vegetais e vírus dentro de 10 minutos. A autoclave (vapor sob pressão) é o método mais efetivo de esterilização com calor úmido. O vapor deve entrar em contato direto com o material a ser esterilizado. Na pasteurização HTST, uma alta temperatura é usada por um curto período (72ºC por 15 segundos) para destruir os patógenos sem alterar o sabor do alimento. O tratamento com temperaturas ultra-elevadas (UHT) (140ºC por 3 segundos) é usado par esterilizar laticínios. Os métodos de esterilização com calor seco incluem a chama direta, incineração e esterilização com ar quente. O calor seco mata por oxidação. Diferentes métodos que produzem o mesmo efeito (redução no crescimento bacteriano) são denominados tratamentos equivalentes. Filtração A filtração é a passagem de um líquido ou gás através de um filtro com poros pequenos o suficiente para reter os micróbios. Os micróbios podem ser removidos do ar por filtros de partículas com alta eficiência. Os filtros de membrana compostos de nitro-celulose ou acetato de celulose são comumente usados para filtrar bactérias, vírus e mesmo proteínas de alta massa molecular. Baixas temperaturas A eficácia das baixas temperaturas depende do microrganismo particular e da intensidade da aplicação. A maioria dos microrganismos não se reproduz em temperaturas comuns do refrigerador (0- 7ºC). Muitos micróbios sobrevivem (mas não crescem) nas temperaturas abaixo de zero, usadas para armazenar alimentos. Alta pressão A alta pressão desnatura as proteínas nas células vegetais. Dessecação Na ausência de água, os microrganismos não podem crescer, mas podem permanecer viáveis. Vírus e endosporos podem resistir á dessecação. Pressão osmótica Os microrganismos em altas concentrações de sais e açúcares sofrem plasmólise. Os bolores e leveduras são mais capazes que as bactérias de crescer em materiais com baixa umidade ou alta pressão osmótica. Radiação Os efeitos da radiação dependem de seu comprimento de onda, intensidade e duração. A radiação ionizante (raios gama, raios X e feixes de elétrons de alta energia) tem um alto grau de penetração e exerce seu efeito principalmente ionizando a água e formando radicais hidroxila altamente reativos. A radiação ultra-violeta (UV), uma forma de radiação não-ionizante, tem baixo grau de penetração e causa lesão celular provocando dímeros de timina no DNA, que interferem com a replicação do DNA; o comprimento de onda germicida mais efetivo é 260nm. As micro-ondas podem matar os micróbios indiretamente á medida que os materiais se aquecem. Métodos químicos de controle microbiano Os agentes químicos são usados em tecidos vivos (como anti-sépticos) e em objetos inanimados (desinfetantes). Poucos agentes químicos atingem a esterilidade. Princípios da desinfecção efetiva Muita atenção deve ser dada ás propriedades e á concentração do desinfetante a ser usado. A presença de matéria orgânica, o grau de contato com os microrganismos e a temperatura também devem ser considerados. Avaliando um desinfetante No teste de uso-diluição, a sobrevivência bacteriana (S. Choleraesuis, S. Aureus e P. Aeruginsa) na diluição de um desinfetante recomendada pelo fabricante é determinada. Vírus, bactérias formadoras de endosporos, mico-bactérias e fungos também podem ser usados no teste de uso-diluição. No método de disco-difusão, um disco de papel filtro é embebido com uma substância química e colocado em uma placa de agar inoculada; uma zona de inibição indica efetividade. Tipos de desinfetante Fenol e compostos fenólicos Os compostos fenólicos exercem sua ação lesando as membranas plasmáticas. Bi-fenóis Bi-fenóis, como o triclosano (venda liberada) e hexa-clorofeno (prescrito) são amplamente usados em produtos cosméticos. Biguanidas A clorexidina lesa as membranas plasmáticas das células vegetais. Halogênios Alguns halogênios (iodo e cloro) são usados isoladamente ou como componentes de soluções inorgânicas ou orgânicas. O iodo pode ser combinado com certos aminoácidos para inativar enzimas e outras proteínas celulares. O iodo está disponível como tintura (em solução com álcool) ou como iodofor (combinação a uma molécula orgânica). A ação germicida do cloro baseia-se na formação de ácido hipo-cloroso quando o cloro é adicionado á água. O cloro é usado como desinfetante em forma gasosa (Cl2 ou ClO2) ou em um composto, como o hipo-clorito de cálcio, o hipo-clorito de sódio, o di-cloro-iso-cianureto de sódio e as cloraminas. Álcoois Os álcoois exercem sua ação desnaturando as proteínas e dissolvendo os lipídeos. Em tinturas, eles aumentam a efetividade de outros produtos químicos anti-microbianos. O etanol aquoso (60 a 95%) e o iso-propanol são usados como desinfetantes. Metais pesados e seus compostos Prata, mercúrio, cobre e zinco são usados como germicidas. Eles exercem sua ação anti-microbiana pela ação oligodinâmica. Quando os íons de metal pesado se combinam com os grupos sulfidrila (-SH), as proteínas são desnaturadas. Agentes de superfície Os agentes de superfície reduzem a tensão entre as moléculas de um líquido; os sabões e os detergentes são exemplos. Os sabões possuem ação germicida limitada, mas auxiliam na remoção dos microrganismos por escovação. Os detergentes ácido-aniônicos são usados para limpeza de equipamento de laticínios. Compostos quaternários de amônio Os quats são detergentes catiônicos unidos ao NH4+. Ao romper as membranas plasmáticas, eles permitem o vazamento dos constituintes citoplasmáticos para fora da célula. Os quats são mais efetivos contra as bactérias gram-positivas. Conservantes químicos de alimentos O SO2, o ácido sórbico, o ácido benzoico e o ácido propiônico inibem o metabolismo fúngico e são usados como conservantes de alimentos. Os sais de nitrato e nitrito impedem a germinação de endosporos de Clostridium butolinun na carne. Antibióticos A nisina e a natamicina são antibióticos usados para conservar alimentos, especialmente o queijo. Aldeídos Os aldeídos como o formaldeído e o gluraldeído exercem seu efeito anti-microbiano tornando as proteínas inativas. Eles estão entre os mais efetivos desinfetantes químicos. Químio-esterelizantes gasosos O óxido de etileno é o gás mais frequentemente usado para a esterilização. Ele penetra na maioria dos materiais e mata todos os microrganismos por desnaturação das proteínas. Peroxigênios (Agentes oxidantes) O ozônio, o peróxido e o ácido peracético são usados como agentes microbianos. Eles exercem seu efeito oxidando as moléculas dentro das células. Características e controle microbiano As bactérias gram-negativas geralmente são mais resistentes que as bactérias gram-positivas aos desinfetantes e anti-sépticos. As mico-bactérias, os endosporos e os cistos e oocistos dos protozoários são muito resistentes aos desinfetantes e anti-sépticos. Os vírus não-envelopados geralmente são mais resistentes que os vírus envelopados aos desinfetantes e anti-sépticos. Os príons são resistentes á desinfecção e á auto-clave.
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