Aula de criopreservação Gabi

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GABRIELA RAMOS LEAL 
Doutoranda em Clínica e Reprodução Animal no 
programa de pós graduação da Universidade Federal 
Fluminense 
INTRODUÇÃO 
 CRIOPRESERVAÇÃO 
 
 Crio – Grego Kryos – gelado ou frio 
 Preservar – Conservar 
 
Conservação 
pelo 
congelamento 
 
 
Técnica de conservação em N2 que propicia a viabilidade das 
estruturas por longo período em estado de letargia, reversível após 
a descongelação. 
INTRODUÇÃO 
 REDUÇÃO DO METABOLISMO 
 
 Redução ou mesmo parada de todos os fenômenos 
biológicos(movimentos moleculares, reações 
químicas e atividades enzimáticas), a temperaturas 
inferiores a - 150 °C. 
APLICAÇÕES 
 
 •Manter e preservar a viabilidade dos embriões 
 
 •Aplicação em programas de TE e PIVE 
 
 •Preservar material genético 
 
 •Simplificar transporte e armazenamento 
 
 DOADORAS RECEPTORAS 
M
a
n
e
jo
 r
a
c
io
n
a
l 
HISTÓRICO 
 Embrião de camundongos Whittingham et al., 1972 
 
 Bovinos Wilmut & Rowson, 1973 
 
 Ovinos Willadsen et. al., 1976 
 
 Caprinos Bilton & Moore, 1977 
 
DANOS CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO 
 Lesões na membrana celular 
DANOS CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO 
 Desnaturação proteica 
DANOS CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO 
 Desnaturação do citoesqueleto 
DANOS CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO 
 Citoesqueleto 
 
 
CRIOPROTETORES 
 Proteção indispensável 
 Maior estabilidade a membrana celular 
 Toxicidade 
 
 INTRACELULARES 
 
Etilenoglicol, DMSO, glicerol, propanodiol, 
butanodiol,metanol 
 
 EXTRACELULARES 
 
Lactose, galactose, sacarose, PVP, manitol, trealose, 
BSA 
 
 
PRINCÍPIO DA CRIOPRESERVAÇÃO 
 
 Protocolo de CRIO 
 adequado 
 
 
 
 
 Impedir a cristalização da água Impedir a exposição das 
células 
TOXICIDADE 
Lento 
 
 
Rápido 
? 
MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO 
 
 
 CONGELAMENTO LENTO 
 
 
 
 VITRIFICAÇÃO 
 
 
 
 
MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO 
 CONGELAMENTO LENTO 
 
 
 
 Manutenção do equilíbrio entre as várias fontes de 
dano através do uso de uma baixa concentração de 
crioprotetores e controle da formação de gelo 
MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO 
 VITRIFICAÇÃO 
 
 Visa promover a desidratação do embrião pelo 
emprego de soluções osmóticas, e então induzir à 
redução drástica das temperaturas embrionárias , 
transpondo a etapa de cristalização 
 
Eliminação dos cristais de gelo 
 
Eliminação dos cristais de gelo 
Alta toxicidade 
MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO 
 VITRIFICAÇÃO 
 
 Viscosidade do meio 
 Volume utilizado 
 Alta velocidade 
 
VITRIFICAÇÃO 
 
 
40s 
 
 3m 
 
VITRIFICAÇÃO/ AQUECIMENTO 
 
MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO 
 Vitrificação X Congelamento lento: 
 
 Inconvenientes: 
 
 Toxicidade química de crioprotetor 
 
 Vantagens: 
 
 Não precisa de um congelador programável 
 
 Técnica muito rápida 
FATORES QUE INFLUENCIAM NO SUCESSO DA 
TÉCNICA 
 ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO 
EMBRIONÁRIO 
FATORES QUE INFLUENCIAM NO SUCESSO 
DA TÉCNICA 
 QUALIDADE DO EMBRIÃO 
FATORES QUE INFLUENCIAM NO SUCESSO 
DA TÉCNICA 
 Animal 
 
BUSCA PELA OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA 
 
 Conteúdo lipídico 
 
 
 
 Fluido da blastocele 
 
 
 Meios de cultivo 
 
 
 
 Integridade do citoesqueleto 
PARTICULARIDADE EM OÓCITOS 
 Volume/superfície 
 
 > conteúdo lipídico 
 
 Enrijecimento da ZP 
 
 Citoesqueleto mais sensível 
 
 Quebra das junções Gap 
PRINCIPAIS VANTAGENS 
 Otimização das biotecnologias reprodutivas. 
 
 Conservação de material genético: 
extinção/produção. 
 
 • Prevenção de perdas de animais vivos durante 
o transporte.