Biológico Micotoxina

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Rafaela Araújo Guimarães, Paul Esteban Pherez Perrony, Henry Müller,
Data revisada:
PII:
Gabriele Berg, Flávio Henrique Vasconcelos de Medeiros, Tomislav Cernava
Data aceita:
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Avaliação guiada por microbioma da aplicação de Bacillus subtilis BIOUFLA2 para 
reduzir micotoxinas em grãos de milho
Data de Recebimento:
Controle biológico
© 2020 Publicado pela Elsevier Inc.
DOI:
26 de junho de 2020
Referência:
Por favor, cite este artigo como: Guimarães, RA, Perrony, PEP, Müller, H., Berg, G., de Medeiros, FHV, Cernava, T., 
Avaliação guiada por microbioma da aplicação de Bacillus subtilis BIOUFLA2 para reduzir micotoxinas em grãos de milho, 
Controle Biológico (2020), doi: https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2020.104370
S1049-9644(20)30348-0 
https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2020.104370 
YBCON 104370
13 de abril de 2020
16 de junho de 2020
Pré-provas de diário
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https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2020.104370
https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2020.104370
2 Henrique Vasconcelos de Medeirosa* e Tomislav Cernavab*
Gabriel Bergb ,
14 
15
24 As doenças fúngicas estão se agravando globalmente no cultivo de culturas, apesar do aumento do uso de 25 fungicidas 
químicos. A podridão da espiga e a contaminação dos grãos por fumonisina causada por Fusarium verticillioides levam a 26 
reduções qualitativas e quantitativas na produção de milho. Na agricultura tropical, o milho de alta produtividade 27 atualmente 
só pode ser assegurado através da proteção foliar com fungicidas devido à alta pressão do patógeno 28 . No entanto, apenas o 
uso de fungicidas químicos não garante a proteção dos grãos.
3 a Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Lavras, Brasil 4 b 
Instituto de Biotecnologia Ambiental, Graz University of Technology, Graz, Áustria
• B. subtilis BIOUFLA2 pode substituir uma pulverização de fungicida para reduzir F. verticillioides.
29 Recentemente, uma aplicação conjunta de fungicidas com a cepa de Bacillus subtilis BIOUFLA2 foi identificada 30 como 
uma estratégia promissora para controlar doenças causadas por F. verticillioides . Empregamos uma abordagem integrativa 31 
para avaliar as mudanças no microbioma do milho submetido a uma combinação de fungicidas químicos e 32 biológicos e 
comparamos com tratamentos convencionais. Isso foi complementado com 33 monitoramentos moleculares e analíticos dos 
níveis de patógenos e micotoxinas. Duas épocas de amostragem foram 34 incluídas (10 dias após a aplicação dos tratamentos 
e na colheita) e dois campos de milho para contabilizar 35 diferenças regionais. Uma análise comparativa indicou um 
enriquecimento específico do tratamento de bactérias 36 e OTUs fúngicas que não eram detectáveis no microbioma do milho 
de plantas não tratadas. Tanto a 37 aplicação química quanto a aplicação conjunta de pesticida químico e biológico resultaram 
na ocorrência de 38 OTUs únicas. As amostras submetidas a esses tratamentos abrigaram até 22 OTUs adicionais. A menor 
concentração de 39 fumonisinas foi observada no tratamento que englobou BIOUFLA2 (campo 1 = 0,29 40 ppm e campo 2 = 
0,77 ppm), enquanto a aplicação de fungicida convencional resultou na maior
,
• Os sprays de biocontrole e fungicidas enriqueceram táxons bacterianos e fúngicos distintos.
1 Rafaela Araújo Guimarãesa
5
23 RESUMO
•
Flávio,
• Nenhuma mudança no microbioma foi observada após os tratamentos.
Paul Esteban Pherez Perronya , Henry Müllerb
• Essa abordagem conjunta de B. subtilis com fungicida reduz as fumonisinas.16 
17 
18 
19 
20 
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6 * Autores para correspondência 
em: 7 Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Lavras, Brasil e Instituto de Meio Ambiente 8 Biotecnologia, Graz 
University of Technology, Graz, Áustria 9 E-mail: flaviomedeiros@ufla.br (FHV de Medeiros) e tomislav.cernava@tugraz.at 
(T. Cernava) 10 11 12 Destaques 13
Avaliação guiada por microbioma da aplicação de Bacillus subtilis BIOUFLA2 para reduzir 
micotoxinas em grãos de milho
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mailto:flaviomedeiros@ufla.br
mailto:tomislav.cernava@tugraz.com.br
41 concentrações de micotoxinas (campo 1 = 3,84 ppm e campo 2 = 10,02 ppm). Nosso estudo forneceu fortes 42 
evidências de que tratamentos convencionais de milho com fungicidas podem promover níveis de micotoxinas em 
grãos 43 e que a substituição parcial por biológicos pode aumentar a eficiência do tratamento. 44 45 Palavras-
chave: gestão integrada de doenças; micotoxinas; comunidades microbianas; pesticidas; 46 recrutamento microbiano 
47 48 49 1. Introdução 50 51 O milho (Zea mays L.) é essencial para a nutrição humana e animal e atualmente tem 
importância crescente 52 na produção de biocombustíveis (Saravanakumar et al., 2017). No entanto, vários 
fitopatógenos 53 comprometem o cultivo dessa importante cultura. A podridão da espiga causada por Fusarium 54 
verticillioides é relevante tanto para regiões tropicais quanto temperadas, onde não só causa redução na produção 
de 55, mas também na qualidade do grão (Blacutt et al., 2018). 56 O fungo é altamente saprofítico, colonizando 
todos os tipos de resíduos de culturas em decomposição. Essa habilidade faz 57 que criou um reservatório para sua 
sobrevivência na entressafra e suprimento nutricional para seu acúmulo inicial de inóculo 58 para colonizar a planta hospedeira. Portanto, com o sistema de plantio direto recomendado, o restolho de milho no solo serve 
como nicho ecológico para F. verticillioides (Blacutt et al., 2018). Assim, 60 quando F. verticillioides encontra uma 
planta hospedeira suscetível, obtém acesso endofítico 61 por meio de sementes, feridas ou aberturas naturais no 
caule ou flor/espiga, causando podridão do colmo/espiga e 62 podridão da espiga/micotoxina, respectivamente 
(Bluhm e outros, 2008). 63 Embora importante, o manejo da podridão do colmo é mais satisfatório do que a podridão 
da espiga. Essas 64 estratégias contam com o fortalecimento do caule para garantir resistência à infecção por F. verticillioides, por meio de 65 tratamento de sementes com fungicidas, otimização da nutrição das plantas 
e rotação de culturas com plantas não hospedeiras 66 (Wang et al., 2016). 67 Por outro lado, as ferramentas de 
gerenciamento atualmente recomendadas para garantir a sanidade do kernel resultam em 68 resultados variáveis, 
pois dependem principalmente do uso de fungicidas químicos. No entanto, até o momento, nenhumdeles 69 garante 
proteção total, especialmente em termos de podridão de espiga e ocorrência de micotoxinas (Masiello et al., 2019).
Na verdade, na interação entre milho e F. verticillioides, três padrões diferentes foram 70 71 relatados: (1) grãos podres associados a altos níveis de fumonisinas; (2) a descoloração do grão associada a baixos níveis de 
fumonisinas e (3) a presença das toxinas em grãos visivelmente assintomáticos (Afolabi 73 et al., 2007). 74 Assim, o 
dano predominante aos grãos depende de uma combinação de diferentes fatores, como 75 condições climáticas 
durante o crescimento da planta e danos causados por insetos, que são fatores determinantes para a infecção inicial 
76 com F. verticillioides e contaminação de grãos por fumonisina (Blacutt et al. , 2018). Além de diferentes, o uso excessivo de fungicidas também foi associado ao aumento da produção de fumonisina 78 por F. 
verticillioides (Marín et al., 2013; Cao et al., 2014). 79 A qualidade é comprometida pela colonização fúngica dos 
grãos, causando podridão e contaminação por micotoxina 80, problema recorrente na indústria de ração animal 
(Torres et al., 2014; Oliveira 81 et al., 2017). As micotoxinas são produtos do metabolismo secundário de vários 
fungos, incluindo 82 espécies de Fusarium , e estão ligadas a sérios problemas de saúde pública (Bennett e Klick, 
2003). Em 83 associação com milho, embora F. graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum, F. equiseti e F. 84 subglutinas sejam freqüentemente detectados, F. verticillioides é responsável por mais de 40% dos 85 
Fusarium spp relatados afetando grãos de milho. F. verticillioides e F. proliferatum são conhecidos por sua 86 
produção de micotoxinas do tipo fumonisina (Zhou et al., 2018). As fumonisinas FB1, FB2 e FB3 foram 87 descritas 
até o momento; no entanto, o tipo FB1 é o mais comum, representando até 80% das 88 contaminações, enquanto o 
FB2 representa até 25% e o FB3 até 8% (Rheeder et al., 2002). Os fungicidas 89 são, portanto, principalmente 
aplicados preventivamente em áreas com histórico de ocorrência de patógenos. Aplicações foliares
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A detecção da microbiota vegetal e sua importância levaram a uma mudança de paradigma onde 104 105 microrganismos desempenham um papel central no holobionte (Vandenkoornhuyse et al., 2015). No 
entanto, a 106 microbiota vegetal é afetada por muitos fatores bióticos e abióticos e, portanto, um sistema 107 
em adaptação contínua. Foi demonstrado anteriormente que comunidades microbianas associadas a plantas 
abrigam diferentes 108 respondedores a diferentes práticas de manejo agrícola, mas também a pesticidas 
químicos e BCAs 109 (Cernava et al., 2019). Para entender como as interações planta-micróbio são afetadas 
pelas práticas 110 atuais na agricultura, é importante entender como e em que grau os produtos químicos 
podem afetar 111 comunidades complexas (Kemperman et al., 2013). Além disso, é importante explorar como 
a aplicação de diferentes BCAs pode contribuir para o desenvolvimento de comunidades benéficas (Berendsen 
et 113 al., 2018). A filosfera do milho, e especialmente as espigas de milho, permaneceram inexploradas neste 
contexto.
114 Uma melhor compreensão da dinâmica microbiana dentro deste habitat pode explicar porque é propício 
para 115 o desenvolvimento de patógenos e o acúmulo de micotoxinas como observado anteriormente (Lane 
et 116 al., 2018). Empregamos uma abordagem integrativa para explorar as respostas do microbioma a 
tratamentos preventivos de pesticidas 117 e BCA combinados em comunidades bacterianas e fúngicas. Temos 
hipótese 118 que cada tratamento resultaria em uma mudança distinta das comunidades microbianas que 
indica 119 permissividade potencialmente maior para o patógeno. Todas as análises foram acompanhadas 
por quantificações paralelas 120 do gene fum 1 , que é indicativo de patógenos produtores de micotoxinas 
(Waalwijk 121 et. al., 2008) e quantificações espectrométricas de massa das toxinas (Noomim et al., 2008). Combinando essas técnicas, obtivemos informações sobre: (i) a incidência de F. verticillioides em 123 
grãos, (ii) o conteúdo de fumonisina FB1 e FB2 e (iii) comunidades bacterianas e fúngicas da espiga de milho. 
Nossos 124 resultados fornecem a base para melhorias adicionais no controle biológico visando 125 
fitopatógenos produtores de micotoxinas. 126 127 128 2. Materiais e Métodos 129 130 2.1. Descrição do 
experimento de campo 131 132 Os experimentos com plantas foram realizados em dois campos diferentes, 
Campo 1 (-21°204'242'' S, -44°980'322''
90 de fungicidas no milho estão relacionados com: (1) eliminação de espécies microbianas benéficas que 
competem 91 pelo mesmo substrato que o patógeno (2) equilíbrio de populações 92 sensíveis e insensíveis 
a F. verticillioides e (3) expressão aumentada de fumonisina -produtores de genes (Edwards e Godley, 2010), 
93 portanto, as estratégias para lidar com as contaminações de amêndoas por fumonisina devem abordar 
cada um dos 94 efeitos colaterais observados de fungicidas usados no filoplano (Medina et al., 2017). 95 
Desafiada pela ineficiência das técnicas de manejo atuais, a redução das fumonisinas ainda 96 depende principalmente do controle químico com fungicidas. No entanto, agentes de controle biológico 
(BCAs) foram 97 identificados como uma alternativa promissora para o manejo integrado da podridão da 
espiga do milho (Figueroa-López et 98 al., 2016). Seus modos de ação incluem a produção de compostos 
tóxicos ou parasitismo e 99 competição com o patógeno por exclusão de nicho por ocupação (Medina-
Córdova et al., 2016; 100 Medina et al., 2017). Bacillus spp. abrangem diferentes características benéficas 
dos BCAs e mostraram 101 fornecer os meios para controlar F. verticillioides , interferindo com sua colonização 
endofítica 102 (Cavaglieri et al., 2005) e reduzindo os níveis de fumonisinas FB1 e FB2 após tratamentos de 
sementes 103 (Pereira et al., 2005) al., 2009).
133 W) e Campo 2 (-21°11'26,1' 'S, 44°58'42,2'' W). O híbrido de milho DKB PRO 2 (Bayer Crop Science) 134 
foi cultivado sob sistema de plantio direto. O manejo de plantas daninhas foi feito por pulverização de 
glyphosate 135 antes do plantio na dose de 2 L/ha e após o plantio com atrazina e tembotrione na dose de 
240 mL/ha 136 durante o estádio fenológico V3. Os fertilizantes foram aplicados no plantio com 28-08-16 
(NPK) a 500 137 kg/ha e a cobertura com 20-00-20 (NPK) a 450 kg/ha distribuídos durante os dois estádios 
fenológicos 138 V3 e V6 de acordo com a orientações técnicas para o milho (Galvão et al., 2017). A terra foi plantada
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168 Colônias com sete dias de idade foram utilizadas para preparar a suspensão fúngica ajustada para 105 conídios/
mL e 169 5 mL dessa suspensão foram utilizados para inocular cada espiga de milho, 10 dias após a emissão do 
estilete 170 (Mendes et al., 2012 ). A aplicação conduzida do patógeno simula infecçãoassintomática 171 através do 
sistema radicular da planta e subsequente disseminação em tecidos acima do solo, causando os 172 sintomas 
característicos de podridão. 173 174 2.3. Amostragem de tecido vegetal para análise molecular 175 176 Amostragens 
de plantas para extração de DNA total da microbiota que habita o filoplano foram realizadas em 177 sete dias após a 
inoculação do patógeno (tempo 1) e após a colheita (tempo 2), conforme visualizado em 178 Material Suplementar 
Fig. S1 , ou seja , quando o teor de água dos grãos atingiu 18% de umidade. 179 As espigas de milho para análise 
do microbioma e qPCR foram amostradas de três plantas localizadas nos 180 núcleos das parcelas de cada tratamento por bloco. No centro de cada espiga de milho foram obtidas 181 duas amostras em lados 
opostos com auxílio de broca esterilizada (20 mm2 de diâmetro). No total, seis 182 amostras foram obtidas por 
tratamento/repetição/tempo. Plantas que já foram amostradas não foram 183 consideradas para a coleta subseqüente. 
A amostragem foi aleatória dentro dos quatro blocos em cada 184 áreas analisadas (Área 1 e Área 2). As amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido, armazenadas a 185ºC em freezer (-20oC) e 
finalmente liofilizadas antes da extração do DNA. 186 187
139 com 0,6 m entre linhas para obter uma densidade final após a germinação de 70.000 plantas por 140 hectare. O 
comprimento de cada bloco para os diferentes tratamentos foi de 5 m e abrangeu quatro plantas de 141 fileiras (0,6 
m × 4), o que representou uma área total de 12 m2 (5 m × 2,4 m) por bloco. As plantas amostradas 142 para as 
análises experimentais subsequentes foram obtidas em subparcelas de 1,8 m2 (3 m × 0,6 m) 143 visando remover 
todos os efeitos de deriva e bordadura, adicionando assim apenas as duas linhas centrais (largura) e com uma 144 
-metro de recuo entre o início e o fim da parcela (comprimento). 145 146 2.2. Tratamentos fitofarmacêuticos foliares 
e inoculação de Fusarium verticillioides 147 Os tratamentos foram avaliados em duas aplicações de campo separadas, 
abrangendo três tratamentos. 148 149 Tratamento 1 posteriormente denominado como 'T1' (água aplicada durante o 
estágio vegetativo-V9 e estágio reprodutivo 150 R1); tratamento 2 posteriormente denominado como 'T2' (fungicida 
aplicado durante a fase vegetativa -V9 e 151 adicionalmente agente de controle biológico aplicado durante a fase reprodutiva-R1) e tratamento 3 posteriormente 152 denominado como 'T3' (fungicida aplicado durante a fase 
vegetativa-V9 e estágio reprodutivo-R1) são 153 ilustrados esquematicamente no Material Suplementar Fig. S1. A 
amostragem de plantas de milho foi realizada com o método Leaf Collar para verificar os estágios de desenvolvimento 
(Licht et al., 2011). 155 O agente de biocontrole implementado no estudo foi Bacillus subtilis cepa BIOUFLA2 156 
(Material Suplementar Fig. S2 e Tabela de Material Suplementar S1) da Coleção Biocontrol of 157 Plant Diseases 
(Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras). Foi 158 preservado em solução de peptona-glicerol 
e mantido a -20°C até o uso. BIOUFLA2 foi cultivado 159 antes de sua aplicação em YPD (ágar extrato de levedura-
peptona-dextrose), então colônias individuais foram 160 transferidas para meio líquido YPD por 72 h a 150 RPM e 27°C, e a densidade celular foi ajustada para 108 UFC /mL. O fungicida químico utilizado para os ensaios 
de campo foi uma mistura de azoxistrobina + 161 162 ciproconazol (Priori Xtra®; Syngenta Crop Protection) a 300 
mL/ha do ingrediente formulado.
163 Para todas as aplicações de pulverização, 0,5% (v/v) de óleo mineral (Nimbus, Syngenta Crop Protection) foi 
adicionado 164 de acordo com as orientações do fabricante. Para todos os tratamentos de plantas, o volume total 
pulverizado foi de 200 165 L/ha usando um cilindro compressor de CO2 acoplado a uma barra de bicos de 4 cones. 
166 A cepa F. verticillioides F425 foi gentilmente doada da Coleção Embrapa Milho e Sorgo 167 (Sete Lagoas, Brasil) e cultivada em ágar batata-dextrose (PDA) segundo Lanza et al. (2014).
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188 2.4. Extração de DNA total da comunidade 
189 190 As amostras liofilizadas foram moídas 
manualmente com almofariz e pilão estéril para 191 homogeneizá-las. Posteriormente, 0,5 g de cada amostra foram pesados e transferidos para as 
próximas etapas de processamento, 192 enquanto o restante do material foi armazenado como backup. A extração 
do DNA total da comunidade foi 193 realizada com o FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, EUA) seguindo o 
protocolo 194 do fabricante, e o DNA obtido foi verificado quanto à concentração e qualidade em NanoDrop (Thermo 
195 Fisher Scientific, EUA) e armazenado a -20 °C até o uso. 196 197 2.5. Amplificação e código de barras dos 
fragmentos do gene 16S rRNA e da região ITS 198 199 A região V4 hipervariável do gene 16S rRNA foi amplificada 
de acordo com o protocolo 200 descrito por Caporaso e colegas (2011) usando o conjunto de primers específicos da 
região 515f/806r 201 (Suplementar Tabela de materiais S2) que incluía códigos de barras específicos da amostra. 
A fim de evitar a amplificação 202 de DNA mitocondrial e de cloroplasto derivado de plantas durante a amplificação 
de fragmentos de rRNA 203 16S bacterianos, as misturas de reação de PCR foram suplementadas com grampos de PCR de ácido nucleico de peptídeo específico 204 (PNA) (0,75 µM de cada PNA na reação final em uma 
proporção de (pPNA:mPNA 1:1) como 205 descrito por Lundberg et al., (2013). A mistura de reação de PCR (30 µl) 
continha 1 × Taq&Go (MP 206 Biomedicals, Illkirch, França), 0,2 mM de cada primer, 1,5 µM de mistura de PNA e 1 
µl de DNA modelo (96°C 207 por 5 min, 30 ciclos de 96°C por 1 min, 78°C por 5 s PNA annealing, 54°C por 1 min 
primer annealing, 208 74 °C por 1 min e alongamento final a 74 °C por 10 min). As amplificações de PCR direcionadas 
à região fúngica 209 ITS foram conduzidas usando iniciadores ITS1/ITS2 (tabela suplementar 2) transportando 
amostra 210 sequências de código de barras específicas (Schoch et al. , 2012). O DNA foi amplificado em reações 
de PCR (30 ÿl cada) 211 contendo 0,9 ÿl MgCl (25 mM), 6 ÿl Taq&Go, 1,5 ÿl de 5 ÿM para cada p rimer, 19,1 ÿl de 
água de PCR, 212 e 1 ÿl do molde de DNA com as seguintes condições de ciclagem: 95°C, 5 min; 30 ciclos de 95°C, 
213 30 s; 58°C, 35 s; 72°C 40 seg; e alongamento a 72°C, 10 s). Para cada amostra e alvo, as reações de PCR 214 
foram conduzidas em triplicata, seguidas de agrupamento antes da purificação dos amplicons com 215 o Wizard SV 
Gel e PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, EUA). Alíquotas equimolares de 216 todas as amostras foram 
agrupadas e enviadas para sequenciamento Illumina HiSeq de extremidade pareada de 300 pb (GATC Biotech, 217 
Alemanha). 218 219 2.6. Processamento de dados bioinformáticos 220 221 As sequências obtidasdo gene 16S 
rRNA e amostras de amplicon ITS foram processadas usando 222 scripts com parâmetros padrão dentro do pacote 
de software de código aberto QIIME 1.9.1 223 (http://qiime.sourceforge.net). Os pares de leitura foram unidos (fastq-
join; sobreposição mínima de 50 bases e 224 densidade máxima de incompatibilidade de 0,25) seguido de 
classificação de acordo com as sequências de primer e amostras de 225 códigos de barras específicos. As leituras 
resultantes foram filtradas por qualidade (pontuação de Phred ÿ 20) e comprimento (290-300 bp).
226 Sequências quiméricas de amostras de amplicon do gene 16S rRNA foram descartadas após detecção de novo 
227 usando USEARCH 6.1 (Edgar et al., 2011). O algoritmo UCLUST usando parâmetros padrão foi aplicado 228 
para agrupar as leituras restantes em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de similaridade (Edgar, 
2010) 229 seguido pela atribuição taxonômica de sequências representativas pelo classificador Bayesian rRNA 230 
naïve RDP (Wang et al., 2007 ) com base no banco de dados de referência Greengenes release gg_13_8 (De Santis 
231 et al., 2006). Antes de uma análise mais aprofundada, todos os OTUs atribuídos a plastídeos vegetais 
(cloroplastos e 232 mitocôndrias) foram descartados dos conjuntos de dados. Sequências quiméricas de amostras 
de amplicon ITS de fungos 233 foram identificadas com USEARCH 6.1 (Edgar et al., 2011) com base nas sequências 
de referência 234 (sh_qiime_release_10.10.2017; UNITE Community, 2017). Posteriormente, todas as sequências 
quiméricas 235 foram removidas do conjunto de dados. As leituras foram agrupadas em unidades taxonômicas 
operacionais (OTUs) por 236 aplicando o algoritmo UCLUST baseado em referência e atribuídas taxonomicamente usando o algoritmo blast
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237 e o conjunto de dados de referência UNITE conforme indicado acima. O conjunto de dados foi rarefeito para 
uma profundidade de 10.637 238 leituras por amostra no conjunto de dados 16S e 39.485 leituras por amostra no 
conjunto de dados ITS. 239 A diversidade beta foi avaliada pelo cálculo da métrica de distância Bray-Curtis dentro do pipeline QIIME 240. Para a visualização, plotagens bidimensionais de análise de coordenadas 
principais (PCoA) foram geradas para ambos os conjuntos de dados. Além disso, plotagens de escala 
multidimensional não métrica (NMDS) usando distâncias de Bray 242 Curtis foram implementadas para obter a 
composição da distância da amostra dentro de cada 243 repetições/tratamentos. Para a análise de rede, as 
principais OTUs (limiar: 60%) foram extraídas para cada 244 tratamentos de ambos os conjuntos de dados. O 
script integrado 'make_otu_network.py' foi usado para gerar 245 arquivos de rede que foram processados com 
Cytoscape v.3.6.1 (Shannon et al., 2003). As redes foram 246 renderizadas dentro deste ambiente de software 
com ênfase na taxonomia das OTUs identificadas e 247 suas abundâncias. 248 249 2.7. Quantificação do gene da 
fumonisina no DNA total da comunidade por qPCR 250 Para quantificar fragmentos do gene da fumonisina em 
extratos de DNA total, foi aplicado o par de primers Verpro-F e 251 252 VERTI-R conforme descrito por Waalwijk 
et al. (2008). A abordagem baseada em qPCR exigiu um padrão específico 253 que foi preparado pela amplificação 
do fragmento Verpro-F/VERTI-R (tabela suplementar 254 2) a partir de extratos de DNA total e posterior 
sequenciamento de Sanger do fragmento resultante. A identidade do fragmento 255 foi confirmada por pesquisas BLAST dentro da coleção NCBInt (www.ncbi.nlm.nih.gov) 256. Foi ligado no pGEM®-T Easy Vector 
(Promega, Alemanha) e posteriormente processado 257 conforme descrito por Bragina et al. (2013). DNase I de 
grau de amplificação (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) 258 extratos de DNA total tratados foram usados para 
determinar os efeitos inibitórios de substâncias co-extraídas.
259 Com base nesse experimento, o DNA total da comunidade foi diluído para 1:10 e os genes-alvo foram 260 
amplificados usando o kit KAPA SYBR FAST qPCR (Kapa Biosystems, Woburn, EUA). Duas 261 execuções 
independentes, com três réplicas para cada amostra, foram realizadas no Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, 
262 Mortlake, Austrália). O ciclo de qPCR seguiu este protocolo: 95 °C 5 min; 35 ciclos de 95 °C por 25 263 s, 58 
°C por 30 s, 72 °C por 30 s e após o último ciclo, como uma fusão final de DNA de fita dupla, a temperatura de 264 
foi aumentada para 95 °C com passos de 1°C por minuto. A especificidade dos amplicons foi confirmada com 
ambos, análise da curva de fusão. A fim de verificar a especificidade do iniciador, também executamos uma 
eletroforese em gel, usando o mesmo protocolo por meio de PCR convencional. 267 268 2.8. Análises quantitativas 
do conteúdo de fumonisina FB1 e FB2 269 270 A quantificação do conteúdo de fumonisina (FB1 e FB2) foi 
realizada com a técnica multi-micotoxina 271 baseada em cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem 
(LC-MS / MS) introduzida por 272 Sulyok et al . (2006). Para o preparo das amostras, foram utilizados 20 mL de 
acetonitrila/água/ácido acético (79:20:1, v/v 273/v) para homogeneização com 5 g de cada amostra de milho. A metodologia utilizada para a extração do 274 foi de acordo com Oliveira et al. (2016). Amostras com 
conteúdo de fumonisina (FB1 e FB2) 275 foram quantificadas com um QTrap 5500 LC-MS / MS System (Applied 
Biosystems, Foster City, CA, EUA) 276 equipado com uma fonte de ionização por eletrospray Turbo Ion Spray 
(ESI) após separação em um Sistema HPLC 1290 Series 277 (Agilent, Waldbronn, Alemanha). A separação 
cromatográfica foi realizada a 25 278 ÿC em uma coluna Gemini C18, 150 x 4,6 mm di, tamanho de partícula de 5 
µm, equipada com um cartucho de guarda de segurança C18 4 x 3 mm id 279 (Phenomenex, Torrance, CA, EUA ) 
dentro de uma solução de metanol-água-280 ácido fórmico como fase móvel (Li et al. 2012). Por fim, para a 
detecção de FB1 e FB2 nas amostras foi 281 usado o modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) conforme 
descrito por Oliveira et al. (2016). 282 Os teores de fumonisinas FB1 e FB2 foram detectados separadamente e 
somados para determinar o teor total de 283 fumonisinas por amostra. 284 285 2.9. Incidência de Fusarium spp. 
em grãos de milho
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315 Outros filos abundantes foram identificados como Bacteroidetes (15,6%), Firmicutes (5,4%), Actinobacteria 
316 (4,7%) e bactérias não classificadas (2,1%). No nível de classe, Gammaproteobacteria (40,4%), 317 
Betaproteobacteria (16,4%), Alphaproteobacteria (14,9%), Flavobacteria (7,3%) e 318 Sphingobacteria (5,1%) 
foram as linhagens mais comuns. Quando a comunidade foi avaliada no nível de ordem 319 (Material Suplementar 
Fig. S3), Enterobacteriales (24,4%) foi a linhagem mais comum 320 seguida por Burkholderiales (15,9%), 
Pseudomonadales (9,3%), Rhizobiales (8,3%), Flavobacteriales 321 (7,3%) e Sphingobacteriales (5,1%). As 
principaisfamílias bacterianas foram atribuídas a 322 Enterobacteriaceae (24,4%), Oxalobacteraceae (6%), 
Pseudomonaceae (5,2%), Sphingobacteriaceae 323 (5,1%), Burkholderiaceae (5%) e Xanthomonadaceae (4,9%). 
Ao nível do género (Fig. 1) predominaram duas 324 OTUs não atribuídas pertencentes à família Enterobacteriaceae 
com 10,1% e 6,3% 325 do total de leituras respetivamente. Outros gêneros abundantes foram identificados como 
Pseudomonas (5,2%), 326 Burkholderia (4,6%), Erwinia (4,2%), Sphingobacterium (4,1%), Ralstonia (4,1%) e 
Acinetobacter 327 (4%). 328 329 3.2. Alterações induzidas pelo tratamento na comunidade bacteriana 330 331 As 
diferenças na estrutura da comunidade foram avaliadas usando análises de diversidade beta com base na métrica 
de distância 332 Bray-Curtis. Os resultados foram visualizados em gráficos de PCoA onde nenhum agrupamento 
claro de 333 tipos de amostras foi observado (Material Suplementar Fig. S4). Além disso, um gráfico de escala 
multidimensional não métrica 334 (NMDS) (Material Suplementar Fig. S5) foi usado para visualizar o
286 
287 A incidência (%) foi avaliada com o teste Blotter, conforme proposto no Manual de 288 Análise de Sementes 
Sanitárias (Brasil, 2009). Um total de 200 grãos de cada parcela foi usado para o teste. Foram distribuídos 289 em 
placas de Petri utilizando 25 grãos por placa. Os grãos foram colocados sobre três camadas de papel filtro, 290 
umedecidos com água destilada estéril acrescida de ágar a 0,2% (p/v) e incubados a 20°C e fotoperíodo de 12 
291 h por 24 h. Posteriormente, foram congelados por 24 h a -20°C (para inativar o embrião) e 292, em seguida, 
incubados novamente a 20°C e fotoperíodo de 24 h por 14 dias. Posteriormente a incidência de Fusarium 293 spp. 
foi determinado. 294 295 2.10. Delineamento experimental e análises estatísticas das variáveis relacionadas a 
campo 296 297 Os experimentos de campo foram conduzidos em blocos casualizados com quatro repetições por 
298 tratamento. Para todas as análises, foi realizado o teste de normalidade de Shapiro-Wilk e o teste de hipótese 
com teste F para 299 igualdade de variâncias. Os dados de qPCR foram analisados em fatorial duplo 300 
(tratamento/tratamentos x tempo/tempos) em uma "ANOVA de duas vias" para campo 1 e campo 2. Para a análise de 301 fumonisinas totais (FB1 + FB2), uma ANOVA de uma via foi realizadas e as médias obtidas 
entre os 302 tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05). O Fusarium spp. a incidência (%) foi de 
303 analisada com ANOVA de uma via e o teste não paramétrico de Kruskal Wallis. SigmaPlot® versão 12 304 e 
Sisvar (Build 72) (Ferreira 2011) foram usados para análises estatísticas. 305 306 3. Resultados 307 308 3.1. 
Estrutura da comunidade bacteriana 309 Após filtragem de qualidade e remoção de sequências quiméricas e 
plastídicas, o conjunto de dados de amplicon do fragmento 310 311 do gene 16S rRNA compreendeu uma 
contagem total de leituras de 7.275.437 leituras com 10.637 a 509.978.312 leituras por amostra (mediana 104.789; 
média 151.572). A seleção de OTU baseada em UCLUST em um nível 313 de similaridade de 97% resultou em 
um total de 23.844 OTUs. As espigas de milho foram predominantemente colonizadas por 314 Proteobacteria 
(72,2% do total de leituras) quando a comunidade bacteriana foi avaliada em nível de filo.
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372 Visualizações com gráficos de PCoA mostraram arranjo de amostra altamente disperso sem agrupamento claro 
373 (Material Suplementar Fig. S7), semelhante às observações na comunidade bacteriana. Para 374 visualizações 
alternativas dos resultados, um gráfico de escala multidimensional não métrica (NMDS) 375 (Material Suplementar 
Fig. S8) foi gerado, mas da mesma forma como na comunidade bacteriana não foram encontrados 376 grupos 
distintos. Uma análise de rede foi implementada para identificar 377 OTUs específicas do tratamento em nível familiar 
devido à resolução do marcador ITS (Fig. 4). A maioria das OTUs fúngicas foram encontradas 378 no tratamento 
combinado de fungicida com B. subtilis (T2). Este tratamento incluiu 22 379 OTUs únicos e foi seguido pelo tratamento 
fungicida duplo (T3; 19 OTUs únicos), enquanto o grupo de controle 380 (T1) teve apenas 10 OTUs únicos. No 
tratamento de controle e no tratamento combinado, as 381 OTUs específicas da amostra foram atribuídas 
principalmente a membros das famílias Dothideomycetes e 382 Sordariomycetes. As plantas submetidas ao 
tratamento combinado tinham um membro de Tremellomycetes e 383 Microbotryomycetes, respectivamente. Quando 
o fungicida foi pulverizado duas vezes, resultou em uma
335 dados com a mesma métrica de distância. Novamente, não foram observadas diferenças claras na estrutura da 
comunidade bacteriana 336 nem agrupamento entre os tratamentos. As variações independentes do tratamento 
foram prevalentes em todos os tipos de amostra. Além da avaliação geral das diferenças nas 338 comunidades 
bacterianas, a ocorrência específica de tratamento de OTUs foi visualizada em uma rede (Fig. 2). Esta análise 339 
levou à identificação de vários táxons de assinatura para cada tratamento. No total, oito 340 OTUs únicos foram 
observados com o tratamento fungicida duplo (T3), enquanto o tratamento combinado, fungicida 341 com B. subtills 
(T2) não teve OTUs únicos. No entanto, três OTUs distintos atribuídos a Buchnera, 342 Cupriavidus e Leuconostoc 
foram compartilhados apenas entre as plantas tratadas com fungicida e aquelas 343 submetidas ao tratamento 
combinado. As OTUs que foram encontradas somente após o tratamento fungicida exclusivo 344 foram atribuídas 
aos gêneros Cellvibrio, Devosia, Flavobacterium, Leadbetterella, 345 Pediococcus, Rarobacter e Sphingobacterium. 
Uma OTU permaneceu não identificada em nível de gênero. O tratamento controle 346 (T1) teve cinco OTUs únicos, 
três permaneceram não identificados em nível de gênero, enquanto um 347 OTU foi atribuído ao gênero Burkholderia 
e o outro a Pedobacter. 348 349 3.3. Estrutura da comunidade fúngica 350 351 Após filtragem de qualidade e 
remoção de sequências quiméricas, o conjunto de dados de amplicon ITS fúngico 352 compreendeu uma contagem 
total de leituras de 7.093.161 leituras com 39.485 a 309.719 leituras por amostra (mediana 353 142.337; média 
147.774). A seleção de OTU baseada em UCLUST em um nível de similaridade de 97% resultou em 4.212.354 OTUs. 
Atribuições taxonômicas dentro da biblioteca de amplicons fúngicos indicaram que Ascomycota (96,3% 355 de todas as leituras) foi a linhagem predominante em todas as amostras no nível do filo. Basidiomycota (2,4%) 356 
foram menos abundantes e 1,2% dos lidos analisados permaneceram não atribuídos ao nível do filo. Dentro de 357 
Ascomycota, as classes de fungos Sordariomycetes (44,9%), Dothideomycetes (37,8%), Saccharomycetes 358 
(5,7%) e Eurotiomycetes (4,7%) foram predominantes. Em nível de ordem, Hypocreales (34,5%), Capnodiales 359 
(30,2%), Diaporthales (7,4%), Pleosporales (6,4%),Saccharomycetales (5,7%) e Eurotiales (4,4%) 360 foram as 
linhagens mais abundantes (Material Suplementar Fig. S6). Vários 361 grupos taxonômicos altamente abundantes 
com uma abundância total entre 7,4% e 29,4% não foram atribuíveis a nível de família.
362 famílias atribuídas incluíram Nectriaceae (22,4%), Trichocomaceae (4,4%), Pleosporaceae (4,3%) e 363 
Debaryomycetaceae (3,1%). Quando diferentes pontos de tempo de amostragem foram comparados (Fig. 3), 364 
Capnodiales (não mais classificados) foram predominantes com mais de 40% de abundância relativa em todos os 
365 tratamentos no ponto de tempo de coleta de amostra 1. Este valor caiu abaixo de 15% para todos os tratamentos 
em coleção 366 ponto de tempo 2. 367 368 3.4. Resposta da comunidade fúngica a diferentes tratamentos 369 370 
Para avaliar os efeitos dos tratamentos nas comunidades fúngicas em plantas de milho, análises de diversidade beta 
371 com base na métrica de distância Bray-Curtis foram implementadas no fluxo de trabalho de bioinformática.
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384 composição diversificada de OTUs únicos atribuídos a Cystobasidiomycetes, Dothideomycetes, 385 
Eurotiomycetes, Mortierellomycotina, Saccharomycetes, Sordariomycetes e Ustilaginomycotina no 386 nível de 
família. 387 388 3.5. Quantificação molecular de números de cópias de genes de fumonisinas 389 390 Dados 
obtidos por qPCR a quantificação de genes de fumonisinas nos diferentes tipos de amostra mostrou 391 normalidade 
e igualdade de variâncias após análise fatorial dupla (tratamentos × tempos de amostragem) 392 para o campo 1. 
Análises subsequentes mostraram significância para o diferença no número de cópias de genes em 393 em relação 
ao tempo (p < 0,001), tratamentos (p < 0,001) e a combinação entre tempo e tratamentos 394 (p = 0,009). Quando analisados dentro de tratamentos distintos (Fig. 5A), uma diferença significativa foi observada 395 (p < 
0,001) apenas entre o tratamento 1 e o tratamento 2 no tempo de amostragem 1 e entre o tratamento 2 e o 
tratamento 396 no tempo de amostragem 1. As outras variações entre tratamentos não foram significativos 
(tratamento 397 3 e tratamento 1 no tempo de amostragem 1 (p = 0,878); tratamento 1 e tratamento 2 no tempo de 
amostragem 2 (p = 398 0,148); tratamento 1 e tratamento 3 no tempo de amostragem 2 (p = 0,734 ) e tratamento 3 
e tratamento 2 em 399 tempo de amostragem 2 (p = 0,490)). Para o campo 2, os dados também apresentaram 
normalidade e igualdade de variâncias.
422 Quando a ocorrência de Fusarium spp foi avaliada por meio do teste de Blotter, as diferenças não foram 
significativas 423 (p = 0,783) de acordo com ANOVA no campo 1 (Material Suplementar Fig. S9 A). No campo 2 
424 (Material Suplementar Fig. S9 B), os dados não foram distribuídos normalmente quando avaliados com o teste 
425 Shapiro-Wilk (p = 0,031) e, portanto, foram analisados posteriormente com o teste não paramétrico Kruskal 426 
Wallis para obter análise de fileiras de variância. Aqui, as diferenças também não foram significativas 427 (p = 
0,994). 428 429 3.7. Deposição de dados 430 431 As bibliotecas de amplicons sequenciados foram depositadas no 
European Nucleotide Archive (ENA) e 432 estão acessíveis ao público sob o número de acesso PRJEB37077.
418 Nesse campo, o tratamento 3 (10,02 ppm) e o tratamento 1 (7,59 ppm) não diferiram significativamente quando 
419 analisados com ANOVA (p = 0,001) e teste de Tukey. Apenas o tratamento tandem com B. subtilis 420 
(tratamento 2) apresentou diferenças significativas em relação aos outros dois tratamentos, com concentração de 
0,77 ppm de fumonisina 421.
400 Os dados mostraram diferenças significativas na abundância gênica em relação ao tempo (p < 0,001), 
tratamentos 401 (p < 0,001) e a interação entre tempo e tratamentos (p = 0,001). Quando a combinação 402 entre 
o tempo e os tratamentos foi avaliada (Fig. 5B), a significância (p < 0,001) foi observada apenas 403 entre o 
tratamento 1 e o tratamento 2 no tempo 1 e entre o tratamento 2 e o tratamento 3 no tempo 1, o que 404 foi 
consistente com observações no campo 1. As outras variações entre tratamentos não foram 405 significativas 
(tratamento 3 e tratamento 1 no tempo de amostragem 1 (p = 0,119); tratamento 1 e tratamento 2 no tempo de 
amostragem 406 2 (p=0,915); tratamento 1 e tratamento 3 no tempo de amostragem 2 (p = 0,873) e tratamento 407 
3 e tratamento 2 no tempo de amostragem 2 (p = 0,995)). 408 409 3.6. Teor total de fumonisinas (FB1+FB2) e 
incidência de Fusarium spp. 410 411 Quando o conteúdo total de fumonisina (FB1 + FB2) foi comparado para cada 
tratamento e cada campo, 412 o campo 1 (Fig. 6A) apresentou níveis mais altos de fumonisina quando o fungicida 
foi pulverizado duas vezes (tratamento 3).
413 Nesse tratamento, a concentração de micotoxinas acumulou 3,84 ppm. A diferença entre outros 414 tratamentos 
foi significativa (p = 0,007) quando avaliada com ANOVA. No campo 1, também foram evidentes diferenças entre 
415 tratamentos, com o tratamento 3 diferindo do tratamento 1 (1,41 ppm) e do tratamento 2 416 (0,29 ppm); no 
entanto, os dois últimos não diferiram estatisticamente quando avaliados pelo teste de Tukey. No campo 417 2 (Fig. 
6B), os níveis de fumonisina foram maiores do que no campo 1; no entanto, um padrão diferente foi observado.
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466 Dentro da fração Proteobacteria, observou-se uma alta abundância das classes Gammoproteobacteria 
(40,4%), 467 Betaproteobacteria (16,4) e Alphaproteobacteria (14,9%) e isso parece ser um padrão 468 estável 
de impressão digital microbiana do filoplano de milho, independentemente do testado tratamento foliar 469 
(químico, combinação de químico e biológico ou água) como já proposto para o microbioma dominante da raiz 
do milho 470 (Rebollar et al 2017). 471 Curiosamente, embora nenhuma mudança geral nas diversidades da 
comunidade fúngica e bacteriana inferida 472 das análises de diversidade beta tenha sido observada entre os tratamentos, uma visualização de rede de bactérias 473 (Fig. 2) e fungos (Fig. 4) indicou uma 
ocorrência específica do tratamento de OTUs e confirmou 474 respostas distintas para cada tratamento (T1, T2 
e T3). Nossa hipótese é que as pulverizações foliares causam um “efeito de vácuo 475” na microbiota natural, o 
que permitiu que microorganismos adicionais recolonizassem os tecidos vegetais 476 com dominância de grupos 
específicos de acordo com o tratamento.
441 No entanto, a substituição não alterou as comunidades bacterianas e fúngicas conforme inferido a partir dos 
442 dados do microbioma em comparação com o controle da água de uso exclusivo do fungicida químico, o que 
443 implica em uma tecnologia de menor impacto e natureza seletiva. 444 Descobrimos que uma comunidade 
complexa de bactérias e fungos continua a colonizar o filoplano 445 sob pressão seletiva causada por fungicidas. Além disso, observamos a predominância decertos táxons, 446 principalmente as Proteobactérias 
Gram-negativas (mais de 70% das OTUs). Isso pode estar relacionado à alta 447 abundância dessas espécies 
bacterianas desse filo em solos com histórico de cultivo de milho 448 (Chauhan et al. 2011) e o microbioma do 
solo tem sido relatado como intrinsecamente relacionado ao 449 filoplano do milho ( Tao et al. 2016). As 
proteobactérias abrangem não apenas 450 bactérias associadas a plantas, mas também bactérias copiotróficas 
que são conhecidas por sua capacidade de competir por nutrientes de plantas devido à alta disponibilidade local 
de carbono 451 (Ai et al. 2015), como a deposição de pólen na superfície da planta durante a floração 452 que 
foram os tempos de amostragem para análise de microbioma. Assim, muitas das bactérias encontradas no 453 
microbioma da espiga de milho podem se originar do solo e deslocar o patógeno do estilete, a 454 principal 
entrada de F. verticillioides (Murillo-Williams e Munkvold, 2008), mas superando e/ou 455 competindo por 
nutrientes (Compant et al. 2019). Além disso, práticas comuns de cultivo de milho 456 em solos tropicais, como 
cultivo intenso nas mesmas áreas, sistemas de plantio direto e uso de fertilizantes, 457 que foram os adotados 
nas lavouras de milho onde os experimentos foram realizados, aumentam o solo 458 níveis de carbono e 
disponibilidade de nutrientes, condições que levam o microbioma a uma maior abundância 459 de Proteobactérias 
(Habbib et al. 2016). 460 Guiados pelas observações, assumimos que a alta presença de Proteobacteria não foi 
uma mudança induzida pelo tratamento 461, pois eles foram relatados como o filo bacteriano mais comum em 
solos e plantas 462 sob várias técnicas de cultivo (Wattenburger et al. 2019). Nossos experimentos indicam que o controle 463 (tratamento 1), a aplicação de fungicidas (V9) em combinação com B. subtillis (R1) 
(tratamento 464 2) ou duas aplicações em tandem de fungicidas (V9 + R1) (tratamento 3) diferiram em 
comunidades bacterianas 465 (Material Suplementar Fig. S4-5) e fúngicas (Material Suplementar Fig. S7-8) .
A co-ocorrência de gêneros distintos (3 OTUs - Buchnera, Cupriavidus e Leuconostoc) compartilhada 477 478 entre as plantas tratadas pode estar relacionada à primeira aplicação de fungicida químico durante o 
estádio fenológico V9 479 em ambos os tratamentos. Portanto, assumimos que a substituição do segundo 
momento de 480 aplicações de fungicida no tratamento 2, pelo agente de controle biológico B. subtilis BIOUFLA2, 
tem 481 efeitos diferentes na ocorrência de OTUs não nativas do que a aplicação exclusiva de fungicida. UMA
433 4. Discussão 434 
435 Embora o 
estabelecimento de comunidades microbianas naturais suprimindo as populações de patógenos 436 de plantas seja uma 
estratégia desejada para o manejo de doenças de plantas, nenhum tratamento eficiente foi 437 proposto em 
escala comercial para lidar com podridão de espiga e fumonisina. Além disso, confirmamos que 438 a aplicação 
exclusiva de fungicidas (triazol + estrobilurina) (Fig. 5) resultou no acúmulo de fumonisina 439 nos grãos. Quando 
substituímos uma segunda aplicação do fungicida por um biofungicida à base de Bacillus subtilis 440, 
encontramos uma redução na população do patógeno e também no teor de fumonisina.
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482 maior número de OTUs em amostras tratadas sugere que novos micro-nichos em tecidos vegetais tornaram-
se 483 disponíveis para colonização microbiana devido a práticas agrícolas. Anteriormente, os fungicidas 
mostraram 484 não apenas selecionar mutações em microrganismos que levavam a um melhor desempenho no 
filoplano 485 (Zheng et al., 2015), mas também causar uma diminuição da riqueza e diversidade em comunidades 
microbianas 486 (Escribano-Viana e outros, 2018). 487 Digno de nota, a redução consistente de fumonisina (Fig. 
6) foi obtida em condições altamente 488 favoráveis para a ocorrência da doença, uma vez que os experimentos foram realizados na primeira safra de 489 milho, principalmente com temperaturas e chuvas mais 
altas do que na segunda época de plantio. No entanto, a variação do microbioma ao longo das estações e como 
consequência dos tratamentos testados ainda precisa ser determinada, uma vez que as mudanças microbianas 
sazonais afetam a composição do microbioma do filoplano (Gobbi et al., 2020). 493 Por outro lado, B. subtilis 
não foi detectado nos dados do microbioma em nenhum dos tratamentos. Este 494 indica que não houve 
estabelecimento do fungicida biológico em espigas de milho ou estava abaixo do 495 limite de detecção, o que 
implica no deslocamento do patógeno quando de sua introdução e reforça 496 a recomendação de sua aplicação antes do momento mais favorável para o doença ocorra. 497 Estudos anteriores mostraram que os 
micróbios podem ter uma alta especificidade de tecido e que a ocorrência 498 de micróbios distintos pode diferir 
em habitats de plantas adjacentes uns aos outros (Douriet-Gámez et al., 499 2018; Maggini et al., 2019; 
Aschenbrenner et al., 2017). Portanto, assumimos que o B. 500 subtilis introduzido não é compatível com o 
microambiente em espigas de milho. Sua ação pode estar relacionada 501 principalmente aos metabólitos que ele secreta na formulação líquida do tratamento aplicado por spray. Os metabólitos do 502 BCA 
provavelmente estão envolvidos na proteção de plantas durante os estágios iniciais do desenvolvimento do grão 
503 e/ou através da resistência induzida. O modo de ação detalhado ainda precisa ser elucidado no futuro. 504 
Ao interferir com os efeitos evolutivos adquiridos de F. verticillioides na competição por substratos 505 (Blacutt 
et al. 2018) e produzir micotoxinas sob certas condições (Kvas et al. 2009; Omori et 506 al. 2019) a quantidade 
e a qualidade dos grãos de milho podem ser melhorado. No entanto, práticas agrícolas, como 507 o uso de 
fungicidas, muitas vezes resultam na exposição de F. verticillioides a um tipo adicional de estresse abiótico, 508 
causando níveis ainda mais altos de fumonisinas nos grãos (Cao et al. 2014). Quando analisamos os teores de 509 fumonisina nas duas lavouras, elas sempre foram menores na aplicação tandem de fungicida e 
B. 510 subtilis (lavo 1: 0,29 ppm e lavoura 2: 0,77 ppm), enquanto que com duas aplicações de fungicida foram 
511 significativamente maior (campo 1: 3,84 ppm e campo 2: 10,02 ppm). Surpreendentemente, o levantamento 
de Fusarium 512 sp. em grãos no teste de mata-borrão (Material Suplementar Fig. S9) não demonstrou tal 
diferença. Ou existe um efeito de cada tratamento sobre a produção fúngica da micotoxina ou a comunidade 514 
de Fusarium sp na semente abrange produtores e 515 não produtores de fumonisinas e até mesmo alguns deles 
que podem exercer potencial de biocontrole. Para verificar a segunda hipótese, 516 pesquisamos a dinâmica da 
população virulenta de F. verticillioides por meio de qPCR do fum1 517 (Fig. 5) e o tratamento que abrangeu B.subtilis reduziu consistentemente as cópias do gene nas primeiras 518 levantamento (10 dias após a inoculação 
de F. verticillioides ) enquanto não ocorreu sua redução no segundo levantamento (após 519 colheitas). Portanto, 
tal levantamento corrobora com o blotter test, ou seja, em um momento posterior 520 ponto as populações de F. 
verticillioides e outras espécies de Fusarium são reduzidas, mas não eliminadas, a população 521 aumenta nos 
grãos o que leva a um efeito tamponado dos tratamentos também demonstrou 522 a partir da análise do 
microbioma, conforme discutido acima. 523 Além disso, não testamos a primeira hipótese do aumento de 
fumonisina com a pulverização do fungicida exclusivo 524, mas autores anteriores (Marín et al. 2013; Cao et al. 
2014) demonstraram que o fungicida 525 causa um estresse ao fungo que leva ao aumento da produção de 
fumonisinas.
Outra crítica à substituição do uso exclusivo do fungicida por um agente de biocontrole é 526 527 o manejo sustentado de doenças foliares e, portanto, o rendimento de grãos. Portanto, avaliamos o rendimento do 
milho 528 (Material Suplementar Fig. S10) para ambos os campos e observamos um rendimento 
consistentemente maior para o uso exclusivo de fungicidas 529 em comparação com o tratamento com a 
substituição do fungicida pelo controle biológico 530, mas isso nem sempre foi diferente de o controle de água. 
Postulamos que o biocontrole
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No entanto, embora o maior rendimento seja alcançado com o teor de fumonisina acima de 4 ppm, para a maioria dos 535.536 países, a produção de milho não tem mercado ou é fortemente impactada no preço que 
recebe.
544 Podemos inferir do presente estudo que a segunda aplicação de fungicida químico pode causar uma maior 
545 resposta de estresse ao patógeno, provavelmente devido à fenologia da planta coincidir com o período crítico 
546 de incidência e colonização do patógeno nos grãos (Blacutt e outros 2018). 547 A eficácia de BIOUFLA2 foi 
confirmada em termos de redução do teor de fumonisina em grãos, 548 mas resta saber se está competindo pelo mesmo nicho que F. verticillioides e 549 reduzindo a colonização pelo patógeno como sugerido 
anteriormente (Cavaglieri et al ., 2005; Pereira et al., 550 2009). O estabelecimento de B. subtilis pode ser abordado 
em estudos de aprofundamento com implementação 551 resolvida no tempo de sequenciamento de próxima 
geração (NGS) de comunidades fúngicas e bacterianas para 552 entender a dinâmica da variação temporal e 
espacial conforme sugerido anteriormente (Rastogi et al. , 553 2013). A filosfera vegetal é geralmente considerada 
um ambiente hostil para 554 microrganismos devido à disponibilidade limitada de nutrientes e condições ambientais 
extremas, como variações de 555 temperatura e umidade, estresse osmótico, radiação ultravioleta e limitação de 
nutrientes (Bulgarelli et al., 556 2013), mas ainda uma barreira importante para neutralizar infecções por patógenos. 
557 558 5. Conclusão 559 Este trabalho fornece novos insights sobre o uso do manejo integrado de doenças para 
neutralizar 560 561 doenças devastadoras causadas por F. verticillioides em regiões tropicais produtoras de milho. 
A aplicação de B. subtillis 562 BIOUFLA2 foi mais eficaz quando aplicada em uma abordagem em tandem com 
fungicidas do que a aplicação de fungicida duplo 563. O uso preventivo de fungicidas sozinho não é um tratamento 
suficiente contra 564 F. verticilliodes e pode aumentar a produção de micotoxinas. Esses resultados indicam o 
potencial de 565 produtos à base de Bacillus para o manejo da podridão da espiga por Fusarium em condições tropicais. Ao implementar 566 uma abordagem guiada por microbioma, mostramos que as comunidades 
microbianas nativas em 567 plantas de milho respondem a todas as aplicações de pesticidas analisadas. As 
aplicações resultaram na 568 ocorrência de táxons únicos que não são detectáveis em plantas não tratadas e suas 
implicações na resiliência a doenças 569 da planta hospedeira ainda precisam ser melhor elucidadas. 570 571 
CRediT declaração de contribuição de autoria 572 573 Rafaela Araújo Guimarães: Conceituação; Curadoria 
de dados; Análise formal; Investigação; 574 Metodologia; Programas; Validação; Visualização; Papéis/Escrita - 
rascunho original; Redação - revisão e edição 575. Paul Esteban Pherez Perrony: Análise formal, investigação, 
validação. Henry Müller: 576 Conceitualização, curadoria de dados; Análise formal; Investigação; Metodologia; 
Recursos; Programas; 577 Validação; Visualização. Gabriele Berg: Conceituação; Captação de financiamento; 
Administração do Projeto 578; Recursos; Validação; Visualização; Papéis/Escrita - rascunho original; Redação - 
revisão 579 e edição. Tomislav Cernava: Conceituação; Curadoria de dados; Análise formal; Investigação;
531 agente tem atividade seletiva para F. verticillioides e fumonisina. Mas não lida com as doenças 532 foliares e 
tanto os híbridos mais tolerantes às doenças foliares quanto a combinação do biocontrole com o fungicida 533 na 
segunda pulverização devem ser considerados em campos altamente propícios a doenças de plantas 534 como os 
adotados em nossos ensaios .
537 Devido à importância dos grãos de milho para a alimentação de suínos e aves, e ao impacto da sua 538 
contaminação por fumonisinas, a qualidade do grão é tão importante quanto a disponibilidade geral (Souto 539 et 
al. 2017; Antonissen et al. 2017). Portanto, nessa perspectiva, a substituição do fungicida 540 pelo Bacillus na 
segunda aplicação compensa. 541 Além disso, é digno de nota que a substituição de uma aplicação de fungicida 
por B. subtilis não é apenas 542 mais ecológica e atende às regulamentações internacionais sobre a redução do uso de 543 pesticidas na proteção de plantas, mas também é a mais eficaz na redução do total de 
fumonisina contente.
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13
Impacto das micotoxinas Fusarium na expressão do mRNA hepático e intestinal das enzimas do citocromo 609 610 P450 e transportadores de drogas, e na farmacocinética da enrofloxacina oral em 611 frangos de corte. Química 
Alimentar. Toxicol., 101, 75-83. Doi: 10.1016/j.fct.2017.01.006 612 Aschenbrenner, IA, Cernava, T., Erlacher, A., Berg, G. e Grube, M. (2017). Compartilhamento diferencial 613 e redes distintas de coocorrência entre microbiota 
bacteriana espacialmente próxima de cascas, musgos 614 e líquenes. Mol. Eco. 26, 2826-2838.
616 Berendsen, RL, Vismans, G., Yu, K., Song, Y., de Jonge, R., Burgman, WP e Pieterse, CM 617 (2018). Associação 
induzida por doença de um consórcio de bactérias benéficas para plantas. O ISME 618 J. 12, 1496-1507. doi:10.1038/s41396-018-0093-1 619 Blacutt, AA, Gold, SE, Voss, KA, Gao, M. e Glenn, AE (2018). Fusarium 
verticillioides: 620 Avanços na compreensão da toxicidade, virulência e adaptações de nicho de um patógeno micotoxigênico modelo do milho. fitopatol. 108, 312-326. doi: 10.1094/PHYTO-06-17- 621 622 0203-RVW 623 Bluhm, BH, 
Kim, H.,Butchko, RA, Woloshuk, CP Envolvimento de ZFR1 de Fusarium 624 verticillioides na colonização do núcleo e na 
regulação de FST1, um suposto gene transportador de açúcar necessário para a biossíntese de fumonisina em grãos de milho. Mol Plant Pathol. 2008;9(2):203-625 211. doi:10.1111/j.1364-3703.2007.00458.x 626
580 Metodologia; Recursos; Programas; Supervisão; Validação; Visualização; Papéis/Escrita - rascunho original 581; 
Redação - revisão e edição. Flávio Henrique Vasconcelos de Medeiros: Conceituação; 582 Aquisição de financiamento; 
Administração de projetos; Recursos; Supervisão; Validação; Visualização; 583 Papéis/Escrita - rascunho original; Redação 
- revisão e edição. 584 585 Agradecimentos 586 587 Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa de 
Minas Gerais - FAPEMIG - bolsa 588 (nº CAG APQ 01578/15). A CAPES forneceu apoio financeiro para a mobilidade do 
primeiro autor (Rafaela 589 Araújo Guimarães) durante seu doutorado 590 Queremos agradecer a Julio Carlos Pereira da 
Silva, Rene Medeiros e Luisa Reis por sua ajuda durante 591 amostragens no campo e durante a colheita, bem como pela 
ajuda com experimentos de laboratório 592 realizados em Lavras (Brasil). também gostaria de agradecer a Olivia Laggner, Adrian Wolfgang e Barbara 593 Fetz por toda a ajuda com experimentos de laboratório conduzidos em Graz 
(Áustria). Dagma Dionisia e 594 Fabricio Lanza são muito reconhecidos por doarem a cepa F. data 597 598 O Material 
Suplementar para este artigo está incluído como um arquivo separado 599 600 Referências 601 602 Afolabi, CG, Ojiambo, 
PS, Ekpo, EJA, Menkir, A., and Bandyopadhyay, R. (2007). íon 603 de linhagens endogâmicas de milho para resistência à podridão da espiga de Fusarium e acúmulo de fumonisina em grãos na África tropical. Plant Dis., 91, 279-286. 
doi: 10.1094/PDIS-91-3-0279 604 605 Ai, C., Liang, G., Sun, J., Wang, X., He, P., Zhou, W., and He, X. (2015 ). Dependência 
reduzida do microbioma da rizosfera 606 em carbono derivado de plantas em solos fertilizados 607 inorgânicos e orgânicos 
de longo prazo de 32 anos. Bio do Solo. Biochem., 80, 70-78. doi: 10.1016/j.soilbio.2014.09.028 608 Antonissen, G., 
Devreese, M., De Baere, S., Martel, A., Van Immerseel, F., and Croubels, S. (2017).
615 Benett, JW e Klich, M. (2003) Micotoxinas. Clin. Microbiol. Rev, 6.
Machine Translated by Google
https://doi.org/10.1016/j.fct.2017.01.006
https://doi.org/10.1094/PHYTO-06-17-0203-RVW
https://doi.org/10.1094/PHYTO-06-17-0203-RVW
https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2014.09.028
14
(2011) Padrões globais de diversidade de rRNA 16S em uma profundidade de milhões de sequências por amostra. 641 642 Proc. Nacional Acad. ciência US A, 108, 4516-4522. doi: 10.1073/
pnas.1000080107 643 Cavaglieri, L., Orlando, JRMI, Rodriguez, MI, Chulze, S., e Etcheverry, M. (2005). Biocontrole 644 de Bacillus subtilis contra Fusarium verticillioides in vitro e ao nível da raiz de 
milho 645. Res.Microbiol., 156 646 Cernava, T., Chen, X., Krug, L., Li, H., Yang, M. e Berg, G. (2019). O 
microbioma da folha de chá mostra 647 respostas específicas a pesticidas químicos e aplicações de biocontrole. ciência Total Environ, 667, 648 33-40. doi: 10.1016/j.scitotenv.2019.02.319.
748-754. doi: 10.1016/j.resmic.2005.03.001
633 Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., van Themaat, EVL e Schulze-Lefert, P. (2013). 634 Estrutura e 
funções da microbiota bacteriana das plantas. Annu. Rev. Plant Biol., 64, 807- 635 838. doi: 10.1146/annurev-arplant-050312-120106 636 Cao, A., Santiago, R., Ramos, AJ, Souto, XC, Aguín, O., Malvar, 
RA, e Butrón, A. (2014). 637 Fatores ambientais e genotípicos críticos para infecção por Fusarium verticillioides , crescimento fúngico 638 e contaminação por fumonisina em milho cultivado no noroeste da 
Espanha. Int J Food 639 Microbiol.,177, 63-71. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.02.004 640 Caporaso, JG, 
Lauber, CL, Walter, WA, Berg-Lyons, D., Lozupone, CA, Turnbaugh, PJ, et al.
649 Chauhan, PS, Chaudhry, V., Mishra, S. e Nautiyal, CS (2011). Diversidade bacteriana não cultivada em 
650 rizosfera tropical de milho (Zea mays L.). J Basic Microbiol., 51, 15-32. doi: https://doi.org/10.1002/jobm.201000171 651 652 Compant, S., Samad, A., Faist, H., e Sessitsch, A. (2019). Uma 
revisão sobre o microbioma vegetal: 653 Ecologia, funções e tendências emergentes na aplicação microbiana. J. Adv. Res., 19, 29-37.doi: 654 10.1016/j.jare.2019.03.004 655 DeSantis, TZ, Hugenholtz, 
P., Larsen, N., Rojas, M., Brodie, EL, Keller, et al. (2006). Greengenes, um banco de dados de genes 16S rRNA 
verificado por quimera e bancada de trabalho compatível com ARB. Appl. 656 657 Ambiente. Microbiol.,72, 5069–5072. doi:10.1128/AEM.03006-05 658 Douriet-Gámez, NR, Maldonado-Mendoza, IE, 
Ibarra-Laclette, E., Blom, J., & Calderón-Vázquez, 659 CL (2018). Análise genômica de Bacillus sp. Cepa B25, um agente de biocontrole do patógeno do milho 660 Fusarium verticillioides. Microbiologia atual, 
75(3), 247-255. doi: 10.1007/s00284-017- 661 1372-1 662 Escribano-Viana, R., López-Alfaro, I., López, R., 
Santamaría, P., Gutiérrez, AR, & González 663 Arenzana, L. (2018 ). Impacto de fungicidas químicos e biológicos aplicados à videira na diversidade microbiana de 664 biofilmes, mostos e vinhos. Frente. 
Microbial., 9, 59. Doi: 665 10.3389/fmicb.2018.00059 666 Edgar, RC (2010). Pesquise e agrupe ordens de magnitude mais rápido que o BLAST. bioinform. 26, 667 2460-2461. doi: 10.1093/bioinformatics/
btq461 668 Edgar, RC, Haas, BJ, Clemente, JC, Quince, C., Knight, R. (2011). UCHIME melhora a sensibilidade 
669 e a velocidade de detecção de quimeras. bioinform. 27, 2194–200. doi:10.1093/bioinformatics/btr381 670 Edwards, SG e Godley, NP (2010). Redução da giberela e desoxinivalenol em trigo com 
aplicação precoce de fungicida protioconazol. Aditivo Alimentar. Contam., 27, 629-635. 671 672 doi: 10.1080/19440040903515942 673 Ferreira, DF (2011). Sisvar: sistema computacional de análise 
estatística. Ciênc. Agrotec., 35(6), 1039-674
,
1042.
627 Bragina, A., Berg, C., Müller, H., Moser, D. e Berg, G. (2013). Insights sobre a diversidade bacteriana 
funcional 628 e seus efeitos no funcionamento do ecossistema do pântano alpino. ciência Rep., 3, 1995. doi: 629 10.1038/srep0195 630 BRASIL.(2009). Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. 
Manual de Análise Sanitária de Sementes. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa 631 632 Agropecuária. Brasília: MAPA/ACS, 2009. 200p.
Machine Translated by Google
https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.02.319
https://doi.org/10.1016/j.resmic.2005.03.001
https://doi.org/10.1002/jobm.201000171
https://doi.org/10.1016/j.jare.2019.03.004
15
675 Figueroa-López, AM, Cordero-Ramírez, JD, Martínez-Álvarez, JC, López-Meyer, M., Lizárraga 676 Sánchez, GJ, 
Félix-Gastélum, R., e Maldonado-Mendoza, IE (2016). Bactérias rizosféricas 677 do milho com potencial para biocontrole de Fusarium verticillioides. SpringerPlus, 5, 678 330-342. doi: 10.1186/s40064-016-1780-x 679 Galvão, 
JCC; Borém, A.; Pimentel, MA(2017). Milho: fazer plantio à colheita. Editora UFV, 382 680 681 Gobbi, A., Kyrkou, I., Filippi, E., Ellegaard-Jensen, L., & Hansen, LH (2020). Dinâmica microbiana epifítica sazonal 682 em 
folhas de videira sob biocontrole e tratamentos com fungicida 683 cobre. Relatórios Científicos, 10(1), 1-13. doi: 10.1038/s41598-019-56741-z 684 Habbib, H., Verzeaux, J., Nivelle, E., Roger, D., Lacoux, J., Catterou, M., et 
al. (2016). A conversão para o plantio direto 685 melhora a eficiência do uso do nitrogênio do milho em um sistema de 
cultivo contínuo de cobertura. PloS 686 um, 11, e0164234. Doi: 10.1371/journal.pone.0164234 687 Kemperman, RA, 
Gross, G., Mondot, S., Possemiers, S., Marzorati, M., Van de Wiele, T. et al. 688 (2013). Impacto dos polifenóis do chá 
preto e vinho tinto/suco de uva em um microbioma modelo intestinal. Alimentos Res. Int., 53, 659-669. doi: 10.1016/j.foodres.2013.01.034 689 690 Kvas, M.; Marasas, WFO; Wingfield, BD; Wingfield, MJ; Steenkamp, ET 
(2009). Diversidade e evolução de 691 espécies de Fusarium no complexo Gibberella fujikuroi. Fungal Divers., 34, 1–21.
710 Marín, P., de Ory, A., Cruz, A., Magan, N., e González-Jaén, MT (2013). Efeitos potenciais de 711 condições 
ambientais na eficiência do antifúngico tebuconazol no controle da taxa de crescimento de Fusarium 712 verticillioides e Fusarium proliferatum e na biossíntese de fumonisina. Int. J. Alimentos. 713 Microbiol., 165, 251-258. 
doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.05.022 714 Masiello, M., Somma, S., Ghionna, V., Logrieco, A., and Moretti, A. (2019). Resposta in vitro e em campo 715 de diferentes fungicidas contra espécies de Aspergillus flavus e 
Fusarium causadoras da podridão da espiga 716 doença do milho. Toxinas. 11, 11-29. doi: 10.3390/toxins11010011 717 Medina, A., Mohale, S., Samsudin, NIP, Rodriguez-Sixtos, A., Rodriguez, A., and Magan, N. 718 (2017). 
Biocontrole de micotoxinas: dinâmica e mecanismos de ação. atual Opin. Food Sci., 17, 41-48. doi: 10.1016/
j.cofs.2017.09.008 719 720 Medina-Córdova, N., López-Aguilar, R., Ascencio, F., Castellanos, T., Campa-Córdova, AI, e 721 Angulo, C. ( 2016). Atividade de biocontrole da levedura marinha Debaryomyces hansenii contra 
722 fungos fitopatogênicos e sua capacidade de inibir a produção de micotoxinas em grãos de milho (Zea mays 723 L.). Biol. Controle, 97, 70-79. doi: 10.1016/j.biocontrol.2016.03.006
703 Lundberg, DS, Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, CD, Dangl, JL (2013) Inovações práticas para sequenciamento 
de amplicon de alto rendimento. Nat. Métodos., 10, 999–1002. doi: 704 705 10.1038/nmeth.2634 706 Maggini, V., Mengoni, A., Gallo, ER, Biffi, S., Fani, R., Firenzuoli, F., e Bogani, P. (2019). Especificidade do tecido 707 e 
efeitos diferenciais no crescimento vegetal in vitro de endófitos bacterianos únicos 708 isolados das raízes, folhas e solo rizosférico de Echinacea purpurea. BMC Plant Biol. 709 19, 284.
692 Lane, B., Sharma, S., Niu, C., Maina, AW, Wagacha, JM, Bluhm, BH e Woloshuk, CP (2018). 693 Alterações no 
microbioma fúngico do milho durante o armazenamento hermético nos Estados Unidos e no Quênia. Frente. Microbiol, 9, 2336. doi: 10.3389/fmicb.2018.02336 694 695 Lanza, FE, Zambolim, L., da Costa, RV, Queiroz, VAV, 
Cota, LV, da Silva, DD, et al. 696 (2014). Prevalência de espécies de Fusarium produtoras de fumonisinas em grãos de milho brasileiros. Crop 697 Prot., 65, 232-237. doi: 10.1016/j.cropro.2014.08.003 698 Li C, Wu 
YL, Yang T, Huang-Fu WG. Determinação rápida de fumonisinas B1 e B2 em milho por cromatografia líquida-
espectrometria de massas tandem com extração ultrassônica. J Chromatogr Sci. 2012 699 700 Jan;50(1):57-63. doi: 10.1093/chromsci/bmr009. PMID: 22291057; PMCID: PMC3252123.
pág.
701 Litch, M., Abendroth, LJ, Boyer, MJ e Marlay, SK (2011). Crescimento e desenvolvimento do milho. PMR 702 1009, 
Iowa State University Extension, Ames, IA.
Machine Translated by Google
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0164234
https://doi.org/10.1016/j.foodres.2013.01.034
https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2016.03.006
https://doi.org/10.1016/j.cropro.2014.08.003
16
724 Mendes, MC, Von Pinho, RG, Von Pinho, EVR, e Faria, MV (2012). Comportamento de Híbridos de Milho 
725 Inoculados com Fungos da podridão dos grãos e Associação a Parâmetros Químicos e Bioquímicos 726. Ambiência, 8(2), 275-292.
727 Murillo-Williams, A., & Munkvold, GP (2008). Infecção sistêmica por Fusarium verticillioides em plantas de 
milho cultivadas sob três regimes de temperatura. Doença de plantas, 92(12), 1695-1700. doi: 728 729 10.1094/PDIS-92-12-1695 730 Noonim, P., Mahakarnchanakul, W., Nielsen, KF, Frisvad, JC, & 
Samson, RA (2009). Produção de fumonisina 731 B2 por Aspergillus niger em grãos de café tailandês. Aditivo Alimentar. Contam. Part A, 26, 94- 732 100. doi: 10.1080/02652030802366090 733 Oliveira, 
MS, Rocha, A., Sulyok, M., Krska, R., and Mallmann, CA (2017). Contaminação natural por micotoxina 734 em 
milho (Zea mays L.) na região Sul do Brasil. Food Control, 73, 127- 735 132. doi: 10.1016/j.foodcont.2016.07.033 736 Omori, AM, Ono, EYS, Hirozawa, MT, de Souza Suguiura, IM, Hirooka, EY, Pelegrinelli 
737 Fungaro, MH, e Ono, MA (2019). Desenvolvimento de ensaio imunoenzimático competitivo indireto para detecção de Fusarium verticillioides em amostras de ração para aves. Toxins, 11, 48. 738 739 
doi: 10.3390/toxins11010048 740 Pereira, P., Nesci, A., and Etcheverry, MG (2009). Eficácia de tratamentos 
bacterianos de sementes no 741 controle de Fusarium verticillioides em milho. Biocontrol , 54, 103-111. doi: 10.1007/s10526-742 007-9148-3 743 Rastogi, G., Coaker, GL e Leveau, JH (2013). Novos 
insights sobre a estrutura e função da microbiota da filosfera 744 por meio de abordagens moleculares de alto rendimento. FEMS Microbiano. 745 Let., 348, 1-10. doi: 10.1111/1574-6968.12225 746 
Rebollar, EA, Sandoval-Castellanos, E., Roessler, K., Gaut, BS, Alcaraz, LD, Benítez, M., and 747 Escalante, 
AE (2017). Mudanças sazonais em uma policultura baseada em milho no centro do México remodelam as redes de co-ocorrência de comunidades bacterianas do solo. Frente. Microbiol., 8, 2478-748 
749 2491. doi: 10.3389/fmicb.2017.02478 750 Rheeder, JP, Marasas, WF e Vismer, HF (2002). Produção de análogos de fumonisina por Fusarium 751 752 Saravanakumar, K., Li, Y., Yu, C., Wang, QQ, 
Wang, M., Sun, J, et al. (2017). Efeito de Trichoderma harzianum no microbioma da rizosfera do milho e no biocontrole da podridão do colmo de Fusarium. ciência Rep., 7, 753 754 1771-1784. doi: 
10.1038/s41598-017-01680-w 755 Schoch, CL, Seifert KA, Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, JL, Levesque, 
CA, et al (2012) 756 Espaçador transcrito interno do ribossoma nuclear (ITS ) como um marcador de código de barras de DNA universal 757 para fungos. Proc. Nacional Acad. ciência EUA, 109, 
6241-6246. doi: 10.1073/pnas.1117018109 758 Shannon, P., Markiel, A., Ozier, O., Baliga, NS, Wang, JT, Ramage, D., e Ideker, T. (2003). 759 Cytoscape: um ambiente de software para modelos 
integrados de redes