PCR em tempo real

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PCR EM TEMPO REAL
A cada ciclo mostra quantas cópias estão presente
Leva tudo o que tem no PCR tradicional, o que tem a mais é uma sonda 
Se difere ao PCR NESTED pois refaz o mesmo PCR 
PROBLEMA: número muito baixo de copias (ex 50) - concentrar a amostra ou número muito alto (ex 2.000.000) - diluir a amostra 
Sistema ESTOURADO: não é precisamente a carga viral 
 
No PCR deve fazer todos os 30 ciclos para saber se é o resultado e reprodutível – confiável ou não 
CINETICA: igual ao PCR normal
SONDA: a sonda prende em cima da sequência que você quer amplificar, se diferenciando do primer que prende flaqueando 
A sonda é uma sequência de nucleotídeos com fluorocromo Q (quantium) e R (riporter)
O primer se prende flaqueando e a DNA polimerase TAQMAN que possui função exonuclease se prende na sequencia determinada – tirando nucleotídeo da ponta 
No primeiro nucleotídeo está presente o riporter que acende acende 
Quando chega no ultimo nucleotídeo existe o quantium que apaga a luz do riporter e acende
Deve saber todos os RIPORTERS 
O PCR em tempo real continua fazendo os trinta ciclos, porem ele tem armazenado todos os resultados de cada ciclo, contabilizando a contagem perfeita e depois a parte estourada
Multiplex Reactions quando se quer identificar em um indivíduo mais de um gene: muda o riportes assim mudando as cores 
Ensaio de discriminação alélica: a detecção de um heterozigoto 
Se tem dois genes – um normal e um mutado – se cria uma sonda para detectar o gene normal CY5 e cria uma sonda para detectar o gene mutado TX RED
Ex: 
PRIMEIRO PACIENTE: acende só CY 5 - homozigoto para genes normais
SEGUNDO PACIENTE: acende só YX RED – homozigoto recessivo tendo a doença
TERCEIRO PACIENTE: acende TX RED e CY 5 – heterozigoto que porta a herança da doença
CAPTURA HÍBRIDA: patógeno de DNA
Trabalha com amplifiação de sinal
Medida direta da quantidade de ácidos nucleicos 
Feita por uma empresa que fornece o kit de coleta 
Muito utilizado para reconhecer HPV, clamídia e gonorreia
Constituída por 5 etapas:
Preparação da espécime - Digestão ou Desnaturação do ácido nucleico: suspensão uniforme de ácidos nucleicos separando a dupla fita
A placa de captura hibrida é uma placa com muitos poços
Hibridização: jogando a sonda de captura híbrida - molécula de RNA: sequencia de RNA complementar do DNA
Captura híbrida: na parede do poço tem preso anticorpos de policlonados responsáveis por capturar híbridos de DNA : RNA (não captura dupla fita) - prende apenas o material reconhecido pela sonda com múltiplos sítios de reconhecimento
Não prende RNA:RNA ou DNA:DNA por isso o vírus do HIV não funciona por hibridização
Jogar o segundo anticorpo: tem na ponta a enzima fosfatase alcalina e só prende no híbrido capturado 
Lavagem de placa: pois tudo que não ficou aderido, na lavagem ficou retirada, assim só o que está preso na parede é o híbrido DNA:RNA 
Adicionar o substrato: transformado pela fosfatase alcalina por um produto que pssui cor e está cor é quantificada pelo aparelho 
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO: 
Usado para fazer a GENOTIPAGEM VIRAL
Variante droga resistente
Níveis sub-inibitórios da droga
Fatores imunológicos do hospedeiro
Identificando uma replicação viral resistente e concluindo qual medicamento deve ser usado
Pode ser feito por: 
Eletroforese 
Capilar
O sequenciamento se baseia na utilização: dinesoxis, dNTP hidroxila no carbpn 3' e o dinesoxi que não tem hidroxila no carbano 3', seu objetivo é impedir que coloque mais desoxiribonucleotídeos que o necessário
Cada DDNTP tem uma cor diferente pois cada DNTP tem um fluorocromo diferente jogando no tubo de ensaio
Existem 4 etapas:
Em cada tubo se coloca primer desoxyrribonucleotídeos, primer, taq polimerase e DNA template porem em cada um dos quatro tubos coloca DDNTP diferente
DDATP – DDTTP – DDCTP – DDGTP
Tubo 1 – tubo 2 – tubo - tubo 4 
A ponta de qualquer fita vai ter o alongamento da fita e depois a parada
Exemplo: 
TUBO 1:
ATTAGCTGCAGC
TAATGA*
TAA*
TA*
Se cria fragmentos de todos os tamanhos possíveis de ponta com adenina
TUBO 2: 
TAAT*
TAATCGAGT*
No final vai ter todos os fragmentos possíveis podendo analisar a ponta do menor para o menor 
Depois desta parte coloca a amostra no capilar ou no gel da eletroforese 
Depois do capilar ou da eletroforese se coloca no laser
Depois que a sequência já é reconhecida se coloca no banco de dados para buscar qual a mutação presente concluindo qual medicamento deve ser usado ou não 
Pode vir também uma tabela com a mutação, vem a informação do aminoácido na tabela e nunca de nucleotídeo com a tabela de medicamentos 
SNP: sequenciamento de regiões fora da doença , observando que um único nucleotídeo fora do gene é capaz de modular o desenvolvimento clínico de uma doença ou característica
Ex: obesidade
Por que dois indivíduos com a mesma mutação e o mesmo sequenciamento tem continuidades diferentes?