trabalho de PCR

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1. INTRODUÇÃO 
Em 1953 o físico inglês Francis Crick e seu amigo americano James Watson, 
geneticista microbiano descobriram a estrutura e desenvolveram um modelo de DNA, 
composto por ácidos desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA). Estão 
envolvidos no armazenamento, na transmissão e no processamento das informações genéticas 
de uma célula. Sua estrutura de hélice ganhou-os o Prémio Nobel em 1962, quando descobriram 
a estrutura da dobro-hélice do DNA, mostrando bases complementar em sentidos opostos, sobre 
a possibilidade de um mecanismo de cópia para o DNA 
Outro marco histórico nos estudos sobre DNA foi o processo de amplificação do DNA, 
por Kary Mullis em 1983 e a primeira amplificação feita foi a da betaglobulina 
humana. Desde então, houve um aumento exponencial no número de publicações científicas 
que relatavam utilizar reação em cadeia da polimerase (técnica da PCR), Esta descoberta 
condecorou Kary Mullis com o prêmio Nobel de Química dez anos após seus estudos e 
experimentos científicos. O fato central que faz a PCR tão útil é que todo organismo vivo possui 
sequências de nucleotídeos no DNA que são únicas e específicas para cada espécie. 
 Ao longo do tempo, a técnica evoluiu além dos confins de seu projeto inicial simples 
e abriu avenidas incríveis para pesquisadores. Dentro de 20 anos de sua descoberta, esta técnica 
sensacional transformou-se a base para diversos protocolos da biologia molecular e formou-se 
a fundação do Projeto de Genoma Humano. Conklin, geneticista dos Institutos de Gladstone 
em São Francisco, estava tentando descobrir como as variações no DNA afetam várias doenças 
humanas, mas suas ferramentas eram pesadas, foi quando ele leu sobre CRISPR, que permitiria 
que os pesquisadores mudassem rapidamente o DNA de quase qualquer organismo - incluindo 
humanos. Logo depois, Conklin abandonou sua abordagem anterior à doença de modelagem e 
adotou essa nova. O sentimento é amplamente compartilhado: CRISPR está causando uma 
grande agitação na pesquisa biomédica. Ao contrário de outros métodos de edição de genes, é 
barato, rápido e fácil de usar, e ele tem varrido os laboratórios em todo o mundo como 
resultado. "Eu vi dois grandes desenvolvimentos desde que estive na ciência: CRISPR e PCR" 
(SCHIMENTI John, geneticista da Universidade de Cornell em Ithaca, Nova York apud 
LEDFORD Heidi, 2015). 
 
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2. OBJETIVOS: 
2.1 GERAL 
Apresentar as técnicas PRC e CRISPR; 
2.2 ESPECIFICOS 
Explanas sobres as técnicas PRC e CRISPR quanto as suas utilidades e exemplificando 
as suas aplicações. 
 
3. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
 A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada 
para realizar cópias de uma região específica do DNA. Por exemplo, pode haver um gene cuja 
o pesquisador queira compreender ou correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos 
(biologia forenses). 
3.1 APLICAÇÕES DA TÉCNICA PCR 
O objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de 
modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. A PCR é usada em 
muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos 
médicos e mesmo alguns ramos da ecologia. Essa técnica possibilita estudos de analises de 
genes, diagnósticos de doenças genéticas e até mesmo detectar agentes infecciosos (como por 
exemplo alguns vírus). Exemplos: 
 Teste de paternidade: o filho de um casal sempre deve herdar um cromossomo 
paterno e outro materno, a comparação entre regiões do genoma do filho com a mãe e o suposto 
pai indicará se o pai em questão é realmente o pai da criança; 
 Investigação criminal: é utilizada para amplificar pequenos fragmentos, desta 
forma é possível utilizar pequenas amostras biológicas como por exemplo um pouco de sangue, 
pode se identificar o suspeito; 
 Mutações genéticas: permite amplificar genes de interesse para estudo, e assim 
identificar quem possui ou não a mutação. 
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Para ocorrer a PCR, a replicação de DNA em um organismo precisa da Taq polimerase 
(enzima DNA) para fabricar DNA, que por sequencia precisa do prime (fitas de DNA, com 
mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares), isto é se ligam por complementaridade 
ao início da sequência de DNA curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a 
síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será 
copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher. 
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) 
através do uso da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos 
de DNA são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os 
fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente 
incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado. 
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista 
a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.2 ETAPAS: DESNATURAÇÃO, ANELAMENTO E EXTENSÃO 
Para realização da PCR e necessário extrair DNA do paciente, que pode ser por sangue 
(5-8mL), esfregaço bucal, tecido, etc. A amostra varia de acordo com o exame pedido. Os 
métodos de uma reação PCR são Taq polimerase, primes, DNA molde e nucleotídeos. Após o 
processo de extração, em um tubo adequadamente identificado para cada paciente, são incluídos 
Figura1: Técnica de PCR. Fonte:sites.uem.br/drgenetica 
 
 
 
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os reagentes necessários para que a reação ocorra. Os ingredientes são devidamente colocados 
em tubos juntos com os cofatores que a enzima precisa, passando por repetidos ciclos de 
aquecimento e esfriamento que permitem o DNA seja sintetizado. Em seguida ocorre as 4 
etapas: 
Desnaturação: A estrutura do DNA é composta por duas fitas complementares e 
espirais, em forma de hélice. Para que a duplicação ocorra, é necessário separá-las para que 
cada uma delas sirva de molde para a nova fita de DNA. Essa separação é feita através de altas 
temperaturas, em torno de 90°C. 
 
 
 
 
Anelamento ou Hibridização: Para delimitar a região de interesse, são utilizados 
iniciadores específicos, chamados também de primers, a uma temperatura em torno de 40°C, 
para que se liguem a fita previamente aberta e haja amplificação apenas da região delimitada 
pelos primers. 
 
 
 
 
Figura 2. Separação das fita para etapa de Desnaturação. 
Fonte:sites.uem.br/drgenetica 
Figura 3. Ligação dos primers etapa de Anelamento. 
Fonte:sites.uem.br/drgenetica 
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Extensão ou polimerização: Após a área ser delimitada pelos iniciadores, uma 
enzima chamada Taq DNA Polimerase age a 70°C fazendo a extensão da fita, adicionado bases 
nitrogenadas, sempre na direção 5’-3’. 
 
 
 
 
Estas etapas irão se repetir várias vezes, e a cada etapa aumenta a quantidade de DNA. 
 
 
 
 
Realizada as etapas, então é hora de estudar a fita de DNA amplificada e ver os 
resultados. Para visualizar os resultados, é realizada uma eletroforese, uma reação elétrica que 
permite visualizar diferentes tamanhos de DNA em um gel de agarose. A interpretação do gel 
fornece o resultado que irá nos laudos e que indicarão presença/ausência de mutações, por 
exemplo. 
Figura 3. Adição das bases nitrogenadas, etapa de Extensão. 
Fonte:sites.uem.br/drgenetica 
Figura 4. Repetição das etapas:desnaturação, anelamento e extensão. 
Fonte:sites.uem.br/drgenetica 
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4. CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente) 
Segundo Broadinstitute.org, o CRISPR CEISPR “são a marca registrada de um sistema 
de defesa bacteriana que constitui a base para a tecnologia de edição do genoma CRISPR-Cas9. 
´, ou seja significa repetições palindromicas curtas em intervalos regulares interterrâneas. No 
campo da engenharia do genoma, o termo "CRISPR" ou "CRISPR-Cas9" é frequentemente 
usado vagamente para se referir aos vários sistemas CRISPR-Cas9 e -CPF1, (e outros) que 
podem ser programados para direcionar trechos específicos de código genético E editar DNA 
em locais precisos, bem como para outros fins, como para novas ferramentas de 
diagnóstico. Com esses sistemas, os pesquisadores podem modificar permanentemente genes 
em células vivas e organismos e, no futuro, podem possibilitar a correção de mutações em locais 
precisos no genoma humano, a fim de tratar causas genéticas da doença. Outros sistemas estão 
agora disponíveis, como o CRISPR-Cas13, que o RNA alvo oferece vias alternativas para uso 
e com características únicas que foram alavancadas para ferramentas de diagnóstico sensíveis, 
como SHERLOCK. 
4.1 ORIGEM DO CRISPR 
CRISPRs foram descobertos pela primeira vez em archaea (e mais tarde em bactérias) 
por Francisco Mojica, cientista da Universidade de Alicante, na Espanha. Ele propôs que 
CRISPRs servem como parte do sistema imunitário bacteriano, defendendo contra invasores de 
vírus. Consistem em sequências repetitivas de código genético, interrompidas por sequências 
"espaçadoras" - restos de código genético de invasores passados. O sistema serve como uma 
Figura 5: Exemplo de Imagem de bandas de DNA em um gel de agarose. 
Fonte: uem.br/drgenetica 
 
 
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memória genética que ajuda a célula a detectar e destruir invasores (chamados de 
"bacteriófago") quando retornam. A teoria de Mojica foi experimentalmente demonstrada em 
2007 por uma equipe de cientistas liderada por Philippe Horvath. Em janeiro de 2013, 
o laboratório de Zhang publicou o primeiro método para criar CRISPR para editar o genoma 
humano. Para mais informações sobre muitos cientistas e equipes que contribuíram para a 
compreensão e desenvolvimento do sistema CRISPR, desde a descoberta inicial até as primeiras 
demonstrações da edição de genoma mediada pelo CRISPR, visite nossa linha de 
tempo CRISPR. 
4.2 FUNCIONAMENTO DO SISTEMA CRISPR 
As sequências "spacer" de CRISPR são transcritas em sequências de RNA curtas 
("CRISPR RNAs" ou "crRNAs") capazes de guiar o sistema para sequências de DNA 
correspondentes. Quando o DNA alvo é encontrado, Cas9 - uma das enzimas produzidas pelo 
sistema CRISPR - se liga ao DNA e o corta, fechando o gene direcionado. Usando versões 
modificadas de Cas9, os pesquisadores podem ativar a expressão de genes em vez de cortar o 
DNA. Essas técnicas permitem que os pesquisadores estudem a função do gene. 
Há pesquisa que sugere que CRISPR-Cas9 pode ser usado para segmentar e modificar 
"erros de digitação" na sequência de três bilhões de letras do genoma humano em um esforço 
para tratar doenças genéticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 6: Sistema CRISPR em ação 
Fonte: broadinstitute.org 
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Cas9 também pode ser usado para direcionar múltiplos genes simultaneamente, o que 
é outra vantagem que o diferencia de outras ferramentas de edição de genes. O sistema CRISPR-
Cas9 em si é capaz de cortar fios de DNA, CRISPRs não precisa ser emparelhado com enzimas 
de clivagem separadas como outras ferramentas. 
 
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Os pesquisadores-cientistas são capazes de editar genomas com ferramentas 
moleculares, com o passar dos anos houve descobertas e estudos trazendo à sociedade cientifica 
ficando excitados por enzimas chamadas nucleases de dedos de zinco que prometiam fazer isso 
com precisão e eficiência. A técnica da PCR permite que um fragmento específico da molécula 
de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas. Esta técnica 
revolucionou as pesquisas em biologia molecular, pois até então demorava-se muito tempo para 
a amplificação do DNA. A partir da PCR é possível obter-se cópias de uma parte do material 
genético em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequência que é alvo do 
estudo. A reação pode ser comparada a uma procura por uma única pessoa em uma grande 
cidade e cloná-la ao ponto de poder povoar toda a cidade. 
Outras agitação acontece com a utilização do CRISPR, causando uma grande agitação 
na pesquisa biomédica. Ao contrário de outros métodos de edição de genes, é barato, rápido e 
fácil de usar, e ele tem varrido os laboratórios em todo o mundo como resultado. Segundo 
Nature (2015, edição 520), “embora o CRISPR tenha muito a oferecer, alguns cientistas estão 
preocupados com o fato de que o ritmo vertiginoso do campo deixa pouco tempo para abordar 
as preocupações éticas e de segurança, tais experiências podem aumentar.” O problema foi 
lançado em destaque em abril, quando as notícias quebraram que cientistas usaram o CRISPR 
para engenharia de embriões. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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6. REFERÊNCIAS 
 
CHERIYEDATH, Susha. História da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR). Disponivel 
em<https://www.news-medical.net/life-sciences/History-of-Polymerase-Chain-Reaction-
(PCR)-(Portuguese).aspx> Acesso em 20 ago 2017; 
LEDFORD, Heidi. CRISPR, the disruptor. Disponivel em<https://www.nature.com/news/crispr-
the-disruptor-1.17673> Acesso em 20 ago 2017; 
HISTÓRIA E EVOLUÇÃO DA TÉCNICA DE PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação 
em Cadeia da Polimerase). Disponivel em< http://www.kasvi.com.br/historia-e-evolucao-da-
tecnica-de-pcr/> Acesso em 20 ago 2017; 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR). Khan Academy Org . Disponivel em< 
http://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-
electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr> Acesso em 19 ago 2017; 
PCR. Disponivel em< http://sites.uem.br/drgenetica/pcr/pcr-convencional/o-que-e-pcr> 
Acesso em 19 ago 2017; 
PAD MORFOLOGIA. PCR. Disponivel em< http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-
morf/pcr2.htm> Acesso em 20 ago 2017; 
QUESTIONS AND ANSWERS ABOUT CRISPR. Disponivel em< 
https://www.broadinstitutsignifica repetições palindromicas curtas em intervalos regulares 
interterrâneas, que são a marca registrada de um sistema de defesa bacteriana que constitui a base 
para a tecnologia de edição do genoma CRISPR-Cas9. e.org/what-broad/areas-focus/project-
spotlight/questions-and-answers-about-crispr> Acesso em 20 ago 2017