CENTRO UNIVERSITÁRIO ESTACIO DE SÁ

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CENTRO UNIVERSITÁRIO ESTACIO DE SÁ
PROFESSORA ANA PAULA
MICROBIOLOGIA DO AMBIENTE
FRANCIELE COSTA
YANCA KLAUMANN
MATUTINO B
SÃO JOSÉ, SANTA CATARINA
2017
Introdução:
A microbiologia ambiental estuda os microrganismos e suas atividades presentes no ambiente, para o entendimento do seu papel na manutenção da biosfera e seu uso potencial na remediação de locais que tenham sido modificados.
Iremos também utilizar a técnica de Coloração de Gram, a qual é usada para diferenciação de microrganismos através das cores, para serem observados em microscópio óptico. A técnica recebeu este nome em homenagem ao médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Por volta de 1884, Hans Gram observou que as bactérias, após serem tratadas com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas. Assim, as que ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas. A técnica de Gram é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.
Objetivo:
Isolar e caracterizar microrganismos do ambiente através de suas propriedades morfo-tintorias.
Materiais e Metodologias:
-Cotonetes; 
-Lâminas de vidro para microscopia; 
-Caneta para escrever em vidro; 
-Solução de cristal violeta (1g de cristal violeta, 10ml de álcool 95°, 2g de fenol e 100ml 
de água destilada); 
-Solução de Lugol; 
-Álcool 95°; 
-Solução de fucsina (30mg de fucsina, 10ml de álcool 95°, 500mg de fenol e 90ml de 
água destilada; 
-Pia com torneira; 
-Pote plástico para recolher resíduos de corante; 
-Frasco com água; 
-Bico de Bunsen; 	
-Papel toalha; 
-Microscópio óptico; 
-Óleo mineral.
-Tubo de ensaio com agua destilada 
-Amostra de material da microbiota ambiental (aparelho celular)
-Estufa bacteriológica a 37ºC
-Alça bacteriológica
-Tubo de ensaio com caldo Brain Heart Infusion (BHI)
Primeiro método:
I- Utilizar um cotonete, mergulhars em um tubo de ensaio com agua destilada esterilizado com o bico de Busen.
II- Coletar a amostra do material em um aparelho celular.
III- Colocar o cotonete contaminado com o material no tubo de ensaio com BHI, esterilizado com o bico de Busen.
IV- Incubar o tubo por 18 – 24 horas em estufa a 37ºC.
Segundo Método:
I – Esterilizar a alça bacteriológica no bico de Bunsen e resfriar na água destilada estéril.
II – Abrir o tudo de ensaio com o caldo BHI e coletar as bactérias.
III – Utilizar a técnica das estrias descontínuas dentro da placa de Petri (a última estria não pode encostar nas outras estrias da placa)
IV – Incubar a placa de Petri por 18 – 24 horas em estufa a 37ºC.
Técnica de estrias descontinuas para isolamento das colônias.
 
Terceiro Método (preparação da lâmina e coloração de Gram):
I - Flambar a alça bacteriológica no bico de Bunsen e resfriar na água destilada estéril (do tubo de ensaio) mantendo-a próxima a chama. 
II – Colocar uma pequena gota de água destilada estéril no centro da lâmina de microscopia.
III – Retirar uma pequena amostra da colônia (uma colônia que esteja isolada na placa de Petri) e depositar junto a água.
IV – Espalhar o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.
V – Fixar o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, repetindo estes movimentos 3 vezes para que o material fique bem aderido.
VI – Coloca-se a lâmina com o esfregaço sobre um suporte.
VII – Cobrir a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixar agir por 1 minuto. Esse processo faz com que o cristal violeta se fixe no peptidoglicano. 
VIII – Lave a lâmina em água corrente, ao lado contrário do esfregaço.
IX – Cobrir a lâmina com lugol (Gram II), deixar agir por 1 minuto e depois lavar novamente a lâmina, esse processo vai fazer com que o lugol liga-se no cristal violeta para aumentar o tamanho da molécula.
X – Cobrir a lâmina com solução de álcool-acetona (Gram III), verificando a descoloração que deve ocorrer em cerca de 10 segundos e lave novamente a lâmina. Esse processo de gotejar o álcool-acetona faz as bactérias de parede celular com lipídios, desgrudar-se da parede externa.
XI – Cobrir a lâmina com fuscina (Gram IV), deixar agir por 30 segundos, e novamente lavar a lâmina.
XII – Seque inicialmente o lado oposto da lâmina do esfregaço, com papel toalha, e a seguir seque o restante da lâmina levemente sem esfregar.
XIII – Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão (não esquecendo de colocar uma gota de óleo para a imersão sobre o esfregaço).
Resultados e discussões:
Após o processo da coloração de Gram, verificou-se no microscópio o resultado final da lâmina preparada. Deu-se início com o microscópio, na objetiva de 4x, utilizando o óleo na lâmina para a objetiva de 100x. Observou-se a coloração fim da qual ficou rosa avermelhada, apresentando bactérias Gram-negativas.
Conclusão:
A amostra coletada foi classificada como bastonete Gram-positiva. As bactérias Gram-positivas coram-se em vermelho, enquanto as bactérias Gram-negativas coram-se em roxo. Esta técnica de coloração permite a diferenciação entre as bactérias com parede celular mais ricas em peptidoglicano ou menos ricas. Embora uma bactéria Gram-negativa nunca possa corar-se positivamente pelo Gram, e uma bactéria estruturalmente Gram-positiva pode corar-se negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada.
 Bastonete Gram-negativo, visualizado a partir do microscópio óptico
 Umas das etapas de coloração de Gram.
 Placa de Petri com colônias de bactérias
Bibliografia:
LIBERTO, M. I. M.; CABRAL, M. C.; LINS, U. G. C. (2006). Microbiologia. 
V.1. 2. ed. Rio de Janeiro: Fundação Cecierj, 2006. 62,63,64,65 pp. 
 
SITE INFO ESCOLA/STREPTOCOCCUS <http://www.infoescola.com/reino-
monera/streptococcus/> 
Acessado em 28 de agosto 2013