Inativação Viral de Hemoderivados

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Inativação Viral de Hemoderivados
Hemoderivados são medicamentos biológicos obtidos a partir do fracionamento industrial do plasma humano, submetidos aos processos de industrialização e normatização que lhe conferem qualidade, estabilidade, atividade e especificidade (ANVISA,2000). A indústria de hemoderivados tem passado por diversas fases desde seu inicio dos anos 40. Com o aparecimento da AIDS e a descoberta da sua profilaxia, introduz-se métodos de inativação viral e a obrigação de a indústria cumprir com padrões de qualidade cada vez mais rígidos. Destacamos aqui os concentrados de Imunoglobulinas G para uso endovenoso, a IgGIV, que apresenta uma crescente demanda devido a suas aplicações terapêuticas. A classe das globulinas são obtidas a partir do Plasma Fresco Congelado (PFC) proveniente de uma bolsa de sangue total por centrifugação, transferido em circuito fechado para uma bolsa satélite, devendo ser congelado a – 20°C até 8 horas após a coleta. 
A inativação de agente patogênicos(vírus, bactérias e outros microorganismos) do sangue e seus derivados, é necessária para prevenir contravenções, seja por causa da janela imunológica, dos possíveis erros laboratoriais e também por causa da possível presença de muitos vírus ainda não identificados ou não reconhecidos durantes os exames sorológicos. A inativação se baseia em desnaturar somente a estrutura molecular desses agentes, preservando todas as porções do anticorpo responsáveis pela propriedade e atividade biológica, o Fc (liga-se a outros componentes do sistema imunológico, disparando uma resposta contra o antígeno).
A finalidade desse processo é extinguir a capacidade de infecção para conferir segurança aos medicamentos hemoderivados, e os processos são divididos em métodos físicos, tais como calor, desnaturação e irradiação, métodos químicos, como solvente/detergente e fotoquímico e métodos imunológicos. Temos também os métodos de remoção tais como filtração, adsorção (especifica ou não) e partição (cromatografia de afinidade). A seleção do método a ser empregado para inativação e/ou remoção viral depende do tamanho e da labilidade das partículas a serem preparados, do método de purificação que são usados pelos diferentes produtores, natureza e título viral. (WHO, 2004).
A temperatura (calor) é um dos mais importantes métodos para o controle do crescimento para eliminar os microrganismos. Acima da temperatura ideal de crescimento o calor vai promover a desnaturação de proteínas estruturais e enzimas, levando a perda da integridade celular à morte, por isso, para a não desnaturação e perda das proteínas desejadas, é acrescentado substancias estabilizantes para preservar tal estrutura. 
A inativação por pasteurização é realizada sob temperatura de mais ou menos 60ºC, durante 10 a 11 horas em fluxo contínuo. Essa técnica é geralmente empregada em presença de substâncias estabilizadoras que protegem a solução protéica, no caso, baixas concentrações de caprilato de sódio em presença ou não de N-acetil triptofanato, adicionados previamente a filtração esterilizante. 
Já o processo por calor a seco é utilizado em fatores da coagulação e consiste em submeter o produto liofilizado a temperatura de 80ºC de alguns minutos até 72 horas, sob condições especiais e utilizando substancias estabilizadoras para proteger a molécula.
No calor úmido, temos um tratamento intermediário do produto, submetido a vácuo, em presença de vapor e pressão. A inativação por esse processo está diretamente ligada com a temperatura de 60º a 80ºC e pressão entre 1190 a 1375mBar (milibar) por cerca de 10horas. Nessa técnica ocorre uma eliminação gradual da umidade devido aos diferentes níveis de temperatura, auxiliando na estabilidade do produto. 
Temos também a irradiação de raios UV-A, capaz de anular diversos vírus e bactérias. Essa tecnologia aprovada pela ANVISA apesar de promissora tem suas limitações. Ela só pode ser usada nas plaquetas e no plasma, deixando de fora as hemácias. Isso ocorre porque, para a irradiação UV-A ser eficaz, é necessária uma baixa densidade do sangue, fazendo com que haja uma melhor penetração dos raios. Como o concentrado de hemácias é mais denso e mais escuro, dificulta a penetração, em contrapartida as plaquetas e o plasma apresentam cores claras. Essa irradiação tem como objetivo prevenir a Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro Pós-Transfusional (DECH-AT). No qual o sangue transfusionado é o enxerto e o paciente que recebeu a transfusão é o hospedeiro. Esse método é importante porque, no sangue não irradiado, os Linfócitos T presentes tanto no concentrado de hemácias quanto no de plaquetas passam a se proliferar gerando uma resposta imunológica contra as células do receptor. Não existe cura para a doença uma vez que se inicia, porem é possível preveni-la antes da transfusão.
	Nos procedimentos de caráter químico temos a utilização de solvente/detergente, um dos procedimentos mais amplamente utilizados, principalmente para imunoglobulinas e fatores da coagulação. Possui substancias eficazes para inativar vírus com envelope lipídico, tendo grande vantagem por seu uso em grande quantidade de plasma. Estas substâncias são agregadas ao produto sob condições especiais na presença de outras substâncias estabilizadoras, por exemplo, óleo, que são removidas por meio de cromatografia ou ultrafiltração ou precipitação proteica com sílica gel modificada.
	O método fotoquímico usa corantes fotossensíveis e luz visível que, combinados na presença de oxigênio, produzem espécies citotóxicas que esterilizam o sangue e seus subprodutos. Além de promover inativação de microorganismos tais como bactérias, fungos, leveduras e vírus (incluindo HIV) através de luz visível com um fotossensibilizador apropriado, esse método é usado tambem para tratamento alternativo de baixo custo para infecções localizadas, lesões virais tais como acnes, e lesões cutâneas fungicas, assim como no tratamento de água potável, bem como na desintoxicação antimicrobiana de alimentos.
	O tratamento com baixo pH (em torno de 4), pode inativar certos vírus, porem depende das condições administradas pelos seus produtores, tais como o valor do pH, o tempo e temperatura do procedimento, composição da solução, dentre outros. Contudo, caso haja exposição prolongada desse material a este pH ácido, pode ocorrer indução significante no numero de agregados no produto, fazendo com que aumentem.
	Após todos esse processos, temos obrigatoriamente procedimentos para remoção dos viros e restos que não são interessantes para a composição final. A remoção pode ser realizada através de filtração, adsorção (específica ou não) e por cromatografia de afinidade. Desses vamos ressaltar a nanofiltração que, no momento, é considerado um dos mais efetivos métodos de remoção viral. Éé especialmente efetiva para a remoção de vírus não envelopados que são resistentes aos métodos de inativação viral como aquecimento e tratamento por solvente/detergente. Consiste em filtrar a solução protéica através de membranas de poros muito pequenos de 35 e/ou 15nm sob condições especiais, no qual retém os vírus de tamanho maior que os poros utilizados. A associação dessa técnica combinada a outros métodos de inativação/remoção contribui para o aumento da segurança do produto final.
O Polietileno Glicol (PEG)tem uma característica muito proeminente relacionada à preservação da estrutura molecular de IgG: não tem ação desnaturante contra IgG. Para chegar ao resultado simétrico dois tipos de álcool foram utilizados no estudo: PEG foi utilizada para purificação bruta,e o etanol foi usado na última etapa do processo. O concentrado obtido de IgG era potencialmente eficaz para uso em qualquer situação que requer neutralização direta de antígenos, incluindo a transposição da barreira placentária .Gama-globulinas como IgM e IgA, com peso molecular perto IgG, não foram encontrados no experimento.
A inclusão de uma precipitação de etanol entra a separação de imunoglobulina mostrou vantagens em relação a eliminação do agenteprecipitante por ultrafiltração, foi maior na técnica de ultrafiltração combinada do PEG-etanol em comparação com outra técnica.A introdução de uma etapa de precipitação do álcool etílico na concentração final 25% também traz vantagens para o processo, porque é considerado um passo na redução viral.
Dois processos de inativação viral foram introduzidos na metodologia. O primeiro foi a ação do ácido caprílico 30mm em pH 5.1, que têm uma ação detergente sobre a membrana lipídica de vírus envelopadas. A segunda metodologia para inativação viral foi a ação de Polissorbato e tri-butil mistura de fosfato (solvente/detergente), que também atua no envelope lipídico viral. Poode-se também introduzir um passo de redução viral por nanofiltração, que podem eliminar vírus não-envelopado como Parvovírus B19 e HVA.
Depois de ser submetido a alta temperatura por muitas horas,não foram observadas alterações nas características físicas da solução em comparação com a mesma solução não sujeitada a mesma temperatura e tempo.A pureza da solução IV IgG foi confirmada por eletroforese em gel, começando quando o plasma foi comparado com a solução obtida.
A tecnologia desenvolvida pelos autores do trabalho mostrou níveis de alto rendimento na produção de IgG intacta. O rendimento foi de 3.3 g/litros de plasma e não houve perda na recuperação de fatores de coagulação e da albumina. O método tem potencial para oferecer maior produtividade do que o método de Cohn-Oncley, porque o tempo de precipitação das frações obtidas pelo etanol é superior em frações obtidas usando polietileno glicol. O estudo permite a introdução de várias tecnologias paralelas, a fim de melhorar o processo de purificação do produto acabado, permite também o desenvolvimento de uma outra etapa de inactivação viral. O método descrito pode ajudar para desenvolver e melhorar suas técnicas de produção ou fracionamento de IgG IV concentrado, com moléculas intactas e preservada subclasses, aumentando a gama de indicações e também aumentando as chances de sucesso terapêutico. 
Trabalho baseado no artigo...