extração de DNA

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Modificação de um protocolo de extração de DNA CTAB para 
plantas que contenham componentes de polissacarídeos e 
polifenóis altos
A extração de D NA de plantas de baga e outras plantas contendo) materiais pegajosos e 
resinosos tem sido difícil no passado (Webb & Knapp, 1990; Varadarajan & Prakash, 
1991; Fang et al., 1992; Collins et al., 1992). Nos morangos, como outras plantas de 
baga, a presença de metabolitos secundários, como polifenóis, taninos e polissacarídeos, 
inibe a ação enzimática. Os polissacarídeos são visivelmente evidentes no DNA extraído 
pela textura viscosa, semelhante a cola e fazem O DNA não gerenciável em pipetagem e 
não é expansível na reação em cadeia da poliamida (PCR) por inibição da atividade da 
Taq-polimerase (Fang et al., 1992). Quando jovem, expandir o material de folhas e 
lançamentos é limitado ou a planta não sofre alongamento ativo no momento da coleta, a 
pureza do DNA torna-se cada vez mais difícil. O ADN obtido a partir de um material após 
o estágio de brotação mostrou-se difícil de extrair e instável para o armazenamento a 
longo prazo (Lodhi et al., 1994). Com a maturidade, as folhas contêm quantidades 
aumentadas de polifenóis, taninos e polisacqueiras. O tratamento de tais componentes 
nas folhas maduras torna-se necessário quando as folhas e os rebentos que se 
expandem mais jovens não estão disponíveis durante o período de coleta.
Nós fomos uniformemente sem sucesso em nossas tentativas de amplificar o DNA de 
Fragaria por PCR usando outros métodos relatados, incluindo os de Dellaporta et al. 
(1984), Saghai-Maroof et al. (1984), Doyle & Doyle (1990), LaRoche (1992), Oard & 
Dronavalli (1992), Wang et al. (1993), Richards et ai. (1994), e Davis et al. (1995). Como 
resultado, achamos necessário elaborar um protocolo para a extração de DNA a partir de 
tecido de folha expandida totalmente desenvolvido que produza DNA adequado para 
PCR, especialmente para RAPDs, e isso seria consistente para muitas espécies de 
morangos selvagens e cultivadas diferentes, tanto diploides E octoploid. O protocolo 
descrito aqui é relativamente rápido e barato e fornece DNA limpo, consistentemente 
amplificável na reação em cadeia da polimerase usando a técnica RAPD (William et al., 
1990) para todos os Fragaria spp. Ensaiado. O tecido de Fragaria e o DNA armazenados 
durante 21 meses a -20 ° também mostraram-se estáveis e amplificáveis.
Materias e métodos
Soluções necessárias:
Clorofórmio: octano124: 1 (v / v)
NaC1 5 M
Tampão TE: tris-HC1 10 mM, EDTA i mM, pH 8,4
RNase A: 10mg / mL
Proteinase K: 1 mg / mL1
Cloroformo-fenol saturado em TE
Polivinilpirrolidona (PVP) Sigma P-9003-39-8 (40 000)
Tampão de extração: tris 100 mM, NaC1 1,4 M, EDTA 20 mM, pH 8,0, 2%
CTAB, 0,3% ~ -mercantoetanol2
Tampão de reacção de PCR: tris-HC1 100 mM, KC1 100 mM, pH 8,3
Primer: set # 8 UBC, University of British Columbia Fragmento Stoffel: reagentes 
fornecidos por Perkin Elmer
Sessenta plantas de morango de espécies selvagens e cultivadas de octopóides 
canadenses (2 n = 56), incluindo F. chiloensis (L.) Dcne., F. virginiana Dcne, F. virginiana 
forma multicipita (Fern.) Catling & Cayouette, F. X ananassa nm. Cuneifolia (Nutt.) Staudt, 
e uma espécie diploide (2 n = 14), F. vesca L., foram utilizadas, 5-12 plantas por espécie. 
A modificação do procedimento de extração de CTAB de Doyle & Doyle (1990) inclui 
concentrações elevadas de NaC1 no tampão para remover polissacarídeos (Lodhi et al., 
1995) e polivinilpirrolidona (PVP) para remover polifenóis (Maliyakal, 1992). Foi 
necessário um tratamento prolongado de RNase de uma hora para que o produto de DNA 
fosse livre de RNA e amplificável por PCR, com um passo adicional de fenol-clorofórmio 
(Saghai-Maroof et al., 1984) para remover qualquer excesso de proteínas. Essas etapas 
fornecem a chave principal para o sucesso da coleta de DNA a partir de folhas de 
morango maduras.
O exame do polimorfismo através do uso de primers com seqüências arbitrárias (RAPD) 
foi feito com sucesso com 16 iniciadores diferentes após o rastreio inicial de 
aproximadamente 50 primers. As reações de PCR de volume de 25 ~ tl continham tampão 
de reação de PCR, MgC12 2 mM, dNTPs 0,1 mM, iniciador 2,4 mM, 2 unidades de 
fragmento Stoffel, DNA Ig e foram colocados em um termociclador PTC100 da MJ 
Research Inc.. O ciclo térmico incluiu um ciclo a 5 minutos de desnaturação a 94 ~ um 
minuto de recozimento a 47 ~ dois minutos de extensão do iniciador a 72 ~, em seguida, 
35 ciclos de um minuto cada em 94, 47 e 72 ~ com tempo mínimo de rampa. Os 
amplicões de PCR foram então executados num gel de agarose fino de 3 a 4 ram de 1,5% 
para melhores resultados.
O Protocolo
Extração de DNA
- Coletar folhas de Fragaria, congelar em nitrogênio líquido e armazenar em -70 ~ até o 
uso. Grind 0,5 g de folhas usando argamassa e pilão na presença de nitrogênio líquido 
até finamente moído. Transfira o tecido de folha de solo congelado para tubos de 
centrífuga de polipropileno de 15 ml.
- Adicione 5 mL de tampão de extração de 60 ~ e 50 mg de PVP / 0,5 g de tecido foliar. 
Misturar por inversão e incubar em 60 ~ forno (com agitação) durante 25 a 60 minutos.
- Retire do calor e deixe esfriar à temperatura ambiente por 4 a 6 minutos.
-  Adicione 6 mL de clorofórmio: octanol (24: 1) e misture por inversão para formar uma 
emulsão.
- Depois de misturar completamente, gire a 3000 rpm durante 20 minutos em uma 
centrífuga de mesa à temperatura ambiente.
- Transfira a solução aquosa superior para novos tubos de centrífuga de 15 mL usando 
uma ponta de pipeta de grande diâmetro. Repita a extração de clorofórmio-octanol para 
remover a nebulosidade (PVP) em fase aquosa. 1
- Adicione o volume 1/2 de NaC1 5 M até a solução aquosa final recuperada.2 Misture 
bem. Adicione dois volumes de frio (-20 ~ 95% de etanol. Misture por inversão. Se 
necessário, coloque no congelador (-20 ~ por 10 minutos para acentuar a precipitação. 
A solução pode ser deixada de 4 a 6 ~ para precipitar durante a noite.
-  Spin a 3000 rpm por 6 minutos. 3
-  Desligue o sobrenadante e lave o sedimento com frio (0 a 4 ~ 70% v /
- V etanol. Pellet seco em forno de 37 ° ou vácuo até secar (~ 1 hora). 9 Dissolver em 
300 ~ tLTE durante a noite a (4 a 6 ~ 4Transfer para 1,5 mL
- Eppendorf tubes, s
-  Adicione 3 ~ tLRNase A (10 mg / mL) e incube em banho de água de 37 ~
- Por aproximadamente uma hora. Adicione 3 ~ tLproteinase K (lmg / mL) e
- Incubar a 37 ~ por 15 a 30 minutos.
-  Adicione 150 ~ tL de fenol e 150 ~ TL de clorofórmio a cada Eppendorf
- tubo.
-  Vortex brevemente e gire (em microcentrífuga) a 14,000 rpm por 10 a 15
- minutos. Coletar a camada superior no novo tubo de 1,5. Adicione 50 ~ L TE a
- Fase de fenol. Vortex, gire, remova a camada superior e adicione à amostra. 9Add 1/10 
vol. 2 M de acetato de Na e 2 vol. Etanol absoluto e mistura. 9Lavei durante a noite no 
freezer (-80 ~ Spin a 14,000 rpm por 10 a 20
- minutos. Drenar e lavar com 70% v / v de EtOH. Retire o EtOH. 9 Tubos de vácuo seco. 
Adicione 100 a 200 ~ tLTE. Dê tempo para completar
- Ressuspensão. 6
- concentrações de DNA foram medidas usando um Hoefer Quanta 200
- Fluorómetro e 0,5 ng de diluições de DNA foram preparados para uso em PCR.
- Notas
- 1. Seja c u r e f u l t o r e m o v e o n l y t o p a q u o s s o l u t i n o n n t t o w h i t e b a 
n a t i n t e r f a c e. (Repita este passo até não mais nublado devido à presença de 
polissacarídeos ligados a PVP. Duas vezes geralmente é suficiente.
- 2. Em algumas plantas, um segundo procedimento de precipitação com sal pode ser 
útil.
- 3. Os grânulos de DNA devem agora ser visíveis em todos os tubos.
- 4. Quando dissolvido, algum DNA ainda pode ser ligeiramente viscoso, mas facilmente 
pipetado. 5. Os produtos neste ponto do protocolo geralmente não são amplificáveis 
por PCR.
- 6. Recomendado durante a noite a 4 ~Resultados e discussão
O PCR foi bem sucedido usando quantidades tão pequenas quanto 0,5 ng em uma 
reação de 25- ~ tL. Quando as quantidades foram aumentadas para além de 5 ng, as 
bandas de DNA tornaram-se menos distintas. Embora os metabolitos secundários possam 
não ser completamente removidos, o modelo de DNA foi puro o suficiente para permitir a 
amplificação por PCR. Além disso, tais rendimentos de DNA são suficientemente grandes 
para permitir tantas reações de 1,4 x 105PCR ou uma série de aplicações RFLP.
Este protocolo de extração de DNA é relativamente rápido, uma vez que uma ultra-
centrifugação prolongada não é necessária, como outrosprotocolos de VPP (Maliyakal, 
1992). O PVP, um polímero sólido com alto peso molecular e solúvel em água e 
quimicamente inerte, mostrou remover os polifenóis, mantendo um rendimento maior do 
que a polivinilpolipirrolidona (PVPP), um polímero de reticulação insolúvel. A PVP forma 
um complexo com polipolnóis através da ligação de hidrogênio, permitindo que sejam 
separados do DNA e reduzindo os níveis de polifenol no produto (Maliyakal, 1992). 
Embora a PVPP seja útil na melhoria da estabilidade das enzimas através da remoção de 
impurezas fenólicas (Sigma Chemical Co., 1993), produz significativamente menos DNA 
do que a PVP de folhas completamente expandidas.
A técnica de Lodhi et al. (1994) utilizando PVPP deu rendimentos de ADN muito baixos, 2 
a 3 ~ tg / g de tecido foliar, com folhas totalmente expandidas e a amplificação por PCR 
não foi consistentemente bem sucedida para todas as espécies de morangos. Mesmo 
quando as novas folhas em expansão e o material de lançamento foram examinados 
usando este protocolo, os rendimentos relatados por Lodhi et al. (1994) para outras 
plantas de baga (546-1130 ~ tg / g) não foram atingidas.
O método de Jobes et al. (1995) utilizando PVP, NaC1, LiC1 e SDS é demorado. 
Conseguimos obter resultados equivalentes com a exclusão da limpeza SDS e LiC1, que 
é usado para remoção de RNA
E para evitar que os ribonucleósidos residuais atuem como primers na reação térmica 
(Storts, 1993). Encontramos um tratamento prolongado com RNase de i hora suficiente 
para degradar o RNA em ribonucleósidos pequenos que não eram detectáveis por 
eletroforese em gel. Os ribonucleos permanentes seriam em quantidades muito pequenas 
e teriam que competir com grandes quantidades de primers adicionados na reação RAPD, 
tornando improvável a interferência do iniciador de ribonucleósidos.
Outros protocolos não foram bem sucedidos na remoção de componentes inibidores 
secundários em todas as espécies testadas, incluindo uma técnica de NaOH (Wang et al., 
1993), um protocolo desenvolvido para o milho (Dellaporta et al., 1984; Oard & Dronavalli, 
1992) Purificação de CsC1 (Richards et al., 1994), o método de El-Quik (Scheicher & 
Schuell) (LaRoche, 1992) e várias extrações de CTAB (Doyle & Doyle, 1990; Saghai-
Maroof et al., 1984; Davis et ai ., 1995)).
Ao contrário de todos os outros protocolos mencionados acima, nosso protocolo 
relativamente rápido e consistente produziu rendimentos de DNA muito aceitáveis a partir 
de tecido de folhas maduras extraídas para todas as espécies de Fragarias especificadas. 
Todo o DNA era estável e poderia ser amplificado por PCR, requerendo apenas 0,5 ng de 
DNA em reações de 25-tL, tanto antes quanto após 21 meses de armazenamento. Além 
disso, os perfis RAPD mostraram-se reprodutíveis para pelo menos cinco plantas 
examinadas de cada local para cada espécie. Esta técnica tem potencial para ser um 
protocolo efetivo para a extração de DNA usando tecido maduro para frutos de palha e, 
talvez, para outras espécies na família Rosaceae com polissacarídeos e polifenóis altos, 
quando o tecido de folha jovem não está disponível.