Relatório da técnica de coloração de gram e ziehl-neelsen

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INSTITUTO FEDERAL DA PARAÍBA
CURSO DE BACHARELADO EM VETERINÁRIA
DISCIPLINA: Microbiologia Veterinária
PROFESSORA: Gláucia D. A. Medeiros
Relatório das vídeo aulas de I- coloração gram e II- Ziehl-Neelsen.
AUTORES:
Ryandro Martins de Sousa 
Ynara Heloisa da Silva Rosa 
Sousa - PB
24 de novembro de 2021.
I. INTRODUÇÃO 
 A técnica de coloração Gram foi inventada em 1884 por um médico dinamarquês, chamado Hans Christian Gram. Ao longo dos anos passou por diversas modificações, porém o mecanismo é o mesmo. A técnica consiste em utilizar o cristal violeta (no início usava-se a violeta de genciana), o lugol, o álcool etílico, a acetona (pouco utilizado atualmente) e a fucsina (borante básico) ou a safranina (corante ácido) como conta corante. Esse mecanismo de coloração diferencia as bactérias gram positivas, que ao final da coloração serão visualizadas de cor roxa e as gram negativas serão visualizadas de cor rosa. A coloração de Gram é uma ferramenta laboratorial muito importante por ser um método tintorial simples, rápido e eficaz para diagnósticos, tornou-se assim o método mais utilizado na Microbiologia.
 A técnica de coloração Ziehl-Neelsen é muito utilizada para bactérias que não se coram por gram, as bactérias coradas por essa técnica diferenciam-se pelo alto teor de ácido micólico que possuem e pelo material seroso nas paredes celulares. Portanto, a técnica de Ziehl-Neelsen é responsável por realizar a coloração das bactérias que são álcool-ácidos resistentes, essas bactérias são as pertencentes ao gênero mycobacterium que irão englobar duas espécies bastante importantes que é o M. tuberculosis, causadora da tuberculose e o M. Leprae, que é o agente causador da hanseníase. O outro gênero de bactérias que se coram por essa técnica é o Nocardia.
 Dessa maneira, objetivou-se por meio desse relatório o melhor embasamento sobre as técnicas fundamentais na área de microbiologia, que futuramente poderá ser colocado em prática no laboratório. 
II. MATERIAL E MÉTODOS
Aula Prática I:
 A video-aula intitulada de: “Coloração de Gram” foi disponibilizada pela professora Gláucia D. A. Medeiros e ministrada pelo professor e farmacêutico microbiologista, Felipe Magalhães, na plataforma Youtube. Para demonstrar como é realizada a técnica de Gram propriamente dita em laboratório os materiais utilizados foram: equipamentos de proteção individual (luvas e máscara), bico de bunsen, alça de platina, tubo de ensaio contendo microrganismos, lâminas de vidro, suporte, pipeta com água destilada e o microscópio para a visualização. Os materiais usados para corar os microrganismos foram: violeta de genciana, lugol, álcool e acetona, fucsina simples, água destilada e o recipiente que vai servir de suporte para as lâminas. 
Ao iniciar a vídeo aula, o professor Felipe explicou sobre a importância do uso dos equipamentos de proteção e de não conversar em laboratórios, em seguida adicionou uma gota de água destilada na lâmina de vidro para facilitar na hora de espalhar o microrganismo na lâmina. O fogo do bico de Bunsen deve estar entre o analista e a amostra, pois existe uma zona de esterilidade ao redor. Após isso, foi flambada a alça de platina, fazendo um processo de esterilização a calor seco, após essa alça ter sido retirada do fogo, aguardou-se um período de 20 a 30 segundos para esfriar. Dessa maneira, foi retirada a amostra que estava dentro do tubo de ensaio, antes da retirada da amostra a ponta do tubo de ensaio foi flambada no bico de Bunsen para se evitar possíveis contaminações, colocou-se a alça sem encostar dentro do tubo e foi retirado superficialmente um pouco da amostra, logo após a retirada a ponta do tubo de ensaio novamente foi flambada e só depois fechado e adicionado de volta a seu lugar no suporte. Na lâmina de vidro que já estava com a gota de água destilada espalhou-se os microrganismos, que foram retirados do tubo de ensaio, ao máximo na superfície da lâmina de vidro, para conseguir separar as células e facilitar a visualização. Depois disso, foi flambado novamente a alça para guardá-la. Dessa forma, iniciou-se o processo de fixação do microrganismo na lâmina, com o movimento de vai e volta sobre o fogo do bico de Bunsen para que a água destilada colocada no início do processo evaporasse e o organismo fosse fixado.
Na parte da coloração propriamente dita, foi usado um pote de sorvete com palitos de churrasco para dar suporte às lâminas, evitando sujar a bancada. Começou o processo de coloração com a violeta genciana, no qual encharcou-se a lâmina com a violeta de genciana e foi contado um minuto com esse corante sobre os microrganismos que estavam na lâmina. Com o tempo previsto, retirou o excesso do corante e acrescentou-se lugol, por um minuto e depois houve a remoção. Dessa maneira, retirou o excesso e passou para a terceira parte da técnica que é a lavagem com álcool e a acetona, para tirar o excesso de corante, e depois realizou-se uma lavagem com água destilada. Depois disso, foi colocado a fucsina simples e esperou 45 segundos com esse corante para que mesmo agir sobre a parede celular dos microrganismos. Retira-se o excesso de fucsina, colocando a lâmina inclinada e lava-se com água destilada para retirar o excesso de fucsina. E por último, é necessário esperar a lâmina secar para ser levada ao microscópio. 
Aula Prática II:
A segunda aula prática deu-se por meio de uma vídeo aula disponibilizada pela professora Glaúcia D. A. Medeiros. A vídeo aula intitulada de “Coloração de Ziehl-Neelsen | álcool-ácido resistente” foi ministrada pela mestra em Biomedicina, Mayara Polli, na plataforma YouTube. A mestra explica que a coloração de Ziehl-Neelsen é utilizada para corar bactérias que não são coradas por coloração de Gram, segundo a mesma, bactérias com altos teor de ácido micólico e com material ceroso em sua parede celular necessitam da coloração especial de Ziehl-Neelsen.
Para realizar a coloração Ziehl-Neelsen, os materiais utilizados na vídeo aula foram: Lâmina, carbolfucsina, água corrente, Álcool-ácido (etanol 95% e ácido nítrico 3%), azul de metileno, bico de Bunsen, pinça, meio de cultura, Recipiente para dar apoio para lâmina e água destilada. Primeiramente houve a preparação da lâmina com o esfregaço a partir do meio de cultura com o auxílio de uma palheta. Com uma pinça, segurou-se a lâmina e passou a mesma sobre o bico de Bunsem com movimentos horizontais rápidos. Logo após a lâmina foi colocada em suporte sobre um recipiente para aplicação dos corantes. Adicionou-se a fucsina fenicada sobre toda a lâmina, a lâmina ainda com a fucsina foi aquecida até a emissão de vapor e Durante cinco minutos de coloração foram realizados três aquecimentos, sem que ocorresse a fervura. A lâmina foi inclinada para a retirada do corante e depois houve a aplicação de água destilada. Com auxílio de uma pinça a lâmina foi deixada um pouco inclinada e aplicou-se a solução álcool-ácida e depois, novamente foi feita a aplicação de água destilada. Em seguida o azul de metileno foi adicionado por um tempo de 30 segundos sobre a lâmina e depois inclinou a para a retirada do corante. A lâmina foi lavada novamente com água destilada e assim conclui-se o processo de coloração, permitindo que a lâmina fosse levada para o microscópio para observação.
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na vídeo aula de coloração gram, foi possível visualizar no microscópio, na objetiva de 100x, que possui um aumento de mil vezes, bacilos gram negativos, pois os microrganismos visualizados possuíam a forma de bastão e a coloração rosa após aplicação da técnica de gram. 
Na outra amostra, observou-se a diferença, pois visualizou-se bactérias roxas, na objetiva de 100x vemos as células roxas, que são corpos gram positivos, diferente da amostra anterior.
A partir da visualização no microscópio da lâmina que foi corada pelo método Ziehl-Neelsen, foi possível observar bacilos vermelhos, indicando que são bacilos álcool-ácido-resistentes.
IV. CONCLUSÃO
Desse modo, com a primeiravídeo aula ministrada pelo professor Felipe, fica evidenciado o passo a passo de como é realizada e os materiais necessários para coloração de Gram, também pode-se ter uma noção real das células gram-positivas e gram-negativas ao microscópio. Nas videos aulas 2 e 3 aprendemos sobre a coloração especial de Ziehl-Neelsen, quando, como e o que é necessário para realizar essa coloração. Além do mais vemos na aula um bacilo álcool-ácido resistente pelo microscópio e também descobrimos que as bactérias pertencentes ao gênero mycobacterium são coradas por essa coloração especial por terem alto teor de ácido micólico e material seroso na parede celular.
Também foi possível aprender a diferença entre os tipos de coloração, a importância de cada uma e a forma correta de realizá-las, as vídeos aulas trouxeram informações pertinentes para aprimorar os nossos conhecimentos.
V. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRASIL. Técnica de Coloraçao de Gram. Ministério da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. Brasília, 1997.Série TELELAB. Disponível via URL em: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf Acesso em: 22 de Nov. de 2021.
JACOB, F. R., GATTI L. L. Importância da coloração de gram no diagnóstico microbiològico e variações na sua execução. In: XV Congresso de Iniciação Científica Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. Disponível via URL em : https://cic.unifio.edu.br/anaisCIC/anais2016/pdf/09_05.pdf Acesso em: 21 de Nov. de 2021.