monografia Grenville versão final

•

UFAC

Grenville Antonio

21/11/2017

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Fitopatologia

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GRENVILLE ANTONIO SOUZA DOS SANTOS

RIO BRANCO - AC
2017

AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO DE ISOLADOS DE
TRICHODERMA SPP. COM RHIZOCTONIA SPP. IN VITRO

GRENVILLE ANTONIO SOUZA DOS SANTOS

AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO DE ISOLADOS DE
TRICHODERMA SPP. COM RHIZOCTONIA SPP. IN VITRO

Monografia apresentada ao Curso de
Engenharia Agronômica, Centro de Ciências
Biológicas e da Natureza, Universidade
Federal do Acre, como parte das exigências
para obtenção do título de Engenheiro
Agrônomo.
Orientador: Dr. Rivadalve Coelho Gonçalves

RIO BRANCO – AC
2017

Aos meus familiares,
Pelo carinho e amor
Dedico.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus autor da vida e dono de tudo que me deu forças para poder
chegar até aqui.
Aos meus pais José Jerôncio e Maria do Socorro por todo apoio.
Aos meus amigos e colegas que a Engenharia Agronômica me presenteou
Priscila Batistela, Raiury Santos, Dayanne Fonteneles por todo incentivo nos
momentos de dificuldades.
Ao meu orientador Dr. Rivadalve Coelho Gonçalves pela orientação e
aprendizado.
Aos professores do Curso de Engenharia Agrônomica por me apresentarem o
que é ser um Engenheiro Agronômo.
A professora Sandra Ribeiro por todo incentivo.
Aos que me ajudaram na realização desse trabalho Paulo Macedo e Giovanna
Teixeira.

Corra, lute, busque,
Mas nunca desista de seus sonhos

Autor desconhecido

RESUMO

O fungo Rhizoctonia solani causa importantes doenças nas plantas cultivadas no
Acre. Em seringueira (Hevea spp.) o fungo causa a mancha-areolada, principalmente,
no jardim clonal de viveiro, além de causar doenças e provocar a perda de biomassa
em amendoim forrageiro (Arachis pintoi cv. BRS Mandobi) e braquiária (Brachiaria
brizantha cv. Marandu), dentre outras espécies. Produtos biológicos poderão compor
os métodos de controle dessas doenças. O controle biológico é uma alternativa para
a sustentabilidade da produção com qualidade elevada. Com o objetivo de avaliar a
interação de isolados de Trichoderma spp. obtidos de diferentes órgãos de plantas
cultivadas no Acre e matéria orgânica do solo a partir do horizonte O de floresta
primária, florestas plantadas de seringueira, de eucalipto e pastos com braquiária,
com isolados de Rhizoctonia spp. obtidos de Hevea brasiliensis, Arachis pintoi cv.
BRS Mandobi e Brachiaria brizantha cv. Marandu foi realizado este trabalho. Os
resultados obtidos, mostraram que houve interação diferencial entre isolados de
Trichoderma spp. e isolados de Rhizoctonia spp., sendo que, para os isolados de
Rhizoctonia spp. CMEA230, obtido de A. pintoi cv. BRS Mandobi, CMEA231, obtido
de Brachiaria brizantha cv. Marandu e CMEA254, obtido de Hevea brasiliensis, o
isolado de Trichoderma spp. mais eficiente, com menor nota de Índice de Colonização
do Meio de Cultura, ICM, foi o CMEA252, não diferindo estatisticamente do isolado de
Trichoderma spp. CMEA250 contra o isolado de Rhizoctonia spp. CMEA254, pelo
teste Tukey a 5% de probabilidade. Na análise de agrupamento de médias pelo teste
Scott-Knott o isolado CME252 também foi mais eficiente, com menor ICM no
pareamento com Rhizoctonia spp. CMEA230, CMEA231 e CMEA254. Para os
isolados de Rhizoctonia spp. CMEA230, CMEA231 e CMEA254, os isolados de
Trichoderma spp., CMEA185, CMEA207, CMEA218, CMEA234 e CMEA252
reduziram o Número de Escleródios produzidos pelo patógeno, NESC, mas para
Rhizoctonia spp. CMEA231 as médias de todos os tratamentos não diferiram
estatisticamente de três e, para Rhizoctonia spp. CMEA254, as médias dos
tratamentos, com exceção da média do CMEA200, não diferiram de zero pelo teste
Tukey a 5% de probabilidade. Pelo teste Scott-Knott os isolados de Trichoderma spp.
CMEA185, CMEA204, CMEA206, CMEA216, CMEA218 e CMEA252 pertencem ao
grupo 1 de isolados que propiciaram baixo Número de Escleródios para os três
isolados de Rhizoctonia spp. O número total de isolados de Trichoderma spp. reunidos

neste grupo foi 22, 12 e 19 para Rhizoctonia spp. CMEA230, CMEA231 e CMEA254
respectivamente. O estudo da interação permitiu agrupar os isolados de Trichoderma
spp. em classes de antagonismo formadas pela combinação da amplitude do ICM, da
sobrevivência do patógeno no disco de micélio utilizado como inóculo inicial e do
Número de Escleródios produzidos pelo patógeno no meio de cultura. A quantidade
de isolados de Trichoderma spp. por isolado de Rhizoctonia spp. e por classe de
antagonismo foi variável neste estudo, sendo possível constatar dois, um e 13
isolados na classe Alto Muito Agressivo, AMA, para Rhizoctonia spp. CMEA230,
CMEA231 e CMEA254 respectivamente.

Palavras-chave: antagonismo, fitopatologia, patologia florestal, controle biológico,
doenças de plantas, controle de doenças, produto biológico.

ABSTRACT

The fungus Rhizoctonia solani causes important diseases in plants grown in Acre. In
rubber tree (Hevea spp.), the fungus causes the target leaf spot, mainly in the clonal
nursery garden, and cause disease the loss of biomass in Arachis pintoi (cv. BRS
Mandobi) and brachiaria (Brachiaria brizantha cv. Marandu), among other species.
Biological products may comprise methods of controlling these diseases. Biological
control is an approach for the sustainability of production with high quality. In order to
evaluate the interaction of Trichoderma spp. obtained from different organs of plants
grown in Acre and organic matter from O horizon of the soil from the amazonian
primary forest, planted forest of rubber tree, eucalyptus and pasture with brachiaria,
with Rhizoctonia spp. obtained from Hevea brasiliensis, Arachis pintoi cv. BRS
Mandobi and Brachiaria brizantha cv. Marandu was carried out this work. The results
showed that there was a differential interaction between Trichoderma spp. and isolated
from Rhizoctonia spp., and for Rhizoctoniaspp. CMEA230, obtained from A. pintoi cv.
BRS Mandobi, CMEA231, obtained from Brachiaria brizantha cv. Marandu and
CMEA254, obtained from Hevea brasiliensis, the Trichoderma spp. more efficient, with
lower Culture Medium Settlement Index, MSI, was the CMEA252, not statistically
different from the Trichoderma spp. CMEA250 against the isolate of Rhizoctonia spp.
CMEA254, by the Tukey test at 5% probability. In the cluster analysis of the means by
the Scott-Knott test the isolate CME252 was also more efficient, with lower MSI in the
pairing with Rhizoctonia spp. CMEA230, CMEA231 and CMEA254. For the isolates of
Rhizoctonia spp. CMEA230, CMEA231 and CMEA254, the isolates of Trichoderma
spp., CMEA185, CMEA207, CMEA218, CMEA234 and CMEA252 reduced the number
of sclerotia produced by the pathogen, NSC, but for Rhizoctonia spp. CMEA231 the
means of all treatments did not differ statistically from three and, for Rhizoctonia spp.
CMEA254, the means of treatments, with the exception of the mean of the CMEA200,
did not differ from zero by the Tukey test at 5% of probability. By Scott-Knott test the
isolates of Trichoderma spp. CMEA185, CMEA204, CMEA206, CMEA216, CMEA218
and CMEA252 belong to group 1 of isolates that provided the low number of sclerotia
for the three isolates of Rhizoctonia spp. The total number of Trichoderma spp. in this
group was 22, 12 and 19 for Rhizoctonia spp. CMEA230, CMEA231 and CMEA254
respectively. The interaction study allowed to group the isolates of Trichoderma spp.
in classes of antagonism formed by the combination of the MSI amplitude, the survival

of the pathogen in the mycelial disc used as initial inoculum and the number of sclerotia
produced by the pathogen in the culture medium. The amount of Trichoderma spp. by
isolate of Rhizoctonia spp. and by class of antagonism was variable in this study, being
possible to verify two, one and 13 isolates in the class High Very Aggressive, HVA, for
Rhizoctonia spp. CMEA230, CMEA231 and CMEA254 respectively.

Key words: antagonism, phytopathology, forest pathology, biological control, plant
disease, disease control, biological product

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Taxonomia de Rhizoctonia solani e Thanatephorus cucumeris. ............. 26
Tabela 2 - Taxonomia de Hypocrea rufa e Trichoderma spp. .................................. 28
Tabela 3 - Fungicidas a base de Trichoderma spp. disponíveis no mercado brasileiro.
............................................................................................................... 33
Tabela 4 - Escala numérica descritiva para a classificação do antagonismo de
Trichoderma spp. por Índice de Colonização do Meio de Cultura adaptado
de Bell et al., (1982). .............................................................................. 39
Tabela 5 - Classes de antagonismo formadas pela combinação da amplitude do Índice
de Colonização do Meio de Cultura, sobrevivência do patógeno e Número
de Escleródios. ....................................................................................... 41
Tabela 6 - Códigos, órgãos vegetais e plantas utilizadas no isolamento de Rhizoctonia
spp. ........................................................................................................ 44
Tabela 7 - Análise de correlação linear de Pearson para o Experimento 1 de acordo
com os códigos da Tabela apêndice B. .................................................. 47
Tabela 8 - Análise de correlação linear de Pearson para o experimento 2 de acordo
com os códigos da Tabela apêndice B. .................................................. 48
Tabela 9 - Análise de correlação linear de Pearson para o conjunto total de dados de
acordo com os códigos da Tabela apêndice B. ...................................... 48
Tabela 10 - ANOVA antecedente para o cálculo dos resíduos para o experimento 1 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) de acordo com
os códigos da Tabela apêndice B. ......................................................... 49
Tabela 11 - Testes de normalidade do erro - variável Índice de Colonização do Meio de
Cultura (ICM) - experimento 1. .................................................................. 50
Tabela 12 - Teste de homogeneidade de variância - variável Índice de Colonização do
Meio de Cultura (ICM) - experimento 1. ................................................. 51
Tabela 13 - Análise de variância discriminando os fatores - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 1. ........................ 52
Tabela 14 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA230 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 1.
............................................................................................................... 53
Tabela 15 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA230 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 1. ........................ 54

Tabela 16 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA231 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 1
de acordo com os códigos da Tabela apêndice B. ................................. 54
Tabela 17 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA231 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 1. ........................ 55
Tabela 18 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA254 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 1.
............................................................................................................... 56
Tabela 19 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA254 - experimento 1 - variável
- Índice de Colonização do Meio de Cultura. .......................................... 57
Tabela 20 - Análise de variância - variável Índice de Colonização do Meio de Cultura
(ICM) - experimento 1. ............................................................................. 58
Tabela 21 - Teste de Tukey - variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) -
experimento 1. ........................................................................................ 59
Tabela 22 - Análise de resíduos - variável Número de Escleródios (NESC) - experimento 1.
............................................................................................................... 60
Tabela 23 - Testes de normalidade do erro - variável Número de Escleródios (NESC)
- experimento 1. .................................................................................... 61
Tabela 24 - Teste de homogeneidade de variância - variável Número de Escleródios
(NESC) - experimento 1. ....................................................................... 61
Tabela 25 - Análise de variância discriminando os fatores - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 1. .................................................... 63
Tabela 26 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA230 -
variável Número de Escleródios (NESC) - experimento 1. ................... 64
Tabela 27 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA230 - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 1. .................................................... 65
Tabela 28 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA231 -
variável Número de Escleródios (NESC) - experimento 1. .................... 66
Tabela 29 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA231 - variável Número de
Escleródios(NESC) - experimento 1. ..................................................... 66
Tabela 30 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA254 -
variável Número de Escleródios - experimento 1. .................................. 67
Tabela 31 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA254 - variável Número de
Escleródios - experimento 1. .................................................................. 68

Tabela 32 - Análise de variância discriminando os fatores - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 1. ..................................................... 69
Tabela 33 - Teste de Tukey para variável Número de Escleródios (NESC) -
experimento 1. ........................................................................................ 70
Tabela 34 – ANOVA antecedente para o cálculocálculo dos resíduos - variável Índice
de Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2 de acordo com
os códigos da Tabela apêndice B. ......................................................... 71
Tabela 35 - Teste de normalidade do erro - variável Índice de Colonização do Meio de
Cultura (ICM) - experimento 2 de acordo com os códigos da Tabela
apêndice B. ............................................................................................ 72
Tabela 36 - Teste de homogeneidade de variância - variável Índice de Colonização do
Meio de Cultura (ICM) - experimento 2. ................................................. 73
Tabela 37 - Análise de variância discriminando os fatores - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2 de acordo com os
códigos da Tabela apêndice B. .............................................................. 74
Tabela 38 - Análise de variância discriminando os fatores para Rhizoctonia spp. -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2
de acordo com os códigos da Tabela apêndice B. ................................. 75
Tabela 39 - Teste de Tukey discriminando o fator Trichoderma spp. para Rhizoctonia
spp. CMEA230 - variável Índice de Colonização do Meio de Cultura
(ICM) - experimento 2. 76
Tabela 40 - Análise de variância discriminando os fatores para Rhizoctonia spp.
CMEA230 - variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) -
experimento 2. ........................................................................................ 77
Tabela 41 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA230 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2. ........................ 77
Tabela 42 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA231 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2.
............................................................................................................... 78
Tabela 43 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA231 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2 de acordo com os
códigos da Tabela apêndice B. .............................................................. 79

Tabela 44 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA254 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2.
............................................................................................................... 80
Tabela 45 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA254 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) - experimento 2. ........................ 81
Tabela 46 - Análise de variância - variável Índice de Colonização do Meio de Cultura
(ICM) - experimento 2. ........................................................................... 82
Tabela 47 - Teste de Tukey para antagonismo - variável Índice de Colonização do
Meio de Cultura (ICM) - experimento 2. ................................................. 82
Tabela 48 – ANOVA antecedente ao cálculo dos resíduos - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 2. ..................................................... 84
Tabela 49 - Testes de normalidade do erro - variável Número de Escleródios (NESC)
- experimento 2. ..................................................................................... 85
Tabela 50 - Homogeneidade de variância - variável Número de Escleródios (NESC) -
experimento 2. ........................................................................................ 85
Tabela 51 - Análise de variância - variável Número de Escleródios (NESC) -
experimento 2. ........................................................................................ 87
Tabela 52 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA230 -
variável Número de Escleródios (NESC) - experimento 2 de acordo com
os códigos da Tabela apêndice B. ......................................................... 88
Tabela 53 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA230 - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 2. ..................................................... 89
Tabela 54 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA231 -
variável Número de Escleródios (NESC) - experimento 2. ..................... 89
Tabela 55 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA231 - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 2. ..................................................... 90
Tabela 56 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA254 -
variável Número de Escleródios (NESC) - experimento 2. ..................... 91
Tabela 57 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA254 - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 2. ..................................................... 92
Tabela 58 - Análise de variância discriminando os fatores - variável Número de
Escleródios (NESC) - experimento 2. ..................................................... 93
Tabela 59 - Teste de Tukey - variável Número de Escleródios (NESC) - experimento
2. ............................................................................................................ 93

Tabela 60 - Razão de variâncias para o experimento 1 e 2, variáveis (IC) e (NESC.).
............................................................................................................... 94
Tabela 61 - Análise de variância para a variável dependente Índice de Colonização do
Meio de Cultura (ICM) do conjunto total de dados de acordo com os
códigos da Tabela apêndice A. .............................................................. 95
Tabela 62 - Testes de normalidade do erro - variável Índice de Colonização do Meio
de Cultura (ICM) do conjunto total de dados de acordo com os códigos da
Tabela apêndice A. ............................................................................... 96
Tabela 63 - Análise de variância - variável Índice de Colonização do Meio de Cultura
(ICM) do conjunto total de dados. .......................................................... 96
Tabela 64 - Análise de homogeneidade de variância - variável Índice de Colonização
do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total de dados de acordo com os
códigos da Tabela apêndice A. ............................................................. 97
Tabela 65 - Análise de variância discriminando os fatores principais e de interação -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total
de dados................................................................................................. 97
Tabela 66 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA230 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total
de dados de acordo com os códigos da Tabela apêndice A. ................ 99
Tabela 67- Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA230 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total de dados. ..... 100
Tabela 68 - Análise de variância precedente ao Scott-Knott para Rhizoctonia spp.
CMEA230 – variável ICM dos dados da Tabela em apêndice . ........... 101
Tabela 69 - Teste de agrupamento de médias de Scott-Knott para Rhizoctonia spp.
CMEA230 – variável ICM dos dados da Tabela em apêndice A. ......... 101
Tabela 70 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA231 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total
de dados............................................................................................... 102
Tabela 71 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA231 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total de dados. ..... 103
Tabela 72 - Análise de variância precedente ao Scott-Knott para Rhizoctonia spp.
CMEA231 – variável ICM dos dados da Tabela em apêndice A. ......... 104
Tabela 73 - Teste de agrupamento de médias de Scott-Knott para Rhizoctonia spp.
CMEA231 – variável IC dos dados da Tabela em apêndice . .............. 105

Tabela 74 - Análise de variância discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA254 -
variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total
de dados de acordo com os códigos da Tabela apêndice A. .............. 106
Tabela 75 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA254 - variável Índice de
Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total de dados. ..... 106
Tabela 76 - Análise de variância precedente ao Scott-Knott para Rhizoctonia 254 –
variável ICM dos dados da Tabela em apêndice A. ............................. 108
Tabela 77 - Teste de agrupamento de médias de Scott-Knott para Rhizoctonia 254 –
variável ICM dos dados da Tabela em apêndice A. ............................. 108
Tabela 78 - Análise de variância todos os tratamentos com a variável ICM - variável
Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM) do conjunto total de
dados de acordo com os códigos da Tabela apêndice A. ................... 109
Tabela 79 - Teste de Tukey - variável Índice de Colonização do Meio de Cultura (ICM)
do conjunto total de dados. .................................................................. 110
Tabela 80 - Análise de variância para a variável dependente Número de Escleródios
(NESC) de acordo com os códigos da Tabela apêndice A.................. 111
Tabela 81- Testes de normalidade do erro - variável Número de Escleródios (NESC).
............................................................................................................. 112
Tabela 82 - Análise de variância - variável Número de Escleródios (NESC). ......... 113
Tabela 83 - Análise de variância discriminando os fatores principais e de interação -
variável Número de Escleródios (NESC). ............................................ 114
Tabela 84 - Análise de variâcia discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA230 -
variável Número de Escleródios (NESC). ............................................ 115
Tabela 85 - Teste de Tukey para o isolado Rhizoctonia spp. CMEA230 - variável
Número de Escleródios (NESC). .......................................................... 116
Tabela 86 - Análise de variância precedente ao teste de Scott-Knott para Rhizoctonia
spp. CMEA230 - variável NESC. dos dados da Tabela em apêndice A.
............................................................................................................. 117
Tabela 87 - Teste de agrupamento de médias de Scott-Knott para Rhizoctonia spp.
CMEA230 – variável NESC. dos dados da Tabela em apêndice . ....... 117
Tabela 88 - Análise de variâcia discriminando o fator Rhizoctonia spp. CMEA231 -
variável Número de Escleródios (NESC). ............................................ 118
Tabela 89 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA231 - variável Número de
Escleródios (NESC). ............................................................................ 119

Tabela 90 - Análise de variância precedente ao teste de Scott-Knott para Rhizoctonia
spp. CMEA231 - variável NESC. dos dados da Tabela em apêndice A.
............................................................................................................. 120
Tabela 91 - Teste de agrupamento de médias de Scott-Knott para Rhizoctonia spp.
CMEA231 – variável NESC. dos dados da Tabela em apêndice . ....... 121
Tabela 92 - Análise de variância para o isolado de Rhizoctonia spp. CMEA254 -
variável Número de Escleródios (NESC). ............................................ 122
Tabela 93 - Teste de Tukey para Rhizoctonia spp. CMEA254 - variável Número de
Escleródios (NESC). ............................................................................ 122
Tabela 94 - Análise de variância precedente ao teste de Scott-Knott para Rhizoctonia
CMEA254 - variável NESC. dos dados da Tabela em apêndice A. ..... 124
Tabela 95 - Teste de agrupamento de médias de Scott-Knott para Rhizoctonia spp.
CMEA254 – variável NESC. dos dados da Tabela em apêndice A. ..... 124
Tabela 96 - Análise de variância para o tratamento - variável Número de Escleródios
(NESC). variável NESC. dos dados da Tabela em apêndice A. ........... 125
Tabela 97 - Agrupamento de Tukey das médias de todos os tratamentos com
pareamentos para a variável NESC (Número de Escleródios)............. 126

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Amostra de folha de Theobroma grandiflorum cupuaçuzeiro com vassoura
de bruxa (A), coleta de raiz de Calycophyllum spruceanum mulateiro (B).
............................................................................................................... 35
Figura 2 – Isolados de Trichoderma spp. armazenados pelo método de Castellani em
geladeira a cerca de 5 ºC. ...................................................................... 37
Figura 3 - Colônias de Trichoderma spp. de raiz (A) e de folhas (B) de Eucalyptus spp.
em meio BDA. ........................................................................................ 43
Figura 4 - Frequência de isolados de Trichoderma spp. a partir de órgãos vegetais e
matéria orgânica do solo. ....................................................................... 43
Figura 5 - Colônias de Rhizoctonia spp. em meio Ágar-V8. CMEA 230 (A), CMEA 231
(B) e CMEA 254 (C). .............................................................................. 44
Figura 6 - Pareamento de Trichoderma spp. versus Rhizoctonia spp. ...................... 46
Figura 7 - Frequência de ocorrências de resultados por classes de antagonismo para
cada isolado de Rhizoctonia spp. ........................................................... 47

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 20
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 23
2.1 O FUNGO RHIZOCTONIA SPP. ......................................................................... 25
2.2 FUNGOS TRICHODERMA SPP. ........................................................................ 27
2.3 PRODUTOS COMERCIAIS COM TRICHODERMA SPP. ................................... 32
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 34
3.1 ISOLAMENTO DE TRICHODERMA SPP. A PARTIR DE ÓRGÃOS DE PLANTAS
..................................................................................................................................34
3.2 ISOLAMENTO DE RHIZOCTONIA SPP. ............................................................ 35
3.3 ISOLAMENTO DE TRICHODERMA SPP. A PARTIR DA MATÉRIA ORGÂNICA
DO SOLO .................................................................................................................. 35
3.4 PURIFICAÇÃO E ARMAZENAMENTO DOS ISOLADOS ................................... 37
3.5 TESTE DE ANTAGONISMO ............................................................................... 38
3.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................... 41
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 42
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 43
5 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 129
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 131
APÊNDICES ........................................................................................................... 138

1 INTRODUÇÃO

O crescimento populacional humano tem exigido do setor agrícola uma produção
mais elevada de alimentos. Dentre os fatores que diminuiem a quantidade e a qualidade
de produtos agrícolas e florestais, estão as doenças de plantas. Para evitar que as
atividades agropecuárias sejam inviáveis tecnicamente e economicamente o controle de
doenças com o devido suporte tecnológico é fundamental. Porém, a utilização de alguns
defensivos agrícolas sem conhecimento técnico tem resultado em alimentos
contaminados por resíduos químicos em função da não observância do período de
carência (MORANDI; BETTIOL, 2009).
Um grupo de tecnologias e de técnicas agrícolas e florestais que são eficazes
para o controle de doenças de plantas com baixa probabilidade de impacto ambiental
negativo é aquele que utiliza agentes biológicos diretamente ou indiretamente no
sistema de produção (LOBO JÚNIOR; GERALDINE; CARVALHO, 2009).
Doença de planta é um distúrbio fisiológico ou alteração estrutural deletéria ao
corpo inteiro da planta ou a um de seus órgãos causado por um patógeno ou um fator
ambiental (AGRIOS, 1978).
As doenças das plantas, no conceito de controle biológico, são as alterações
fisiológicas ou estruturais deletérias resultante da interação entre fitopatógeno e a
planta hospedeira, considerando a influência de outros fatores, como os
microrganismos não patogênicos presentes no sítio de infecção que podem limitar ou
aumentar a atividade do patógeno ou a resistência da planta hospedeira (COOK;
BAKER, 1983 apud BETTIOL; GHINI, 2009)1 (COOK, 1985).
O controle biológico de doenças de plantas é a redução da quantidade de
doença ou do potencial de inóculo de um fitopatógeno diretamente ou indiretamente
por agentes biológicos. Outro aspecto importante é que em um senso amplo, o ser
humano ao modificar o meio ambiente com algum produto natural pode favorecer a
ação de agentes de biocontrole, ou seja, tornando-se um agente indireto de controle
biológico (GARRET, 1965).
O controle de doenças de plantas com produtos biológicos é possível podendo
inclusive ocasionar o aumento da produção agrícola e florestal mantendo o equilíbrio
de populações no agroecossistema (MACHADO et al, 2012).

1 COOK, R. J.; BAKER, K. F. The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens.
Saint Paul, Minessota: American Phytopathological Society, 1983. apud BETTIOL et al., 2009.
21

Dentre os fungos que causam doenças em plantas no Acre, está Rhizoctonia
solani Kühn encontrado causando a doença queima-de-Rhizoctonia na grama estrela
roxa africana (Cynodon nlemfuensis var. nlemfuensis Vanderyst) utilizada em pastos
cultivados (GONÇALVES et., al 2009). Este fungo causa também a queima-foliar-de-
Rhizoctonia-do-amendoim-forrageiro (Arachis pintoi Krapov. & W .C. Gregory) em Banco
Ativo de Germoplasma e área de produção de sementes (APS) (GONÇALVES et al.,
2014), a mela em mudas de pimenta longa (Piper hispidinervum) na fase de
sementeira (POLTRONIERI et., al 1997), e a mancha-areolada em seringueira (Hevea
brasiliensis Müell. Arg.)2.
O fungo Rhizoctonia solani é um agente etiológico de várias doenças de
plantas, dentre elas destacam-se a mela em feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), a
queima-da-bainha em arroz (Oriza sativa L.), as doenças tombamento e mela em soja
(Glycine max (L.) Merrill) (EMBRAPA, 1999), damping-off no algodoeiro (Gossypium
hirsutum L.) (CHITARRA, 2014), podridão-de-estacas–de-eucalipto–para-
enraizamento em eucalipto (Eucalyptus spp.) (FERREIRA, 1989), que afetam o
desenvolvimento e a produtividade das culturas agrícolas e florestais.
Rhizoctonia solani é um fungo parasita facultativo que sobrevive como saprófita
em tecido morto de plantas e produz escleródios que são estruturas de resistência e
dispersão, tornando-se um patógeno de difícil controle. Em pastos cultivados no Acre,
nenhuma medida de controle tem sido utilizada para combater a queima-de-
Rhizoctonia da grama estrela roxa africana, doença que afetou 6,62% da área da
parcela de 30 m x 30 m avaliada em estudo realizado por Gonçalves et al., (2009).
Em outras culturas, tem-se utilizado fungicidas para o controle de doenças
causadas por Rhizoctonia solani devido a falta de tecnologia de controle biológico
disponível no mercado do Acre, embora no Brasil, existam diversos produtos a base
de agentes biológicos que são de alto custo para os produtores2.
Espécies de Trichoderma spp. apresentam vantagens para o controle biologico
de fitopatógenos pela produção de metabólitos voláteis e não voláteis,
micoparasitismo (CAMPOROTA, 1985), alta taxa de crescimento e habilidade
competitiva por espaço e nutrientes (GUÉDEZ et al. 2009).
Devido a falta de estudos que possam significar um avanço de conhecimento
para o controle biológico de fitopatógenos no Acre, foi realizado esse trabalho com o

2 EMBRAPA – ACRE, Dr. Rivadalve Coelho Gonçalves, (comunicação pessoal).
22

objetivo geral de testar a interação in vitro de isolados de Trichoderma spp. obtidos de
diferentes substratos com Rhizoctonia spp. isoladas causando doença em Arachis
pintoi, Brachiaria brizantha e Hevea brasiliensis.
O trabalho teve como objetivos específicos avaliar o antagonismo dos isolados
de Trichoderma spp. ao fungo Rhizoctonia spp. por meio do Índice de Colonização do
Meio de Cultura em competição com o patógeno e, avaliar o antagonismo de
Trichoderma spp. ao fungo Rhizoctonia spp. por meio da inibição de produção de
escleródios pelo patógeno e morte do micélio do patógeno no inóculo inicial.

2 REVISÃO DE LITERATURA

O controle biológico de doenças de plantas é uma condição sob a qual a atividade
e ou a sobrevivência do patógeno é reduzida pela ação de um outro organismo vivo tendo
como resultado a redução na incidência da doença e no potencial de inóculo (GARRET,
1965).
Em um senso mais amplo, a adição no solo de produtos químicos produzidos
naturalmente que sejam tóxicos aos fitopatógenos pode-se constituir em controle biológico.
Como exemplo, tem-se a adição de alfafa, que contém saponina, ao solo para o controle
de Phytophthora cinnamomi (ZENTMYER; THOMPSON, 1967).
Segundo Cook e Baker (1983)3 o controle biológico é “a redução da soma de inóculoou das atividades determinantes da doença provocada pelo patógeno, realizada por ou
através de um ou mais organismos que não o homem”. Nesta definição, as atividades
determinantes da doença envolvem o crescimento, a infectividade, a virulência, a
agressividade do patógeno, dentre outras.
A definição de Cook e Baker (1983)4 corrobora o fato de que a modificação do
ambiente do solo pela matéria orgânica adicionada pelo homem, sobretudo aumentando a
população de fungos antagonistas com efeito na redução de doenças de plantas é uma
medida de controle biológico porque são os agentes de controle biológico que atuam na
redução da doença após a adição da matéria orgânica, contudo se algum produto natural
oriundo da matéria orgânica adicionada ao solo pelo homem tem efeito na redução de
inóculo do patógeno, o homem também é um agente de controle biológico.
O controle biológico tem-se tornado efetivo no Brasil a partir da pesquisa científica
e do desenvolvimento e produção de produtos comerciais denominados fungicidas
biológicos, que segundo a Lei no 7.802, de 11 de julho de 1989, regulamentada pelo
decreto decreto nº 4.074, de 4 de janeiro de 2002, também são agrotóxicos (BRASIL,
2002).
Segundo Harman (2000) os fungicidas biológicos são atraentes para a agricultura
devido a sua capacidade de atingir nichos em que o controle químico não é capaz de atuar.
Além dessa vantagem, os fungicidas biológicos disponíveis no mercado são menos tóxicos

3 COOK, R. J.; BAKER, K. F. The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens.
Saint Paul, Minessota: American Phytopathological Society, 1983. apud BETTIOL et al., 2009.

4 COOK, R. J.; BAKER, K. F. The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens.
Saint Paul, Minessota: American Phytopathological Society, 1983. apud BETTIOL et al., 2009.

ao ser humano e a fauna, diminuem as chances de seleção de isolados de patógenos
resistentes aos princípios ativos de produtos químicos, são de baixo risco a saúde humana
de pessoas não imunosuprimidas e não contaminam o meio ambiente.
Até o início do século XX pouco se conhecia sobre o controle biológico de
fitopatógenos. A base conceitual e científica sobre o controle biológico de doenças de
plantas foi criada na década de 1970 e somente em meados de 1990 foram produzidos e
comercializados os primeiros antagonistas para controle biológico de doenças no Brasil
(LOPES, 2009).
No entanto, Garret (1950), já havia proposto o termo habilidade competitiva
saprofítica essencial para a compreensão do fenômeno competição como parte do
amensalismo nas relações entre os fungos. A habilidade competitiva saprofítica determina
o sucesso ou o fracasso na colonização saprofítica competitiva de um substrato no solo
por fungos que infectam raízes, a exemplo de Rhizoctonia solani. A competição de fungos
e plantas por nutrientes, água, minerais e oxigênio é um fator importante para a vida no
solo, inclusive para os agentes de controle biológico. Anteriormente, Weindling (1932)
relatou o parasitismo do fungo Trichoderma lignorum a R. solani e outros e, Hartley (1921)
descreveu a supressão de fungos parasitas de plântulas de pínus por Trichoderma spp.
em placas de cultivo preparadas e semeadas com tecido de plantas doentes para diagnose
de damping-off causada por fungos.
A interferência negativa de Trichoderma spp. no trabalho de clínica de Hartley
(1921) o motivou a sugerir a adoção do método de diluição em placas e mais do que isso,
revelou que o fungo Trichoderma spp. apresenta grande capacidade de suprimir patógenos
da doença damping-off do pínus.
O trabalho publicado por Weindling e Fawcett (1936) é o registro do primeiro
experimento destinado a avaliar a eficiência de Trichoderma para o controle biológico da
doença damping-off em plântulas de citrus causada por R. solani.
Em comunidades biológicas com grande quantidade de organismos, a competição
por nutrientes e oxigênio (O2) e a tolerância a metabólitos tóxicos e ao antagonismo são os
principais fatores que contribuem para manter o equilíbrio de populações, de modo que a
alteração de algum ou mais desses fatores pode aumentar o antagonismo existente
(VALDEBENITO-SANHUEZA, 1987b).
A promoção de germinação de estruturas do patógeno, a lise dessas estruturas
(fungilase), o enfraquecimento do patógeno e o aumento da população de antagonistas
25

são efeitos esperados quando são adotadas uma ou mais técnicas agrícolas destinadas
ao controle biológico de doenças de plantas (VALDEBENITO-SANHUEZA, 1987b).
Deve-se atentar também ao fato de que os fungos micorrízicos vesiculares
arbusculares, FMVA, podem ser adicionados as mudas de plantas e propiciarem a
obtenção de efeitos de controle biológico (ZAMBOLIM, 1987). Os mecanismos principais e
os mecanismos acessórios de controle biológico também podem ser resultantes da ação
de fungos ectomicorrízicos associados ou não as raízes de plantas, mas no que concerne
a fase de associação desses fungos com as raízes e a hipótese de formação de uma manta
fúngica como barreira física a penetração de patógenos radiculares deve ser melhor
estudada para a compreensão da possível proteção de plantas por fungos dessa natureza.

2.1 O FUNGO RHIZOCTONIA SPP.

O fungo Rhizoctonia foi descoberto por De Candolle em 1815 (DUGGAR, 1915).
Neste gênero, há relatos de ocorrência de 125 espécies incluindo variedade ou formae
specialis e a espécie tipo Rhizoctonia crocorum Pers. (DC). Algumas dessas espécies
anteriormente descritas, no entanto, são sinonímias de espécies já descritas ou foram
erroneamente identificadas (OGOSHI, 1996).
Moforlogicamente, Rhizoctonia spp. apresentam as seguintes características em
comum: células binucleadas ou multinucleadas, ramificação das hifas jovens em ângulo de
90º próxima ao septo distal, presença de septos do tipo doliporo, ramificações de hifas que
são constritas em sua extremidade basal, ausência de grampos de conexão, ausência de
conídios, produção de escleródios com tecido esclerocial não diferenciado em membrana,
córtex e medula (não é necessária a produção de escleródios, mas se presentes, tecido
esclerocial não é diferenciado) e, ausência de rizomorfas (CARLING; SUMNER, 1992).
A espécie R. solani apresenta isolados com variado grau de pigmentação marrom
nas hifas, septos doliporos bem definidos, células multinucleadas com ramificação das
hifas formando ângulo de 90º, não produzem esporos, as hifas são superiores a 5 µm de
diâmetro, alta taxa de crescimento micelial e patogenicidade (SNEH et al., 1991). Em sua
fase teleomórfica, R. solani é classificada como Thanatephorus cucumeris (A. B. Frank)
Donk e o posicionamento taxonômico de ambas as fases desse fungo está descrito na
Tabela 1.
26

Tabela 1 - Taxonomia de Rhizoctonia solani e Thanatephorus cucumeris.
Fase sexuada Fase assexuada
Regnum: Fungi Regnum: Fungi
Divisio: Basidiomycota Whittaker ex Moore Divisio: Basidiomycota Whittaker ex Moore
Subdivisio: Agaricomycotina Doweld Subdivisio: Agaricomycotina Doweld
Classis: Agaricomycetes Doweld Classis: Agaricomycetes Doweld
Classis: Hyphomycetes *
Classis: Agonomycetes*
Ordo: Cantharellales Gäum Ordo: Cantharellales Gäum
Ordo: Agonomycetales*
Grupo Micelânea: Mycelia Sterilia*
Familia: Ceratobasidiaceae G.W. Martin Familia: Ceratobasidiaceae G.W. Martin
Genus: Thanatephorus Donk Genus: Rhizoctonia De Candolle
Species: Thanatephorus cucumeris Especie: Rhizoctonia solani J.G. Kühn
* = em desuso.
Além das características citadas, a classificação dos fungos do gênero Rhizoctonia
também considera a compatibilidadevegetativa das hifas a qual permite a hibridização
natural e a formação de grupos de anastomose, do inglês, Anastomosis Group (AG) tanto
dentro de Rhizoctonia solani multinucleada quanto dentro de Rhizoctonia spp. binucleada
(VILGALYS, 1988).
O grupo de anastomose, é o meio mais importante na identificação da diversidade
genética de Rhizoctonia solani, porque cada AG pode ser considerado uma entidade
geneticamente independente (KUNINAGA; YOKOSAWA, 1980).
Existem 14 grupos de anastomose de Rhizoctonia solani, identificados como AG-1
a AG-13 e AG-BI (CARLING et al., 2002). Além destes grupos de anastamose,
observações com base em patogenicidade e morfologia, possibilitaram a caracterização
de 23 grupos intraespecíficos, do inglês Intra Specific Group, ISG dentro dos AGs. Como
exemplo podemos citar R. solani AG1, o qual causa a queima-da-bainha do arroz (sheat
blight), além das doenças mela (web blight) e queima (leaf blight) em várias outras culturas.
Os isolados classificados no ISG, AG1-IB, causam o sintoma mela em diversos
27

hospedeiros (web blight fungus) e apesar de ser virulento ao arroz, os sintomas da doença
são diferentes daquele sintoma causado pelos isolados do ISG AG1-IA, que causam
sintomas típicos da doença queima-da-bainha do arroz (rice sheat blight) (OGOSHI, 1987).
Dentro do grupo R. solani os AGs são geneticamente distintos e os ISGs são grupos
evolutivos independentes (VILGALYS, 1994).
Rhizoctonia solani é uma espécie na qual há fungos causadores de doenças em
mudas, frutos, sementes, raízes, caules e folhas de plantas. Rhizoctonia solani é agente
etiológico de várias doenças de diversas culturas como: damping-off no tomateiro
(PORFIRIO-SILVA et al., 1993), mela em estacas de eucalipto para enraizamento
(SILVEIRA et al., 2003), mela em soja (BASSETO et al., 2007) e mancha aureolada em
citros (ISHIDA et al., 2012) entre outras, somando-se 142 espécies hospedeiras (OGOSHI,
1996). O fungo possui grande capacidade de sobrevivência na ausência do hospedeiro
vivo permanecendo viável em tecidos mortos do próprio hospedeiro, de restos culturais ou
na forma de escleródios (HILLOCKS; WALLER, 1997) bem como em tecido vivo de
hospedeiros ou saprofiticamente em tecido morto de planta não hospedeira. Por possuir
estrutura micelial, o fungo sobrevive no solo em estruturas globosas denominadas
escleródios que podem sobreviver no mínimo um ano (DIAS et al., 2013).
A disseminação do patógeno pode ocorrer por implementos agrícolas e florestais
durante o preparo do solo, por meio do uso de ferramentas, sementes e mudas
contaminadas (CAMPOS et al. 2009).

2.2 FUNGOS TRICHODERMA SPP.

Os fungos do gênero Trichoderma, são microrganismos de vida livre, com
reprodução assexuada, encontrados em maior abundância em solos de regiões com clima
temperado e tropical (HARMAN et al., 2000).
Trichoderma spp. são classificadas pela sua fase sexuada, Hypocrea, (Tabela 2),
mas a classificação do fungo pela sua fase assexuada é de grande relevância e coerência
com os isolados em uso na maioria das pesquisas além de ser embasada em sólido
conhecimento científico acumulado historicamente nos trabalhos de taxonomia de fungos.
O gênero Trichoderma foi proposto originalmente por Persoon em 1794 com quatro
espécies (SAMUELS, 1996).
De acordo com o Código Internacional de Nomeclatura Botânica, uma vez
encontrada e conhecida a fase sexuada de um fungo, deve-se adotar o nome da fase
28

sexuada nas publicações. Para efeito de conservar a rastreabilidade a grande quantidade de
literatura verificada com o nome de fase sexuada adotar-se-á nesse trabalho a notação de
ambas as fases como se segue, Hypocrea spp. (anamorfo = Trichoderma spp.). A
macromorfologia de Trichoderma spp. é caracterizada por colônia inicialmente de cor branca
com crescimento rápido em meio de cultura, forma cotonosa e compacta com tufos verdes.
A coloração da colônia pode variar de acordo com a quantidade de conídios. (DOMSCH et
al., 1980 apud SANTIN, R. C., 2008)5.
Trichoderma spp. apresentam conídios unicelulares, com forma subglobosa, ovóide,
elipsóide ou elíptica-cilíndrica, possui textura lisa ou rugosa e coloração hialina, verde-
amarelo ou verde-escuro, sendo a última mais comum. O conídio fica posicionado no ápice
das filiálides, em forma de esfera. As fiálides têm forma de garrafa e com o centro dilatado e
ápice afilado, solitárias ou em grupos, hialinas, formando um ângulo reto com conidióforos.
Os conidióforos são muito ramificados, solitários ou em tufos compactos, geralmente de
formato cônico ou piramidal. Normalmente mostram-se eretos, formando ângulo reto com a
hifa vegetativa. As áreas conidiais apresentam-se em forma de faixas concêntricas de
coloração verde. (DOMSCH et al., 1980 apud SANTIN, R. C., 2008)6.

Tabela 2 - Taxonomia de Hypocrea rufa e Trichoderma spp.
Fase sexuada Fase assexuada
Regnum: Fungi Regnum: Fungi
Divisio: Ascomycota

Divisio: Fungos Mitospóricos
Divisio: Deuteromycota*
Subdivisio: Pezizomycotina
Classis: Euascomycetes*
Classis: Sordariomycetes
Classis: Deuteromycetes*
Classis: Hyphomycetes*
Classis: Sordariomycetes
Subclassis: Hypocreomycetidade Subclassis: Hypocreomycetidade
Ordo: Hypocreales Ordo: Moniliales
Familia: Hypocreaceae Familia: Moniliaceae
Genus: Hypocrea Genus: Trichoderma
Species: Hypocrea rufa (Pers. :Fr.) Fr., Species: Trichoderma viride Pers.

5 DOMSCH, K. H.; GAMS, W.; ANDERSON, T. H. Compendium of soil fungi. London: Academic Press,
1980. p. 672. apud SANTIN, R. C.
6 DOMSCH, K. H.; GAMS, W.; ANDERSON, T. H. Compendium of soil fungi. London: Academic Press,
1980. p. 672. apud SANTIN, R. C.

* = em desuso
Apesar de haver uma extensa lista de espécies de Trichoderma spp. reconhecidas,
a abordagem do conceito denominado agregado de espécies, para cada táxon específico,
apresentado nas publicações científicas, ainda é a mais segura, até que as questões de
definição das espécies sejam completamente resolvidas, utilizando-se de taxonomia
multifásica, incluindo características do DNA de cada isolado tipo7.
Muitos são os usos e as aplicações de fungos do gênero Trichoderma pela
humanidade e, dentre elas, pode ser destacada a produção de enzimas celulases e,
hemicelulases, por Trichoderma reesei E. G. Simmons (Hypocrea jecorina Berk. & Broome)
como base do processo de produção de biocombustíveis de segunda geração.
O uso mais antigo de Trichoderma spp., no entanto, tem sido em controle biológico
de doenças de plantas devido as vantagens que essa aplicação tecnológica tem em relação
ao controle químico conforme mencionado anteriormente. A combinação de produtos
biológicos de Trichoderma spp. com produtos químicos constitui-se em elemento importante
na estratégia para o controle integrado de doenças de plantas e pode permitir que moléculas
de agrotóxicos químicos sejam mais duráveis em comparação com o uso exclusivo de
fungicidas químicos (GRIGOLETTI JÚNIOR et al., 2000).
Trichoderma spp. podem ser eficientes em proteger as plantas contra microrganismos
patogênicos ou ainda contribuir para o controle de doenças de plantas por diferentes
mecanismos de ação, a saber:
Micoparasitismo, antibiose, competição, resistência sistêmica induzida e
supressividade de solo.
O micoparasitismo é uma ação conjunta de enzimas fúngicas hidrolíticas tais como:
quitinases, glucanases, proteases e lipases que permitem o parasitismo pelo próprio fungo
ou por outro fungo e causa a morte do patógeno (MELO, 1996).
A antibiose é a inibição e a morte do fitopatógeno por meio de substâncias tóxicas e
antibióticosvoláteis ou não voláteis produzidos pelo antagonista (AHMED et al., 2003) com
ou sem o contato físico de ambos.
A competição caracteriza-se pela disputa dos fungos por espaço, nutrientes, água e
oxigênio (BARBOSA; MEZA, 2009).

7 INDEX FUNGORIUM. <http://www.indexfungorum.org/names/Names.asp>. Acesso em 11 de
julho de 2017.

A resistência sistêmica induzida é uma resistência genética da planta expressada
após a estimulação por microrganismos, incluindo Trichoderma spp. (MORAES, 1991;
HOITINK et al., 2006).
A supressividade de solo consiste numa característica do solo que impede o
patógeno de se estabelecer ou quando o patógeno se estabelece, a doença não ocorre ou
é pouco severa (HYAKUMACHI, 1991).
Trichoderma spp. possui capacidade de resistir às toxinas de produtos naturais e
sintéticos, sendo capaz de degradar alguns desses compostos fazendo que possua uma
grande vantagem competitiva (HARMAN, 2006).
Determinados mecanismos de ação de Trichoderma spp. tem sua capacidade em
suprimir patógenos alterada devido a nutrientes presentes na matéria orgânica (ex:
carboidratos, quitina, lipídios) (HOITINK et al., 2006).
De acordo com Barnett & Binder (1973), Whips (1991) e Van Den Boogert (1999) os
micoparasitas podem ser classificados em dois grupos segundo seu modo de parasitismo: l.
micoparasistas biotróficos que obtém seu alimento de células vivas dos fungos parasitados
após o contato físico e; ll. micoparasitas necrotróficos que matam as células dos fungos
hospedeiros após o contato e absorvem nutrientes oriundos das células mortas. Há portanto,
os fungos micoparasitas especializados ou micoparasitas obrigatórios ecologicamente,
dependentes de uma pequena gama de hospedeiros e, os fungos micoparasitas não-
especializados ou micoparasitas facultativos ecologicamente, com ampla gama de
hospedeiros (BARNETT; BINDER, 1973, WHIPS,1991). Segundo Whips (1991) alguns
fungos podem ser totalmente dependentes de micoparasitismo em alguns poucos
hospedeiros para o crescimento e o desenvolvimento enquanto que os micoparasitas
facultativos ecologicamente agem como parasitas ocasionalmente. Os micoparasitas
facultativos ecologicamente tem um modo de vida saprofítico principalmente, usando a
antibiose ou o micoparasitismo para facilitar a competição (VAN DEN BOOGERT,1999).
A especificidade a determinados patógenos é uma das características de
Trichoderma spp. inclusive ao nível de isolados dentro da mesma espécie, (DIAS, 2009).
Essa especificidade pode se dar na fase de reconhecimento do hospedeiro por Trichoderma
spp. O reconhecimento de Sclerotium rolfsii por Trichoderma harzianum é intercedido por
lecitinas liberadas pelo patógeno (INBAR; CHET, 1995).
Segundo Pérez et al. (2007) Trichoderma harzianum (variedade mutante) é eficiente
no controle de Rhizoctonia solani através da produção de endoquitinases e β-1,3-
31

glucanases. T. harzianum produz outras enzimas extracelulares dentre elas peptinases,
glucanases e cutinanes eficientes no controle de fitopatógenos (DURÁN et al., 2003).
Espécies de Trichoderma spp. são potentes produtoras de enzimas quitinolíticas e
atuam atacando fungos que apresentam estrutura quitinosa, como Fusarium spp.
(CHÉRIF; BENHAMOU, 1990).
As variedades mutantes de Trichoderma spp. apresentam rápida produção de
enzimas quando comparados aos isolados selvagens (BESOAIN et al., 2007).
Além de sua ação como antagonista, Trichoderma spp. promove efeitos positivos
nas plantas como a aceleração da germinação, o aumento da massa seca, e da altura,
estimula o desenvolvimento de raízes secundárias, que melhoram a absorção de nutrientes
(CONTRERAS-CORNEJO et al., 2009; MELO, 1996; HARMAN, 2000; HARMAN et al.,
2004).
De acordo com Morandi & Bettiol (2009) Trichoderma spp. apresentam eficiência no
controle de diversos fungos fitopatogênicos como Fusarium, Pythium, Rhizoctonia,
Macrophomina, Sclerotinia, Sclerotium, Botrytis e Crinipellis, que causam doenças nas
culturas do feijoeiro, soja, algodoeiro, fumo, morango, tomateiro, cebola, alho, plantas
ornamentais e cacaueiro, respectivamente.
Apesar das diversas vantagens que o fungo oferece, a manipulação de Trichoderma
spp. requer cuidados especiais pois há relatos de infecções em humanos com sistema
imunológico deficiente e problemas alérgicos (MARTELLETO, 2009; KUBICEK; HAMAN,
1998; KUHLS et al., 1999).
Os mecanismos empregados pelos agentes de biocontrole para efetuarem o
controle de doenças são muitos, dentre os quais estão o micoparasitismo e a produção de
antibióticos dentre outros (HOWELL, 2003).
Por produzir enzimas extracelulares e antibióticos, competir por água e nutrientes,
fungos do gênero Trichoderma spp. são considerados eficientes antagonistas de agentes
etiológicos de diversas doenças (MELO; COSTA, 2005).
O sucesso no controle de fitopatógenos depende das características e dos
princípios de ação do organismo utilizado como antagonista. Por serem facilmente
localizados em uma ampla diversidade de ambientes, possuírem fácil cultivo, rápido
desenvolvimento em vários substratos e não serem patogênicos, os fungos do gênero
Trichoderma spp. são ótimos aliados para o controle biológico de diversos fitopatógenos
(PAPAVIZAS et al.,1982).

2.3 PRODUTOS COMERCIAIS COM TRICHODERMA SPP.

No mercado brasileiro existem fungicidas a base de microrganismos que
atuam no controle biológico de doenças de plantas que também são recomendados
para o tratamento de substratos e sementes. As formulações disponíveis: são pó-
molhável, grânulos dispersíveis, suspensão concentrada, óleo emulsionável, grãos
colonizados e esporos secos. As espécies mais utilizadas como agentes de
biocontrole são Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg,
Trichoderma harzianum Rifai, Trichoderma stromaticum Samuels & Pardo-Schulth e
Trichoderma viride Pers. (MORANDI; BETTIOL, 2009).
Para se chegar a um produto comercial a base de Trichoderma spp. são
necessárias a experimentação em etapas até verificar a eficácia agronômica do
mesmo conforme se segue: coleta, isolamento, identificação e caracterização do
microrganismo; produção de inóculo em meios de cultivo; otimização do processo
fermentativo e escalonamento dos processos; estudos de formulação, estudos da
aplicação em campo; obtenção do Registro Especial Temporário (RET); registro do
produto e comercialização do produto (SILVA et al., 2007).
Para a produção de biomassa de Trichoderma spp. é desejável a produção
com preços competitivos de preferência, em meios líquidos que facilitam o
precessamento industrial. A biomassa deve livre de contaminantes, o que exige
assepsia e deve ter altas taxas de germinação e crescimento; a formulação deve ser
eficiente no ambiente onde será empregado; e ter boa durabilidade de prateleira. A
produção de produtos a base de Trichoderma spp. pode ser realizada pelos próprios
agricultores, ou ainda a produção com alta tecnologia e em larga escala pode ser
realizada pela indústria (MAFIA et al., 2003). Desde o primeiro produto tecnológico
a base de Trichoderma produzido e disponibilizado a produtores no Sul do Brasil
para uso em campo visando o controle de Phytophthora em Malus domestica Borkh.
(macieira) (VALDEBENIDO-SANHUEZA, 1987a) muitos outros produtos foram
desenvolvidos e estão ofertados no mercado brasileiro, conforme demonstrado na
Tabela 3.

Tabela 3 - Fungicidas a base de Trichoderma spp. disponíveis no mercado brasileiro.
Produto Princípio ativo/RG: Formulações
disponíveis/i.a./[%]i.a.
Empresa
Produtora
Ecotrich ® Trichoderma
harzianum/RG: 4213
WP/ Trichoderma
harzianum/ 30%
Ballagro Agro
Tecnologia
Ltda.
Predatox® Trichoderma
harzianum/
RG: 5015
SC / Trichoderma
harzianum/ 2%
Ballagro Agro
Tecnologia
Ltda.
Quality® Trichoderma
asperellum/
RG: 8611
WG/ Trichoderma
asperellum/ 28%
Laboratorio de
Biocontrole
Farroupilha
Ltda.
Stimucontrol® Trichoderma
harzianum /
RG: 22516
SC/ Trichoderma
harzianum/ 0,5% Simbiose Ltda.
Trichodermax
®
Trichoderma
asperellum /
RG: 12511
EC/ Trichoderma
asperellum/ 3%
Novozymes
BioAg
Produtos para
Agricultura
Ltda
Trichodermil® Trichoderma
harzianum /
RG: 2007
SC/ Trichoderma
harzianum/ 4,8%
Koppert do
Brasil
Sistemas
Biológicos
Ltda
RG - Regristro no MAPA, i.a. - ingrediente ativo, [%] i.a. - porcetagem de ingrediente ativo, EC - Emulsifiable
Concentrate (concentrado emulsionável), WP - Wettable Powder (pó molhavel), SC - suspensão
concentrada, WG - Water Dispersible Granules (Granulado Dispersível).
Fonte: MAPA, 2017.

Os produtos a base de microrganismos vivos, encontram dificuldade de
comercialização por serem classificados como fungicidas. Assim, são submetidos ao rigor
da legislação para sua produção, transporte, armazenamento e uso. Os produtos comerciais
são compostos pela biomassa de Trichoderma spp. e ingredientes inertes. Para a formulação
do produto é necessário um processo complexo onde devem ser observados características
do antagonista, sistema produtivo em que o produto foi formulado, características físicas e
químicas dos produtos inertes, compatibilidade de formulação, estabilidade do produto,
dentre outros. Tais produtos são usados para tratamentos de sementes em pré ou pós-
emergência oferecendo uma vantagem competitiva às plântulas (MELO, 1991) entre outras
aplicações recomendadas.
34

3 MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratório de Fitopatologia e Patologia
Florestal / Sala de Controle Biológico do Centro de Pesquisas Agroflorestais do
Acre – CPAFAC da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropécuaria (EMBRAPA),
situado a Rodovia BR-364, Km 14 sentido (Rio Branco/Porto Velho), Rio Branco,
AC – CEP. 69.908.970.

3.1 ISOLAMENTO DE TRICHODERMA SPP. A PARTIR DE ÓRGÃOS DE
PLANTAS

Para a obtenção de Trichoderma spp. planejou-se o isolamento a partir de
amostras constituídas de sementes, folhas, estolões e raízes de amendoim forrageiro
(Arachis spp.), sementes e folhas de castanha-da-Amazônia (Bertholletia excelsa),
sementes, folhas, hastes e raízes de braquiária, Brachiaria spp., folha, ramo e raiz de
mulateiro (Calycophyllum spruceanum), folhas, ramos e raízes de eucalipto
(Eucalyptus spp.), sementes, folhas, ramos e raízes de seringueira (Hevea spp.), folha
da vassoura e raiz de cupuaçúzeiro (Theobroma grandiflorum), com vassoura-de-
bruxa, além da matéria orgânica de solo de campo cultivado com amendoim
forrageiro, braquiária, floresta plantada de eucalipto, floresta plantada de seringueira
e floresta amazônica primária. As amostras foram coletadas sequencialmente e
trazidas ao Laboratório para processamento visando isolar Trichoderma spp. As
amostras de órgãos de plantas foram lavadas em solução de detergente neutro,
cortadas em pedaços de aproximadamente 5 mm, os quais foram e desinfestados
com etanol a 70% por 1 min, solução de NaOCl 12500 ppm de cloro ativo durante 3
min, seguido de três lavagens com água destilada estéril. Os fragmentos
desinfestados foram semeados em placas tipo Petri com meio de cultura BDA (Batata
Dextrose Ágar, 3,9% m/v), com pH ± 6,5 contendo 100 ppm do antibiótico
cloranfenicol.

Figura 1 - Amostra de folha de Theobroma grandiflorum (cupuaçuzeiro) com vassoura
de bruxa (A), coleta de raiz de Calycophyllum spruceanum (mulateiro) (B).

3.2 ISOLAMENTO DE RHIZOCTONIA SPP.

Para o isolamento de Rhizoctonia spp. a partir de folhas de amendoim
forrageiro (Arachis pintoi cv. BRS Mandobi), seringueira (Hevea brasiliensis) e
Brachiaria brizantha cv. Marandu, amostras de folhas com sintomas de doença
causada pelo fitopatógeno colhidas no campo foram lavadas em solução aquosa de
detergente neutro, e fragmentos de aproximadamente 5 mm contendo tecido com e
sem lesão foram desinfestados com etanol a 70% por 1 min, solução de NaOCl a
12500 ppm de cloro ativo durante 3 min, seguido de três lavagens com água
destilada estéril. Os fragmentos de tecido vegetal desinfestados foram semeados no
meio de cultura BDA (Batata Dextrose Ágar, 3,9% m/v), com pH ± 6,5 contendo 100
ppm do antibiótico cloranfenicol. As placas foram colocadas em câmara tipo BOD a
25ºC, onde permaneceram por três dias para o crescimento dos fungos.

3.3 ISOLAMENTO DE TRICHODERMA SPP. A PARTIR DA MATÉRIA ORGÂNICA
DO SOLO

Para a obtenção de Trichoderma spp. a partir da matéria orgânica de solo
amostras foram obtidas do horizonte O de floresta primária amazônica, campo
cultivado com braquiária (Brachiaria spp.), campo cultivado com amendoim
A B
36

forrageiro (Arachis pintoi), floresta de eucalipto (Eucapyptus spp.) e floresta de
seringueira. No Laboratório, o solo de cada amostra foi peneirado separadamente
sobre bandeja utilizando peneira com malha de 4 mm. Uma alíquota de 100 g do
solo peneirado de cada amostra teve a massa mensurada em cápsulas de
alumínio de 70 cm de altura x 60 cm de diâmetro em balança digital com precisão
de duas casas. Em seguida o solo foi colocado dentro da peneira com malha de
850 µm posicionada sobre a peneira com malha de 25 µm e, lavou-se a amostra
em água de torneira sob pressão até passar todo o conteúdo da primeira peneira.
Com o auxílio de um pisseta o conteúdo retido na peneira de 25 µm foi transferido
com água destilada para um béquer de 500 mL de volume e ressuspendido com
um agitador magnético e barra magnética. A matéria orgânica ressuspendida
durante a agitação foi recolhida novamente na peneira de 25 µm e mais água
limpa foi adicionada ao béquer, repetindo o processo de limpeza e recuperação
da matéria orgânica até a água do bequér ficar clara.
Com auxílio de uma peneira com malha de aproximadamente 35 µm a
matéria orgânica foi imersa em etanol a 70% por 1 min, seguido da imersão em
solução de NaOCl 12500 ppm de cloro ativo por 3 min e de duas lavagens com
água destilada estéril por cerca de 10 s cada. A matéria orgânica foi incorporada
ao meio de cultura 526 (ELAD et al., 1981) modificado e em estado fundente,
composto de (3,0g de glicose, 0,15g de KCl, 1,0g de NH4NO3, 0,2g de MgSO4.7H2O,
0,9g de K2HPO4, 150mg de rosa bengala, 15g de ágar, 1000mL de água destilada e
250mg de Cloranfenicol) e após agitação manual, o máximo de conteúdo do
erlenmyer foi distribuido em placas tipo Petri de 90 mm x 15 mm. A modificação
adotada para o preparo do meio foi a não adição de p-diazodimethylaniline sodium
sulfonate (fenaminosulf) por dificuldade de aquisição. Após o armazenamento em
câmara tipo BOD (Biological Oxygen Demand) à 25ºC por até quinze dias as
placas contendo as amostras processadas foram avaliadas quanto à presença de
fungos do gênero Trichoderma com a confecção de lâminas para identificar
algumas colônias atípicas. Colônias de cor verde típicas do gênero e colônias
positivas pela análise microscópica foram selecionadas para a purificação de
isolados de Trichoderma spp.

3.4 PURIFICAÇÃO E ARMAZENAMENTO DOS ISOLADOS

Isolados identificados preliminamente como Trichoderma spp. apresentaram
coloração esverdeada e foram repicados para novas placas tipo Petri contendo meio
BDA.Para purificar os isolados foi empregado o método de cultivo monospórico, no
qual todas as colônias foram processadas individualmente. Esporos de cada colônia
foram trasnferidos com estilete fambado para tubos de eppendorf contendo 1,5 mL
de água destilada estéril, seguido de cinco diluições até aproximadamente 10-10.
Após agitação da suspensão mais diluída em vortex uma alíquota foi semeada em
placas tipo Petri contendo ágar-água 2% (m/v) posicionada sob plataforma giratória
utilizando alça de Drigalski. As placas foram colocadas em BOD a 25 ºC sob
fotoperíodo de 12h e 24 horas depois, com o auxilio de um microscópio
estereóscopico binocular no aumento máximo de 45X, um esporo germinado foi
transferido para placa tipo Petri com meio BDA contendo antibiótico cloranfenicol a
50 ppm. Após o crescimento da colônia do fungo cinco discos de 5 mm foram
cortados da borda da colônia com o auxílio de furador de rolha flambado. Os cinco
discos, foram armazenados em vidros de 10 mL do tipo vidro de penicilina contendo
5 mL de água destilada estéril pelo método de Castellani conforme demonstrado na
Figura 2.

Figura 2 – Isolados de Trichoderma spp. armazenados pelo método de Castellani em
geladeira a cerca de 5 ºC.
38

Placas com presença de Rhizoctonia spp. identificada pela macromorfologia do
micélio foram separadas para a purificação dos isolados do fungo pelo método de
ponta de hifa diretamente para tubo de ensaio com BDA. Cada isolado foi transferido
para três tubos inclinados, e os tubos foram colocados em BOD, a 25ºC com
fotoperíodo de 12h.
Posteriormente os isolados foram transferidos para grãos de aveia estéril para
armazenamento na Coleção de Microrganismos da Embrapa Acre, CMEA.

3.5 TESTE DE ANTAGONISMO

Para os testes de antagonismo de Trichoderma spp. e de Rhizoctonia spp.
foram utilizados 25 isolados de Trichoderma spp. de substratos selecionados
aleatoriamente e três isolados de Rhizoctonia spp. de diferentes hospedeiros
amendoim forrageiro (Arachis pintoi cv. BRS Mandobi), Brachiaria brizantha cv.
Marandú e segingueira (Hevea brasiliensis).
Foram realizados dois experimentos em condições controladas semelhantes,
sendo o primeiro, com 15 isolados de Trichoderma spp. e o segundo, com 10 isolados
de Trichoderma spp.
O teste de antagonismo foi realizado por pareamento de culturas em placas tipo Petri
de 90 mm de diâmetro por 15 mm de altura, contendo 20 mL de meio Ágar-V8
composto de 200 mL de suco V8 original, 15 mL NaOH, [0,1]N, 26 g de ágar e 800 mL
de água destilada.
Os ingredientes do suco V8 listados na embalagem do fabricante são:
suco concentrado de tomate, mistura de sucos de cenoura, aipo, beterraba,
salsa, alface, agrião e espinafre, sal, ácido ascórbico (conservante), ácido cítrico
(acidificante) e aromatizante. O suco V8 apresenta ainda conforme Tabela
fornecida pelo fabricante, em 340 mL, 950 mg de sódio (Na), 640 mg de potássio
(K), além de carboidratos, proteínas, vitaminas e outros minerais. O preparo do
meio de cultura Ágar-V8 foi pela mistura dos ingredientes em erlenmyer de vidro
de 2000 mL, cozimento em forno micro-ondas, distribuição de 100 mL de meio
em cada erlenmyers de 250 mL, colocação dos tampões de algodão, colocação
de tampas de papel e autoclavagem por 15 min. a 1 atm/ 120ºC para
esterilização do mesmo.
39

Para cada experimento, todos os fungos foram cultivados
simultaneamente em placas de poliestireno tipo Petri com 90 mm de diâmetro x
15 mm de altura contendo meio de cultua BDA por 72h a 25 °C ± 1 ºC com
fotoperíodo de 12h em BOD.
O fungo potencial antagonista foi cultivado pelo método de cultivo one
point culture e o patógeno pelo método de fragmentação de hifa, para uma
melhor uniformidade de ambos, em meio de cultura BDA. Após 72h discos com
5 mm de diâmetro dos isolados do fitopatógeno e dos possíveis antagonistas
foram transferidos para placas tipo Petri contendo meio Ágar-V8. Ambos os
discos foram depositados a aproximadamente 1 cm da borda da placa em lados
opostos. Após o pareamento, as placas foram armazenadas em BOD a 25 ºC±1
ºC, com fotoperíodo de 12 h.
Sete dias após o pareamento o grau de antagonismo foi avaliado de
acordo com a escala numérica descritiva adaptada de Bell et al., (1982)
apresentada na Tabela 6.

Tabela 4 - Escala numérica descritiva para a classificação do antagonismo de
Trichoderma spp. por Índice de Colonização do Meio de Cultura, ICM,
adaptado de Bell et al., (1982).
Notas Descrição
1 Trichoderma spp. coloniza toda a superfície do meio de cultura
e a colônia do patógeno.
2 Trichoderma spp. coloniza no mínimo 2/3 da superfície do meio
de cultura com ou sem parte da colônia do patógeno.
3 Trichoderma spp. e Rhizoctonia spp. colonizam metade da
superfície do meio de cultura sem sobreporem as colônias.
4 Rhizoctonia spp. coloniza no mínimo 2/3 da superfície do meio
de cultura e resiste a invasão de Trichoderma spp., sobrepondo
ou não parte da colônia do oponente.
5 Rhizoctonia spp. coloniza completamente a superfície do meio
de cultura e sobrepõe totalmente a colônia de Trichoderma spp..

Nove dias após o semeio dos discos de Rhizoctonia spp. em meio Ágar-
V8, procedeu-se a contagem do Número de Escleródios, NESC, presentes nas
placas utilizadas para o experimento de pareamento. Para visualização clara dos
40

escleródios sob estruturas de Trichoderma spp., as placas foram lavadas com
etanol 50% utilizando um borrifador manual. Para avaliar a sobrevivência de
Rhizoctonia spp., nos discos utilizados como inóculo inicial, os discos foram
retirados de cada placa e transferidos para placas tipo Petri contendo meio Ágar-
Água 2%, (m/v), as quais foram armazenadas em BOD a 25 ºC±1ºC, com
fotoperíodo de 12 h. A sobrevivência de Rhizoctonia spp. foi avaliada 24 h depois.
O critério para a classificação de cada isolado de Trichoderma spp. em
classe de antagonismo foi previamente estabelecido e fundamentou-se no valor
médio da nota de avaliação arredondando para o valor inteiro mais próximo
quando necessário, conforme proposto por Bell et al., (1982), sendo elaborada a
Tabela 5.

Tabela 5 - Classes de antagonismo formadas pela combinação da amplitude do Índice
de Colonização do Meio de Cultura, sobrevivência do patógeno e
Número de Escleródios.
Classe Amplitude Sob. N°escl. Descrição Reação
1 1≤IC≤2 0 0 Atlo-muito
agressivo
AMA
2 1≤IC≤2 1 0 Alto-
agressivo
AA
3 1≤IC≤2 0 >0 Alto-não-
agressivo
ANA
4 1≤IC≤2 1 >0 Alto A
5 3≤IC≤5 0 0 Médio
muito
agressivo
B
6 3≤IC≤5 1 0 Médio
agressivo
C
7 3≤IC≤5 0 >0 Médio não
agressivo
D
8 3≤IC≤5 1 >0 Baixo E
sob. - sobrevivência do disco, nº escl. - Número de Escleródios

3.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O experimento foi conduzido com setenta e cinco tratamentos, divididos
em dois lotes, o primeiro com quarenta e cinco tratamentos e, o segundo, com
trinta tratamentos, com três repetições em delineamento inteiramente
casualizado.

3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística iniciou-se com a análise de correlação linear de Pearson para
observar se as variáveis analisadas possuíam alguma correlação seguida da análise de
resíduos, da normalidade do erro pelo teste de Shapiro-Wilk, Kolmogorov-Smirnov,
Cramer-von Mises e Anderson-Darling, mais a homogenidade de variânicas pelo teste de
Bartlett. A comparação de médias foi realizada pelo teste de Tukey em cada experimento
e no conjunto total de dados. A razão de variâncias