CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN

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BIOTECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO
Maria Eduarda Rocha 
BIOTECNOLOGIAS DE SÊMEN
Biotecnologia de sêmen diz respeito à qualquer processamento feito com o sêmen (resfriamento, congelação, diluição, sexagem), visando a conservação do material por maior tempo. 
SÊMEN (espermatozoides + parte líquida): suspensão celular contendo espermatozoides e fluido secretado pelas glândulas acessórias do trato genital masculino. 
- Porção celular: espermatozoides (formados no interior dos túbulos seminíferos)
- Porção fluida: plasma seminal (transportador e protetor dos espermatozoides)
PROCESSAMENTO DO SÊMEN:
- Manter viabilidade por mais tempo
- Varia com a espécie 
· Algumas espécies apresentam problemas ao congelamento (ex: suínos) 
- O processamento depende do que se pretende fazer com o sêmen 
COLETA DO SÊMEN:
- Técnica de acordo com a espécie (eletroejaculação, manipulação digital, vagina artificial, manipulação manual)
- Análises físicas (motilidade, vigor, turbilhonamento, concentração)
- Análises morfológicas
- OBS: não se processa sêmen de qualidade ruim! 
- Todo o material para trabalhar com processamento de sêmen deve estar aquecido.
O sêmen pode ser:
- FRESCO (mantido a 37°C – banho-maria)
· Pouco utilizado atualmente
- REFRIGERADO 
- CONGELADO (-196°C no nitrogênio líquido)
· Palhetas – 0,25 e 0,5 ml 
· Pellet – gelo seco (em ovinos e pesquisas) 
· Máquinas de congelar ou caixa isotérmica 
· O sêmen fica preservado por tempo indeterminado, desde que o nitrogênio líquido seja mantido 
Crescimento da IATF: 
Com o crescente aumento da biotecnologia de IATF, temos que trabalhar para garantir melhores processos, técnicas bem desenvolvidas e qualidade do sêmen, para que o sêmen dê resultado!
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN:
A criopreservação do sêmen consiste na utilização de substâncias específicas, como os crioprotetores, que possibilitam o armazenamento das doses de sêmen, por período indeterminado em nitrogênio líquido a -196ºC.
- Processo de tratamento em meios especiais e congelamento para uso posterior. 
- A criopreservação do sêmen busca a suspensão do metabolismo espermático e a manutenção de suas características por um período prolongado. 
- O objetivo é “pausar” o metabolismo do espermatozoide, para que seja preservado por muito tempo, pois é uma célula muito ativa e em pouco tempo reduz-se sua atividade. Ao congelar, esse metabolismo é suspendido e ao descongelar os espermatozoides retornam à ativa. 
- Como o próprio nome diz, a técnica tem o intuito de “preservar” o sêmen, pois é de suma importância a qualidade do mesmo para se obter bons percentuais de prenhez, uma vez que o uso de sêmen de má qualidade poderá prejudicar os resultados de todo o programa de inseminação artificial, por exemplo. 
O uso da criopreservação do sêmen depende da manutenção do potencial fertilizante dos espermatozoides (integridade e funcionalidade). 
- Flagelo (para garantir produção de ATP e motilidade) 
- Núcleo (para manter estável o armazenamento do DNA)
- Acrossomo (para manter a fecundação)
- Segmento equatorial (para que ocorra a ativação do ovócito)
O objetivo é manter a célula com a maior qualidade possível, para não perder a qualidade do sêmen. 
A criopreservação possibilita o armazenamento de células espermáticas por um longo prazo, e esse material genético pode ser utilizado em algumas biotécnicas reprodutivas.
USO DO SÊMEN CONGELADO:
- Comercialização nacional e internacional
- Biobancos (armazenamento de material genético)
- IA 
- Produção in vitro de embriões (FIV e ICSI) 
- Transferência de gametas (GIFT)
- Programa de transferência de embriões
- Pesquisa científica 
A demanda de sêmen criopreservado aumentou no Brasil nas últimas décadas, tornando-se essencial para a aplicação das biotécnicas reprodutivas, como inseminação artificial, transferência de embriões (TE) e fertilização “in vitro” (FIV), eliminando as limitações de tempo e distância.
A técnica de criopreservação permitiu que os espermatozoides fossem congelados, armazenados por tempo indeterminado e utilizados com sucesso na inseminação artificial.
Além do melhoramento genético, o congelamento de sêmen serve como banco de reserva genética para animais de alto padrão racial e comercial, propicia maior intercâmbio entre criatórios das mais variadas regiões e países. A criopreservação também contribui para minimizar perdas econômicas advindas da morte de reprodutores de alto valor comercial.
Tanto o congelamento, quanto o descongelamento devem ser feitos de forma correta. Se acertar no congelamento, mas errar no descongelamento, o espermatozoide também perderá qualidade! 
- A preservação das estruturas espermáticas ao congelamento/descongelamento é obtida através do uso de DILUIDORES e CRIOPROTETORES. 
- As curvas de resfriamento buscam minimizar os danos causados pelo choque térmico, formação de cristais de gelo e desidratação celular. Reduz-se gradativamente a temperatura de 37°C para -196°C (curva de resfriamento), pois se fosse de uma vez o espermatozoide sofreria choque térmico. 
DESVANTAGENS À CÉLULA: 
- Formação de cristais de gelo
- Injúrias oxidativas
- Alterações na membrana dos espermatozoides
- Lesões no DNA 
- Estresse osmótico
- Toxicidade dos crioprotetores
· Todos os crioprotetores são tóxicos para a célula, porém são necessários para manter o sêmen. 
- 50% de mortalidade celular 
· Ao realizar o congelamento, se perde em média 50% da viabilidade das células. 
· Apesar dos efeitos benéficos do crioprotetor, não existe uma técnica de criopreservação celular que permita 100% de sobrevivência após o congelamento e descongelamento.
Durante o processo de criopreservação, o espermatozoide passa por mudanças estruturais nas membranas, que resultam em diminuição da fertilidade (por morte celular e danos na capacidade funcional dos espermatozoides sobreviventes). A motilidade e estrutura dos espermatozoides são afetadas de diferentes formas. Todo processo de congelamento gera “sofrimento” à célula, mas quanto melhor a qualidade inicial do sêmen, menos alterações ele sofrerá.
DILUIÇÃO DO SÊMEN: 
- Vantagens da diluição: 
· Aumentar o volume do ejaculado
· Adicionar preservativos para manter a viabilidade do sêmen e sua qualidade 
· Grande número de fêmeas inseminadas a partir de um pequeno conteúdo 
· Atóxico 
· Pressão osmótica e acidez ideal 
· Baixo custo
· Fácil preparo 
Diluente ideal: 
- Deve fornecer energia e nutrientes aos espermatozoides: glicose e/ou frutose 
- Deve manter a pressão osmótica e o balanço eletrolítico, visto que o sêmen é isotônico aos fluidos corpóreos como sangue, plasma e leite (o responsável pela manutenção desta característica é citrato) 
- Deve compensar a diferença de pH devido à formação do ácido lático pela movimentação dos espermatozoides, apresentando, portanto, um pH de 6,5 a 6,9. 
- Deve inibir o crescimento de microorganismos, sendo para tal necessário a presença de antibióticos, como gentamicina ou tilosina. 
- Deve fornecer proteção contra o choque térmico e rápido resfriamento: gema de ovo ou leite. 
- Os diluentes podem ainda conter substâncias crioprotetoras, que diminuem a formação de cristais de gelo intracelulares, como o glicerol e DMSO. 
 
Componentes dos diluentes:
- Nutrição: citrato de sódio, gema de ovo, leite, fosfatos, glicídios, TRIS, EDTA 
- Antibióticos
- Crioprotetores: glicerol, metanol, etilenoglicol, dimetilsulfóxido
→ Citrato gema de ovo: 
· No preparo desse diluidor utiliza-se basicamente citrato de sódio, glicerol e gema de ovo. 
→ Meios à base de leite:
· Meios à base de leite são particularmente populares nos EUA devido principalmente a sua facilidade de preparo e baixo custo. 
· Principal desvantagem: opacificação do meio, que dificulta observação microscópica individual dos espermatozoides (os glóbulos de gordura presente no leite deixam o meio opticamente opaco). 
→ TRIS – gema de ovo: 
· É o meio mais utilizado comercialmente devido aos ótimos resultados obtidos quanto a congelabilidade do sêmen e posterior motilidade ao descongelamento, frente aosoutros meios diluidores. 
→ Meios diluidores comerciais: 
· Congelação de sêmen a campo ou em laboratórios poucos tecnificados 
· Entre os principais meios comerciais, destacam-se: 
- Plus x 
- Biladyl/Triladyl 
- Europhos 
- Continental 
- Biociphus
- Instant 
→ Gema de ovo: 
- Atua na membrana, protege contra o choque térmico durante o resfriamento (inibe a perda de fosfolipídeos da membrana). 15-30% 
- Problemas de exportação: receio de contaminação (bactérias, Mycoplasma)
→ Água de coco:
- Fitormônio que previne a ação da fosfolipase A no ejaculado 
- Principal substância: ácido acético
- Ideal: osmolaridade de 320 mOsm/kg e pH 6,8 
Exemplos de diluidores de sêmen comerciais (prontos para uso):
De forma geral, o diluente tem que ter uma fonte de energia, citrato, antibiótico, gema de ovo ou leite (evitar choque térmico) e o crioprotetor. Ou seja, realiza-se uma mistura para preservar o sêmen da melhor maneira possível. OBS: Em equinos usa-se mais o leite, e em bovinos a gema de ovo.
PASSOS DA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN: 
1. Diluição
· A primeira etapa da criopreservação espermática é a diluição do sêmen em meios específicos para garantia da manutenção do movimento celular. Sua composição influencia na sobrevivência espermática durante o processamento e na refrigeração ou congelação, fator crucial para a preservação da integridade espermática e habilidade de fertilização dos espermatozoides bovinos
· Diluentes 
· Seus componentes devem garantir nutrição, proteção, pH (6,5 a 6,9) e osmolaridade adequados (300 mOsm), e atividade antibacteriana 
· Logo após a coleta, o sêmen deve ser diluído em meio de manutenção para dar suporte até o processamento de criopreservação (transporte)
· A diluição inicial deve ser feita para dar um suporte para o sêmen.
· Diluição na proporção 1:1 (sêmen:diluente) 
· Crioprotetores 
· Classificados como externos e internos de acordo com a capacidade de penetração da membrana plasmática 
· Devem provocar a desidratação celular, proteger e estabilizar a membrana plasmática, e evitar a formação de cristais de gelo 
· O que destrói uma célula são os CRISTAIS DE GELO.
· Crioprotetores internos:
· São moléculas pequenas que atravessam a membrana plasmática 
· Glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida
· O glicerol é o crioprotetor interno mais utilizado em quase todas as espécies
· Atuam nos meios intra e extracelulares 
· Possuem o ponto de congelação muito mais baixo do que o da água 
· Aumentam a osmolaridade do meio extracelular e promovem a saída de água da célula (até recuperar volume inicial) 
· Evitando o acúmulo de água e a formação de cristais de gelo intracelular 
· Crioprotetores externos: 
· São moléculas grandes e não conseguem atravessar a membrana plasmática 
· Proteínas (da gema do ovo – LDL – e do leite desnatado)
· Açúcares (frutose, glicose, manose, rafinose ou trealose) 
· Polímeros sintéticos (polivinilpirrolidona e metilcelulose)
· Agem como solutos ou colóides, pois contribuem para as propriedades osmóticas e afetam o movimento de água para dentro e para fora da célula 
· Toxicidade dos crioprotetores
· Crioprotetores são usados em menor concentração, pois são tóxicos
· Crioprotetores são tóxicos ao espermatozoide, pois causam injúrias bioquímicas e danos osmóticos 
· Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetores desestabilizam os lipossomos, dissolvendo os fosfolipídeos, enquanto em concentrações moderadas previnem os efeitos prejudiciais da desidratação 
· Bovinos: tris-gema e glicerol são os que apresentam os melhores resultados 
· Equinos: dimetilformamida é o mais usado 
· Caprinos: leite desnatado + glicose + glicerol 
· Aditivos
· EDTA 0,1%
· Quela cálcio e magnésio que danificariam a célula no resfriamento 
· Criopreservação -> ROS (radical livre superóxido e peróxido de hidrogênio) 
· O EDTA pode ser utilizado ou não, não faz muita diferença.
· Antibióticos 
· Penicilina (1000 UI/ml)
· Estreptomicina (1 mg/ml) 
2. Resfriamento
· O resfriamento lento abaixo de 0°C promove maior saída de água da célula, podendo levar a desidratação celular intensa
· O resfriamento rápido é insuficiente pra permitir a saída 
· A taxa de resfriamento ideal resulta em suficiente retirada de água intracelular, formando pequenos cristais de gelo intracelulares e sobrevivência após o descongelamento 
· O resfriamento não pode ser rápido demais, e nem lento demais
· O ponto mais melindroso de um resfriamento é entre 19° até 8°C (principal entrave)
· Se rápida = muitas lesões por choque térmico 
· Essas lesões causam movimento circular ou retrógrado, rápida perda de motilidade, lesão em acrossoma e dano a membrana plasmática
· Ideal = resfriamento lento + período de equilíbrio por 5 horas 
· Fase de equilíbrio 
· Possibilita a troca de lipídeos entre a membrana e o diluente: aumenta a resistência no congelamento e descongelamento
· A temperatura não pode variar 4-5°C 
· Manter na geladeira em banho-maria num recipiente 
· Quanto mais tempo deixar em equilíbrio, melhor será a qualidade do sêmen
· Indica-se 5h, mas deixar pelo menos 2h 
· 4-5h: 64-71% de fertilidade 
· Consiste em deixar o espermatozoide interagir com o meio
· Choque térmico:
· Alterações irreversíveis nos padrões normais de motilidade (movimento circular ou retrógrado)
· Perda rápida de motilidade 
· Danos no metabolismo da membrana plasmática e do acrossoma
· Mudanças na bioquímica e no funcionamento das células espermáticas, incluindo:
· Diminuição da taxa da glicólise, da respiração celular e da frutólise 
· Aumento na degeneração do ácido desoxirribonucléico
· Liberação de material intracelular 
3. Envase do sêmen 
· Palhetas plásticas de 0,5 ml ou 0,25 ml 
· Envase das palhetas:
· Métodos automáticos: envasador próprio para palheta, de origem francesa -> alto custo, sendo viável apenas em centrais de congelamento onde o volume de sêmen processado é muito grande 
· Bomba a vácuo
· Método manual: pipetas e seringas, envasando uma palheta por vez (mais utilizado à campo, onde a quantidade de sêmen a ser envasado é pequena) 
· Na palheta deve conter:
· Nome e número de registro do touro 
· Partida do sêmen ou data da colheita 
· Nome ou código do estabelecimento
4. Congelamento (criopreservação celular)
· Processo físico-químico
· O sucesso da congelação espermática é baseado no bloqueio dos processos metabólicos das células espermáticas
· Troca de água e calor entre os meios 
· Mudanças de estado físico
· Pontos importantes:
· Desidratação celular 
· Evitar formação de grandes cristais de gelo intracelular
· Da temperatura ambiente para -5°C 
· NÃO CONGELAMENTO
· SUPER RESFRIAMENTO
· De -5°C para -15°C 
· CONGELAMENTO EXTRACELULAR
· SUPER RESFRIAMENTO INTRACELULAR
· Formação de gelo de água pura 
· Aumenta a concentração de soluto
· Aumenta o gradiente osmótico
· Iguala concentração dos meios intra e extracelular 
· Desidratação celular 
· Zona crítica do congelamento: -15°C para -65°C 
· Taxa de resfriamento:
· Taxa lenta – efeito solução
· Taxa rápida – efeito cristais de gelo intracelular 
· Necessidade de curva ótima 
· Efeito dos cristais de gelo:
· Quantidade de cristais pequenos não promovem lesões 
· T (-85°C até -45°C) – descongelamento 
· Fenômeno da recristalização migratória 
· Cristais grandes – lesões mecânicas 
· Descongelamento rápido ( > 100°C/min)
· Curva de resfriamento/congelamento:
· Curva de resfriamento 5°C/1h e 15 min (0,25°C/min) 
· Curva de congelamento até -80°C (-15°C/min)
· Curva de congelamento até -120°C (-10°C/min) 
· Imersão em nitrogênio líquido (-196°C)
· Armazenagem
5. Armazenamento
· Em botijões de nitrogênio líquido (-196°C) 
· As palhetas são colocadas em raques identificadas 
· O nível do nitrogênio líquido é verificado e mantido periodicamente (15 dias)
· Armazenamento por tempo ilimitado 
· Quando congelados da forma correta, os materiais podem ficar armazenados por muitos anos
6. Descongelamento
· Retira do nitrogênio líquido e coloca em banho-maria 
· Em banho-maria a37°C por 30 segundos
· Cortar uma das extremidades da palheta para retirada do sêmen 
· Velocidade de descongelamento:
· Depende da velocidade de congelamento
· Congelamento rápido -> descongelamento rápido
· Congelamento lento -> descongelamento lento (choque osmótico)
· Descongelamento em palhetas:
· 0,5 ml: 37°C/30 segundos
· 0,25 ml: 37°C/15 segundos
TESTES PARA AVALIAR VIABILIDADE DO SÊMEN: 
- TTR (teste de termo-resistência): 
· O TTR tem o intuito de avaliar o comportamento do sêmen após ser descongelado, e garantir que quando colocado dentro da fêmea terá capacidade de fecundar
· Rápido – 46°C/30 min 
· Lento – 38°C/5 horas 
· Estressado – lento + refrigerador (5°C/4h)
· APROVADO -> maior ou igual de 15% de motilidade progressiva 
- ASMA (automated sperm morphometry analyses):
· Sistema computadorizado realizadas por esfregaços corados (1.000 x)
· As imagens destinadas a avaliação da morfometria da cabeça dos espermatozoides são avaliadas pelo software 
· Concentração de 200 milhões de espermatozoides/ml 
· Existem padrões para cada espécie 
· Espermatozoides são mais delgados quando subférteis 
- Testes de viabilidade de membrana:
· Teste hiposmótico:
· Em uma solução hiposmótica (150 mOsm) a água entra no espermatozoide na tentativa de se alcançar o equilíbrio osmótico
· Capacidade do flagelo de se dobrar na presença de uma solução hiposmótica indica que a membrana está íntegra e funcional 
· O teste hiposmótico é um teste simples, prático e confiável 
· Live/Dead (Invitrogen): 
· SYBR 14 e iodeto de propídio
· PI cora células com danos de membrana 
· O Live/Dead é um kit para teste de viabilidade de membrana utilizado após congelamento/descongelamento
· FITC-PSA:
· Para avaliar a integridade do acrossomo de células espermáticas, através da capacidade de ligação a glicoproteínas específicas 
· Teste utilizado para avaliar crioinjúrias após congelamento/descongelamento
· Fluorescein Isothiocyanate-conjugated-Pisium sativum agglutinin
SELEÇÃO DO MACHO DOADOR → COLETA DE SÊMEN → AVALIAÇÃO SEMINAL → CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO → AVALIAÇÃO SEMINAL
PARTICULARIDADES DAS ESPÉCIES: 
- Bovinos
· Refrigeração:
· A refrigeração é pouco utilizada 
· O resfriamento deve ser gradativo 
· Diluidor (citrato-gema)
· 5°C – 3 dias (dependendo da qualidade do sêmen)
· Sêmen para uso rápido, não é para comercialização
· Geralmente feito na própria fazenda
· Congelação:
· Método mais utilizado
· Diluentes – citrato gema, lactose gema, tris gema, água de coco 
· Crioprotetor: glicerol 
· Palhetas de 0,25 ou 0,5 ml 
· Diluições: sêmen e diluidor na mesma temperatura, gota a gota com homogeneização constante 
· Diluições:
· Sêmen e diluidor na mesma temperatura 
· Gota a gota com homogeneização constante 
· 1ª diluição em banho-maria 
· Transfere para a geladeira (4-5°C)
· Diluições seriadas a cada 15 minutos 
· Terminada a diluição: tempo de equilíbrio de 1 hora 
· Envazar o sêmen
· Congelar 
· Cálculo de diluição:
· A quantidade de diluente colocado para primeira diluição deve ser a mesma quantidade do sêmen que foi coletado (ex: 10 ml de sêmen – 10 ml de diluente)
· 20 ml (10 ml de diluente + 10 ml de sêmen)
· A quantidade de espermatozoides na palheta (dose na palheta) não é padronizada, então é variável
· Protocolos de congelação:
· Vários
· O congelamento das palhetas de sêmen pode ser realizado através de sistema automatizado, onde a curva de resfriamento é controlada eletronicamente ou pelo sistema convencional em que a curva de resfriamento não é controlada 
· Automática 
· Máquina de congelamento – precisão 
· 0,25°C/min até 5°C (1,5 horas)
· -15°C/min (-5°C até -80°C)
· -10°C/min até -120°C 
· Mergulha no nitrogênio líquido
· Manual
· Caixa de isopor 
· Palheta em plataforma 
· Técnica de Jondet 
· Diluições em banho-maria e geladeira 
· Sêmen a 4°C em geladeira 
· 4°C até -15°C = 1°C/min 
· -15°C até -30°C = 1°C/3 min 
· -30°C até -69°C = 1°C/2 min 
· Estabiliza a 3 cm acima N2/15 min 
· Mergulha no N2 líquido a -196°C 
· O sêmen congelado só pode ser comercializado se estiver dentro dos padrões:
· É fundamental o uso de métodos adequados de coleta, armazenamento e de criopreservação do sêmen bovino, para garantir a qualidade e obter maiores índices de fertilidade nos rebanhos. Para que a criopreservação ocorra de forma eficiente é necessário que a diluição seja realizada de forma correta, o que resultará num sêmen de melhor qualidade e na maior quantidade de doses inseminantes, permitindo a inseminação de maior número de fêmeas, proporcionando o melhoramento genético e tornando o processo mais lucrativo. Utilizar sêmen com qualidade é imprescindível para a fertilidade e sucesso da reprodução de bovinos
- Equinos:
· Refrigeração:
· Mais utilizado e o tempo de viabilidade depende do diluidor 
· Diluidores – base de leite desnatado, gema de ovo, Kenney, E-Z-Mixin, INRA 82, Berlinger, Dimitropulos 
· Proteção de membranas – glicose e gelatina 
· Taxa de refrigeração = 1°C/min 
· -0,05°C/min entre 19 e 8°C – onde há maiores lesões de membranas 
· Sucesso do uso do sêmen resfriado:
· Taxa de resfriamento
· Temperatura de armazenamento
· Composição do diluidor 
· Qualidade do sêmen a fresco
· Manuseio do sêmen 
· Duração: 
· Diluente a base de leite desnatado (Kenney) – 24 a 70 horas 
· Glicina/gema de ovo (Dimitropoulos) – 24 horas a 5°C 
· Dose:
· 500 x 106 sptz viáveis – 20 a 40 ml 
· Congelação:
· Resultado fraco pós-descongelação
· Depende muito do sêmen, principalmente membranas 
· Centrifugar sêmen – tirar plasma seminal 
· Diluidores: lactose/gema/EDTA, Kenney, INRA 82, Nagase, etc
· Crioprotetor: etilenoglicol, DMSO, etc 
· Palhetas de 0,5 ou 0,25 ml (melhor curva)
· Dose:
· 200 x 106 sptz viáveis 
· Técnica:
· Resfriamento do sêmen
· Palhetas 3 a 6 cm do nível do nitrogênio líquido por 10 a 20 minutos 
· Mergulha no nitrogênio 
· Ideal uso de máquina de congelar 
· Restrições na utilização da técnica se devem à baixos resultados e técnicas de congelação
· Padrões de qualidade: 
- Suínos:
· Não se faz congelamento, pois é a espécie que apresenta o espermatozoide mais sensível, e até mesmo na refrigeração, o resfriamento não é muito (entre 15 a 18°C)
· Refrigeração: 
· Método mais utilizado para suínos 
· Espermatozoide é muito sensível – acrossomo 
· Temperatura utilizada: 15 a 18°C 
· Duração: 3 a 7 dias 
· Diluentes mais utilizados:
· IVT, BTS, Kiew, Androrep, MR-A 
· Temperaturas mais baixas – alta lesão de acrossomo 
· Cálculo da dose para suínos:
Para o cálculo de suínos, a motilidade deve estar contida na multiplicação. Nas outras espécies também pode ser usado, mas em suínos tem que ser usado!
· Diluição:
· O diluente deve ser adicionado no sêmen de forma lenta para que as células espermáticas se adaptem ao novo ambiente 
· Após diluição, homogeiniza-se a solução e fraciona as doses 
· Manter as doses em temperatura de 24°C por 2 horas 
· Após acondicionar na conservadora de sêmen a 15 a 18°C 
· Congelação:
· Alta sensibilidade ao congelamento e descongelamento 
· Diferença na bicamada lipídica da membrana do espermatozoide 
· Menor porcentagem de moléculas de colesterol 
· Distribuição de assimetria do colesterol na membrana 
· Glicerol – melhor crioprotetor – 3-4%
· Manter células por 2 horas com plasma seminal 
· Diluidores – BL1, Kiew
· Velocidade de congelamento deve ser 30°C/min
· Velocidade de descongelamento de 120°C/min 
· Congelamento:
· Palhetas de 0,5 ml 
· Peletização em gelo seco 
· Armazena a -196°C
· Existe o congelamento para suínos, mas não é usado.
· Padrões de qualidade:
- Ovinos e caprinos:
· Refrigeração:
· Duração por tempo curto
· Deve-se fazer diluição devido a alta concentração celular e o baixo volume 
· Diluente: a base de leite desnatado, tris, água de coco
· Dose = 200 x 106 espermatozoides/ml
· Viabilidade:
· 15°C – 12 horas 
· 4°C – 24 horas 
· Congelação:
· Retirar plasma seminal 
· Diluidor: leite desnatado, glicina/gema ou gema/tris e glicerol 
· Palhetas de 0,5 ml ou 0,25 ml· Dose = 200 x 106 espermatozoides/ml 
· Congelamento:
· Amostras diluídas e levadas a 4°C 
· Vapor do nitrogênio líquido por apenas 9 min a 2 cm da lâmina 
· Mergulhar no N2 
· Pellet – em gelo seco 
· Armazenar a -196°C
· Padrão de qualidade: 
- Cães:
· Refrigeração:
· Utilizado algum tempo pós coleta ou em local diferente da mesma 
· Deve-se diluir o sêmen 
· Utiliza todas as frações coletadas 
· Meios mais utilizados 
· Leite desnatado e glicose (meio Kenney)
· Tris-glicose 
· Tris-gema
· Pode ser transportado em garrafa térmica 
· Duração = 4°C – 2 a 5 dias 
· Congelamento:
· Transporte a longa distância 
· Cai muito a viabilidade 
· Inseminações devem ser feitas intrauterinas 
· Diluentes:
· Técnicas muito variadas
· Tris/frutose, água de coco/gema de ovo/glicerol, etc 
· Palhetas de 0,5 ml 
· Melhor crioprotetor: etilenoglicol 
· Padrão de qualidade: 
- Gatos:
· Semelhante a outras espécies de carnívoros, com grande variação de protocolos 
· Resfriamento a 5°C – gema de ovo 
· Diluentes de sêmen: 
· TES e TRIS, isolados ou conjunto adicionados de frutose ou glicose 
· 10 a 20% de gema de ovo 
· Crioprotetor – 3% a 4% de glicerol 
· Antibióticos – penicilina, estreptomicina ou amicacina 
· Novos diluentes:
· MP-50: rafinose, glicose, lactose, citrato de sódio e potássio, EDTA, gema de ovo, leite em pó desnatado 
· Meios de cultivo – Hepes, Dubelco e Eagle 
· Congelamento:
· Palhetas 
· Processo de congelamento causa danos às membranas plasmáticas e acrossomais 
· Período de equilíbrio a 5°C por 30 a 40 minutos 
· Congelação vapor de nitrogênio líquido, com imersão subsequente das palhetas 
· Os resultados pós-descongelação são bastante variáveis: < 30% a > 70% de espermatozoides móveis 
CONSIDERAÇÕES FINAIS: 
· A manutenção da fertilidade do sêmen depende essencialmente da presença de crioprotetores capazes de preservar a integridade da membrana plasmática, retardando o processo de capacitação dos espermatozoides 
· As técnicas de criopreservação convencional e automatizada para o sêmen apresentam resultados semelhantes pós-descongelação para motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas 
· Há uma grande variedade nos meios diluentes para criopreservação de sêmen, mas ainda é necessário aperfeiçoar os já existentes e criar novos meios capazes de promover maior proteção às células espermáticas dos danos causados pela criopreservação 
· Para minimizar os efeitos deletérios da criopreservação vêm sendo testados, através das décadas, inúmeros diluentes e crioprotetores, além de aditivos para proteger as células e fornecer substratos para sua manutenção durante e após a congelação
· Com o objetivo de conservar a capacidade fecundante do espermatozoide, a congelação proporciona um estado de quiescência ao mesmo tempo reduzindo seu metabolismo e, consequentemente, diminuindo os gastos energéticos e da produção de catabólitos, contribuindo assim para a preservação celular, além de aumentar o número de fêmeas fecundadas com um único ejaculado. Contudo, o ciclo da congelação/descongelação resulta em diminuição da fertilidade quando comparada àquela do sêmen a fresco.