Relatório de Bacteriologia Coloração de Gram

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Relatório de Bacteriologia: Técnica de coloração de Gram
Letícia dos Santos Noda
Larissa Maria Zacarias Rodrigues
Lívia Bassani
Luan Barbosa Ribeiro
1.Introdução:
A coloração de Gram é uma técnica muito usada nos laboratórios, recebeu esse nome em homenagem ao médico dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é usada para colorir bactérias e dividi-las em 2 grupos: Gram-positivas (gram+), nas quais o corante violeta de genciana é retido, e Gram-negativas (gram-), nas quais não há retenção desse corante. A capacidade de reter a violeta de genciana em sua parede celular no procedimento, devido à diferença na composição da parede celular, é que define a coloração final da bactéria e, consequentemente, sua classificação em gram+ ou gram-.
Nesse sentido, as bactérias gram- negativo possuem uma bicamada lipídica interna (a membrana plasmática, MP) e outra externa – ME (ligada a lipopolissacarídeos, LPS, do lado externo e fixada a uma fina malha de peptideoglicano, PG, do lado interno por lipoproteínas, LP). As gram+, contudo, não possuem uma ME mas possuem PG espesso contendo ácido teioico (polímeros de glicerol e ribitol associados por ligações fosfodiéster), o qual confere densidade negativa à sua parede. Essas estrutursas são observadas na figura1. Além disso, o peptideoglicano de gram+ tem maior estabilidade do que o peptideoglicano de gram-, conferida por maior quantidade de ligações regulares de cadeias laterais de tetrapeptideos (CLTs) entre sequências poliméricas de açúcares.
O método depende de uma baixa difusão do corante pelo peptideoglicano e da deferença de estabilidade entre o peptideoglicano de cada tipo de bactéria. Essa estabilidade, como já referida, ocorre devido às diferenças de espessura e de interligações entre CLTs na malha de peptideoglicano.
2.Objetivos:
A prática tem como objetivo observar as diferenças entre a coloração Gram-positiva e a Gram-negativa, além de permitir observar a morfologia das diferentes bactérias. Essa técnica é muito usada e muito eficiente para diagnóstico e estudo dessas bactérias, por ser um método rápido e não muito complexo.
3.Materiais e métodos:
Amostragens:
Foram utilizadas Staphilococcus aureus, Bacillus, E. coli e amostras de saliva previamente cultivadas.
Transferência das bactérias para lâminas:
As amostras de S. aureus e de saliva estavam em cultura sólida, então foi necessária a deposição de uma gota de solução salina na lâmina (com alça de platina esterilizada) antes da adição dessas bactérias. Foram preparadas 5 lâminas: a lâmina1 contendo S. aureus; a lâmina 2, Bacillus; a lâmina3, E. coli; a lâmina 4, amostra de saliva; a lâmina 5, mistura de Bacillus com E.coli.
Fixação das culturas na lâmina:
As lâmina com as culturas foram rapidamente colocadas na chama em bico de Bunsen três vezes para a sua fixação por calor. Caso não houvesse total evaporação da solução líquida, essa etapa era repetida.
Adição de violeta de genciana:
Na adição de violeta de genciana por 1min, há tempo suficiente para que esse corante atravesse canais de porinas na membrana externa e interajam com o peptideoglicano de gram-. No caso de gram+, há interação direta, que é intensificada devido à carga positiva da violeta e à carga negativa do ácido teioico no peptideoglicano. Como a difusão dos cristais violeta é lenta na camada de peptideoglicano, ele é pouco depositado nas gram-, enquanto nas gram+ fica preso devido a uma maior espessura da camada neste caso.
Adição de lugol:
Nessa etapa, o lugol – mistura de iodo e iodeto de potássio – acrescentado à lâmina durante 20 segundos precipita a violeta de genciana, que é, dessa forma, fixada na malha de peptideoglicano.
Lavagem com álcool:
Essa é a etapa de descoloração das gram-. O álcool aplicado, durante 20 segundos, desnatura proteínas de membrana e solubiliza lipídeos da membrana externa das bactérias gram-, que é altamente prejudicada. Assim, o peptideoglicano, ligado à membrana externa por lipoproteínas, é também destruído e o corante é perdido. Por outro lado, a espessa e estável camada de peptideoglicano das gram+ sofrem mínima perturbação. Assim, gram- são descoloridas e gram+ intactas se mantêm coradas.
Adição de fucsina:
Apenas bactérias gram- são coradas por fucsina (durante 20 segundos), o que permite sua diferenciação na visualização.
Observação em microscópio óptico:
Devido às diferentes cores de gram- e gram+ resultantes dos processos, é possível a diferenciação de cada tipo na observação em microscópio.
4.Resultados
Na lâmina1, foram observados cocos violeta em forma de cachos, o que indica que S. aureus é classificado gram+ (figura 2).
Na lâmina2, os bacilos apresentaram coloração violeta também, indicando que são gram+.
Na lâmina3, os diplococcus de E. coli se apresentaram rosa claro, evidenciando que são gram-, já que perderam sua coração na etapa de descoloração com álcool.
Na lâmina4, foi observada uma diversidade de microbiota bucal, com predominância de cocos gram+, em diversas formas(estafilococos, estreptococos, diplococos).
Na lâmina5, pode-se diferenciar as bactérias gram+(Bacillus) das gram-(E. coli) devido às suas diferentes colorações: violeta e rosa, respectivamente(figura 3).
Figura3: lâmina5, Bacillus e E.coli, visualizada em miscroscopia
Figura2: lâmina1, S. aureus, em microscopia