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Campinas DENILCE JOSEFINA NICOLA AÇÃO DA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E SANITÁRIA NO PROGRAMA DE CONTROLE DE BRUCELOSE BOVINA E SUA IMPORTÂNCIA NA SAÚDE PÚBLICA Campinas 2017 AÇÃO DA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E SANITÁRIA NO PROGRAMA DE CONTROLE DE BRUCELOSE BOVINA E SUA IMPORTÂNCIA NA SAÚDE PÚBLICA Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade Anhanguera Educacional, como requisito parcial para a obtenção do título de graduado em Medicina Veterinária. Orientador: CAROLINA SOARES SOEIRO, VANDERLÉIA RIBEIRO PRADO DENILCE JOSEFINA NICOLA DENILCE JOSEFINA NICOLA AÇÃO DA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E SANITÁRIA NO PROGRAMA DE CONTROLE DE BRUCELOSE BOVINA E SUA IMPORTÂNCIA NA SAÚDE PÚBLICA Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade Anhanguera Educacional, como requisito parcial para a obtenção do título de graduado em Medicina Veterinária. Aprovado em: __/__/____ BANCA EXAMINADORA Prof(ª). LUCIANA BONATO DE CARVALHO Prof(ª). VANDERLÉIA RIBEIRO PRADO Prof(ª).CAROLINA SOARES SOEIRO RESUMO A Brucelose Bovina é uma doença causada pela bactéria Brucella abortus, e acomete tanto animais domésticos quanto seres humanos. Está disseminada pelo mundo todo, estando erradicada apenas na Suíça e Holanda, sendo indispensáveis assim, as boas práticas de manejo para evitar sua proliferação e contágio. É uma doença que causa grandes prejuízos econômicos na criação de bovinos e está em processo de eliminação desde 1955, onde sua notificação é obrigatória. Devido sua importância para a saúde pública, fica evidente a necessidade de um órgão fiscalizador que vise a prevenção, diagnóstico e eliminação dos animais soro positivos. Palavra-chave: Brucelose Bovina; Bactéria; Zoonose; Prevenção. ABSTRACT Bovine brucellosis is a disease caused by Brucella abortus bacterium, and affects both domestic animals as humans. This disease is disseminated all over the world, being eradicated only in Switzerland and Netherlands, so indispensable, good management practices to prevent their proliferation and contagion. It is a disease that causes great economic losses in cattle and it has been removed since 1955, when the compulsorily notification was required. Due to its importance to public health, it is evident the need for a supervisory bodies to prevention, diagnosis and disposal of animals test positives confirmed. Key-words: Bovine Brucellosis; Bacterium; Zoonosis; Prevention. LISTA DE TABELAS TABELA 1 – Desinfetantes usados para o controle da Brucelose Bovina ............... 32 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 13 2 A BRUCELOSE BOVINA – DEFINIÇÃO E ETIOLOGIA ................................... 15 3 EPIDEMIOLOGIA...............................................................................................17 4 MECANISMOS DE TRANSMISSÃO..................................................................22 5 PATOGENIA.......................................................................................................23 6 SINAIS CLÍNICOS E LESÕES...........................................................................24 7 DIAGNÓSTICO...................................................................................................25 8 PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DE BRUCELOSE.............................................................................................................28 9 DESTINO DOS ANIMAIS REAGENTES POSITIVOS........................................30 10 MÉTODOS DE DESINFECÇÃO.........................................................................31 11 LEGISLAÇÃO E FISCALIZAÇÃO......................................................................33 12 A IMPORTÂNCIA DO CONTROLE DA BRUCELOSE PARA A SAÚDE PÚBLICA...................................................................................................................36 13 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS................................................40 REFERÊNCIAS..........................................................................................................41 13 1. INTRODUÇÃO De caráter infecto contagiosa, crônica, zoonótica e prejudicial à criação de bovinos, a Brucelose Bovina, que é causada pela bactéria Brucella abortus, é uma das maiores preocupações dos proprietários de rebanhos de produção pela sua virulência, por causar abortos e pelas eutanásias dos soropositivos. De acordo com a Organização Mundial da Saúde Animal (OIE), a doença é considerada importante sob o ponto de vista socioeconômico e sanitário no mercado interno e principalmente quando falamos em exportação, onde os produtos de origem animal são rigidamente fiscalizados (OIE, 2003). Neste presente trabalho iremos revisar conceitos, de forma objetiva, visando à compreensão do leitor para a importância das boas práticas de manejo a fim de evitar a disseminação da doença, ocorrendo assim, grande perda econômica. E ainda, se tratando de uma enfermidade contagiosa onde sua bactéria contamina tanto humanos quanto animais, provocando diversos prejuízos econômicos e sanitários, tornam-se assim, uma evidente preocupação para a saúde pública. Fica clara a importância da conscientização de produtores e consumidores sobre os mecanismos de transmissão, fatores de risco e controle da doença, visto que o diagnóstico é difícil de ser realizado em grandes rebanhos, sendo assim necessário o conhecimento das normas de profilaxia, diagnóstico e desencadear as medidas responsáveis e cabíveis nos casos de soro positivo e praticar as boas práticas de manejo, a fim de evitar a disseminação da doença supramencionada. Portanto, nota-se a importância de uma revisão bibliográfica que compreenda a epidemiologia e patologia da referida doença, bem como sua disposição para a conscientização tanto de produtores quanto consumidores das boas práticas de manejo dos animais a fim de evitar sua disseminação. 14 1.1 Objetivos do Trabalho Geral: Analisar os benefícios para a saúde pública na prevenção e controle da Brucelose Bovina realizada pela Vigilância Epidemiológica e Sanitária. Específicos: 1. Demonstrar a atuação da Vigilância Epidemiológica e Sanitária no Brasil e sua importância. 2. Estudar a definição, etiologia, epidemiologia, patogenia, sinais clínicos e diagnósticos da Brucelose Bovina tanto no animal quanto no ser humano. 3. Conhecer o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose. 15 2. A BRUCELOSE BOVINA: DEFINIÇÃO E ETIOLOGIA A Brucelose é uma zoonose presente em diversos países, inclusive países desenvolvidos e causa sérios prejuízos econômicos e problemas sanitários não só para as propriedades produtoras de bovinos de corte e leite, mas também para os estados e países. Por causar abortos, esterilidade, nascimentos de fetos natimortos e bezerros fracos provoca diminuição na produção de produtos de origem animal,gerando perdas econômicas que podem se agravar em regiões endêmicas (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2006). A descoberta da Brucelose ocorreu primeiro em humanos na República de Malta, em 1850, após a observação da infecção de muitos malteses. Instalaram-se então, medidas de controle para diminuir a disseminação da doença, porém elas não chegaram a ser aplicadas. Como é uma doença de caráter mediterrâneo, foi facilmente disseminada para outros países, tornando-se um problema universal. Em 1887, Sir David Bruce, médico inglês, identificou o primeiro agente etiológico da Brucelose, a Brucella melitenses depois de isolá-la no baço de um soldado. Logo após, o médico maltês Themistocles Zammit descobriu que a doença era uma zoonose após observar a sua transmissão ao homem através do leite de cabras contaminadas. Para tentar controlar a Brucelose, em 1930 foi descoberto que a pasteurização do leite eliminava a carga bacteriana e consequentemente, evitava a transmissão da doença para os seres humanos. Porém, na República de Malta a doença só conseguiu ser erradicada em 2005 (PEREIRA, 2015). A Brucelose é uma doença infectocontagiosa bacteriana causada por bactérias do gênero Brucella, pertencente a classe das Proteobacteria. São Gram-negativas, intracelulares facultativas, não esporuladas e imóveis, apresentando-se na forma de bastonetes. É considerado um microrganismo aeróbio e se multiplica em temperaturas entre 20 a 40º e em pH ideal de 6.6 a 7.4. Pode apresentar-se de forma crônica, aguda e localizada e acomete várias espécies de animais, podendo inclusive infectar o homem. Em animais da espécie bovina, a principal bactéria causadora da Brucelose é a Brucella abortus, responsável pelo alto índice de abortos em vacas acometidas no terço final da gestação pois possui predileção pelo sistema reprodutor (ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, 2014; PESSEGUEIRO P., BARATA C., CORREIA J., 2003). 16 Existem diversos agentes etiológicos causadores da Brucelose que acometem várias espécies de animais, inclusive cachorros. Além da Brucella abortus, outras espécies como a Brucella suis, Brucella melitenses e Brucella ovis também podem causar Brucelose nos bovinos caso eles estejam em contato direto com outras espécies de animais, como suínos no caso da B. suis, ovinos e caprinos no caso da B. melitenses e ovinos no caso da B. ovis (LAGE A.P., et al, 2008). A mais virulenta e patogênica ao homem do gênero Brucella spp é a B. melitenses que infecta não somente os seus hospedeiros definitivos, mas pode infectar outras espécies que se tornam reservatórios da doença. Das Brucella spp que acometem os bovinos, a única que não acomete o homem é a B. ovis. As Brucella spp são, em sua maioria, específicas ao seu hospedeiro definitivo, mas infecções cruzadas acontecem com grande frequência (PEREIRA, L. B. 2015). 17 3. EPIDEMIOLOGIA Das diversas doenças zoonóticas, a Brucelose é a mais disseminada no mundo. Ela pode ser transmitida por contato direto ou indireto do animal ao homem e além de causar prejuízos à saúde, causa sérios prejuízos para a produção de alimentos de origem animal. (PACHECO, et al 2008) relata que “em vacas a Brucelose provoca redução na produção leiteira entre 20 a 25%; abortos de 20 a 30%; mortalidade de bezerros (de 0 a 12 meses) de 20 a 25%; esterilidade de 10 a 20% e perda de peso de 10 a 15%”. Por ser uma doença de caráter universal, diversos países entraram com medidas para erradicação da doença. As medidas de combate são a vacinação, a certificação de propriedades livres da Brucelose com sua verificação feita rotineiramente com testes indiretos, controle de animais que entram e saem da propriedade e vigilância sanitária específica. Em diversos países, como os situados ao norte da Europa, a Brucelose foi erradicada após anos de controle e combate rigoroso da doença. Outros países situados na Europa, como França e Irlanda, ainda não obtiveram o certificado de livres da Brucelose, mas se encontram em estágio avançado da erradicação. No continente americano, os Estados Unidos se encontram livres da doença desde 2000, enquanto o México, país endêmico para a Brucelose, enfrenta diversos desafios na erradicação da doença, onde a espécie de maior prevalência é a Brucella melitenses, mais patogênica ao ser humano. No Paraguai, testes realizados indicaram que a presença da Brucelose permaneceu constante. Já na Argentina, a Brucelose está presente na maioria dos animais domésticos gerando perdas anuais em torno de 60 milhões de dólares (POESTER, et al, 2009). 3.1 Situação Histórica no Brasil Com a doença crescendo no País, o governo começou a se mobilizar no combate a Bucelose. Em 1944 estabeleceu-se um decreto de lei nº 6922 que determinava a vacinação e a identificação dos bovinos vacinados. Já em 1954 foram propostas 4 medidas de controle inspiradas em medidas de controle americanas, que se baseavam em sorodiagnóstico, eutanásia de animais positivos e repetição do teste em animais não positivos em 30 dias; vacinação de bezerras e separação do rebanho 18 de animais positivos, sem eutanásia dos mesmos; vacinação das bezerras com idade entre 6 a 8 meses; e vacinação de adultos, quando necessário. Em 1958 uma campanha nacional de combate a Brucelose foi instalada, juntando comissões estaduais, municipais integradas com representantes de agropecuárias, empresários e comerciantes de carne e leite, associações médicas, Secretárias de Saúde Pública (SSP) e meios de comunicação (PAULIN L.; NETO F., 2002). A Resolução nº 438 foi criada no mesmo ano e regulamenta a importação e exportação de animais. Os animais importados para fins reprodutivos devem possuir certificado negativo para Brucelose e as provas devem ser repetidas nas fronteiras e os animais positivos eutanasiados sem ressarcimento do proprietário. Assim como ficou regulamentado o controle de trânsito interno de animais, onde é permitido o trânsito de animais positivos somente para abatedouros. Os demais deveriam ser comprovados negativos para Brucelose. Em 1965 foi instaurado pelo Ministério de Agricultura um novo sistema de vacinação, que não foi levado adiante. Alguns anos depois, em 1976, foi criada a Portaria nº 23 que apresenta uma série de medidas para controle e profilaxia da Brucelose e tornando obrigatória a notificação de casos positivos e eutanásia dos mesmos e vacinação das fêmeas antes do seu estágio reprodutivo, entre os 3 a 8 meses de idade, normas estas vigentes até os dias atuais (PAULIN L.; NETO F., 2002). Por fim, em 2001 No Brasil, o Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) criou o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) após avaliar que as medidas de controle e erradicação adotadas até então não eram efetivas. O programa inclui condutas prescritas por organismos internacionais e é adaptável para os diferentes Estados do País (POESTER, et al, 2009). O Brasil possui o maior rebanho bovino no mundo. Por isso, é uma doença endêmica no País, presente em todos os Estados do Brasil. Entretanto, existem diferenças da prevalência da doença entre os Estados, sendo mais crítica na região Sudeste. Em meados de 1990, o Estado de Minas Gerais entrou com um programa de vacinação obrigatória em bezerras. Além de Minas Gerais, o único Estado que possuía um programa de vacinação era o Rio Grande do Sul. Até que em 2001 foi 19 criado o PNCEBT e a vacinação de bezerras se tornou obrigatória em todo oPaís (LAGE, et al 2008). Poucos são os estudos epidemiológicos sobre a doença em todo o território brasileiro. Estudos realizados entre 2001 e 2004 nos Estados da BA, ES, GO, MG, MT, PR, SC, RJ, RS, SP, SE, TO e DF indicaram que a situação é diferente entre os Estados e existe uma tendência no crescimento da doença na região Norte e Centro- Oeste do País, principalmente em regiões tradicionais na produção de produtos de origem animal. O Mato Grosso apresentou aumento da prevalência da doença comparado ao último diagnóstico realizado em 1975, enquanto outros Estados, como Minas Gerais, tiveram significante diminuição da prevalência da doença e Santa Catarina teve baixa prevalência confirmada, podendo implementar medidas de erradicação da doença (LAGE, et al 2008). Em São Paulo, dados de 2009 indicavam um rebanho de aproximadamente 12.790.383 bovinos e 71.358 bubalinos e a agropecuária contribui em 1,5% no PIB do Estado. Observando os dados, é importante ressaltar que um problema sanitário afeta agressivamente na lucratividade dos produtores e no PIB do Estado, causando perdas na produção e restringindo mercados. O Estado de São Paulo não possui um programa de combate próprio contra a Brucelose e a situação da doença não está bem definida. Porém, nos últimos anos foi observado diminuição na prevalência da doença, ainda considerada elevada se comparada a outras regiões. Isso se deve à introdução de animais no rebanho sem quarentena e sem controle sanitário prévio (DIAS, et al 2009). Assim, pode-se afirmar que a doença está presente em todo o território nacional, apresentando-se de forma heterogênea entre os Estados, apesar de alguns Estados possuírem regiões homogêneas, passíveis de uma implementação da erradicação da doença. Dados de vacinação e sorodiagnóstico indicam que a vacinação não é feita de forma efetiva no Brasil, o que agrava a situação e dificulta o controle e erradicação da doença no País (PAULIN & NETO, 2002). 20 3.2 Perdas Econômicas Uma vaca com Brucelose é capaz de eliminar a bactéria de forma a contaminar um rebanho inteiro de uma região, seja através de restos fetais, placentas, etc., seja por corrimentos do parto ou pelo leite, no caso de bezerros durante a amamentação. O macho elimina através do sêmen, podendo contaminar vacas no cio na hora do coito (MATHIAS, 2008). Por causar perdas econômicas severas, regiões endêmicas da doença enfrentam barreiras ao comércio de produtos de origem animal para outras regiões, Estados e Países, gerando perdas na indústria, tais como: condenação de leite e carne, diminuição no preço de carne, leite e derivados, desvalorização no mercado externo e elevados custos em programas de controle, erradicação e pesquisas da doença (PACHECO, et al 2008). Sabendo dos prejuízos econômicos causados pela doença, Países desenvolvidos adotaram medidas de erradicação a mais de 20 anos, com sucesso em sua grande maioria e mantendo a doença controlada com diminuição da ocorrência em outros. Os Estados Unidos conseguiram diminuir a incidência da doença de 5% para 0,1% em bovinos e entre os anos de 1947 a 1969 diminuíram de 6.321 para 231 os casos em humanos. Entretanto no Brasil, no Estado de São Paulo, as perdas econômicas entre os anos 1965 a 1967 somaram um valor de U$158.407,00 (PACHECO, et al 2008). Para evitar perdas tão grandes na economia, medidas preventivas e de controle foram instauradas em 2001 pelo MAPA, que preconiza a vacinação de bezerras entre três e oito meses de vida, antes de entrarem em seu estágio reprodutivo, para evitar a disseminação da doença na hora do coito. As medidas sanitárias são baseadas no diagnóstico da doença e na vacinação das bezerras, para reduzir o contato como agente etiológico e aumentar a resistência nos rebanhos (PACHECO, et al 2008). 3.3 Resistência do Agente Etiológico A Brucella spp é sensível ao calor intenso e ambientes ácidos e são eliminadas em contato com desinfetantes comuns, como formaldeídos a 2%, cloro ativo a 2,5%, compostos fenólicos a 2,5% e permanganato de potássio (1:5000), quando deixados no ambiente por 15 minutos. O álcool 70% é extremamente destrutivo a bactéria e o 21 carbonato de cálcio (1:10) as destrói em 30 minutos (ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, 2014) No leite, a bactéria permanece presente na dependência da temperatura e do pH do meio, além da presença de outros microrganismos que podem inibir a sua multiplicação, podendo ser encontrada no leite até 90 dias depois de retirado da vaca. A refrigeração retarda a multiplicação, mas a Brucella spp se mantém viável até em temperaturas congelantes. Porém, processos de pasteurização, que elevam a temperatura em 75 a 80ºC e os métodos de esterilização eliminam completamente a bactéria (ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, 2014). Na carne pode-se manter viável por meses, mesmo com a acidificação muscular, refrigeração ou congelamento, que pouco a afetam. Portanto, além do calor na hora do preparo do alimento, a única forma da Brucella spp ser eliminada da carne é em pH abaixo de 4 (ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, 2014). As bactérias podem persistir em secreções uterinas, glândula mamária, medula óssea, células do sistema fagocitário e no liquido seminal. Por isso, é obrigatório o descarte adequado de vísceras e tecidos que apresentam um grande número da bactéria ou evitar que carcaças e vísceras se contaminem durante o abate (ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, 2014). 22 4. MECANISMOS DE TRANSMISSÃO Diferentemente de outras bactérias que causam graves doenças, a B. abortus tem alta taxa de sobrevida em ambientes naturais. Sendo assim, as pastagens, a alimentação, e lagos contaminados são locais mais propícios à infecção da bactéria, pois a contaminação se dá geralmente por contato direto com os locais e as secreções infectadas (PAULIN, 2003). O agente penetra no organismo através das mucosas orofaringeanas. Infecta principalmente o trato reprodutivo, gastrintestinal e urinário, além dos linfonodos. A transmissão em vacas vazias não é tão elevada quanto às vacas prenhes. Estas acabam na maioria das vezes se tornando somente portadoras da doença. Já as prenhes, tem maior possibilidade de se tornar crônica, devido as maiores quantidades de secreções no útero e trato reprodutivo, e também nos linfonodos (PAULIN, 2003). A transmissão pode dar início já na fase fetal se as mães estiverem infectadas, também na fase de amamentação, através do leite contaminado, e pelo sistema gastrointestinal dos bezerros, sendo o agente etiológico é eliminado nas fezes (PAULIN, 2003). As transmissões aumentam em locais onde são feitos os partos, devido a grande quantidade de secreções que acompanham, e também pela placenta. O ambiente, então, fica contaminado e sujeito a transmitir a brucela aos animais que ali estão (PAULIN, 2003). Outra possibilidade de transmissão seria através da monta natural, mas estudos não consideram de elevada importância, pois a microbiota da mucosa vaginal exerce uma proteção contra a invasão da bactéria (PAULIN, 2003). 23 5. PATOGENIA Uma característica da B. abortus é a de se colocar dentro ou fora de uma célula, de acordo com a sua vontade. O fato de não se colocar dentro das células, faz com que os antibióticos não a atinja, assim sendo, seu combate depende apenas dos anticorpos polimorfo nucleares (PMN) e macrófagos da imunidade inata. As que não são fagocitadas chegam aos linfonodos, onde se multiplicam e invadem a corrente sanguínea. E então na correntesanguínea, algumas são fagocitadas por PMN’s e Macrófagos circulantes, sendo então levadas à outros órgãos, mas permanecem e se multiplicam dentro dos vacúolos destes anticorpos (CASTRO H.; GONZALES S.; PRAT M., 2005). O quadro clínico demonstrado nos bovinos é o aborto. Sua característica zoonótica é febre e a bactéria se localiza em diferentes tecidos , sendo estes os da musculatura, nervoso, ósseo, etc. (CASTRO H.; GONZALES S.; PRAT M., 2005). 24 6. SINAIS CLÍNICOS E LESÕES A Brucelose Bovina pode provocar sinais inflamatórios em tecidos e órgãos que, embora em aparências consideradas normais, podem apresentar sinais de necrose. Dependendo da imunidade do animal, pode-se ou não formar um granuloma no local da infecção (SOLA M.; FREITAS F.; SENA E; MESQUITA A., 2014). Alguns sinais podem aparecer com o tempo, como retenção de placenta ou nascimento de bezerros fracos, infertilidade e esterilidade. Lesões como metrite, endometrite crônica, artrites, espondilites, bursites, orquites e abcessos fistulados, ou não, na cernelha (nos equinos) ocorrem frequentemente. (SOLA M.; FREITAS F.; SENA E; MESQUITA A., 2014). 25 7. DIAGNÓSTICO O diagnóstico efetivo é feito isolando o agente através de hemogramas, mielogramas ou amostras de tecidos. Para se ter um resultado provável, pode-se usar métodos sorológicos. Existem dois métodos de diagnóstico, o método direto, bacteriológico, e o indireto, sorológico (CASTRO H.; GONZALES S.; PRAT M., 2005). 7.1 Métodos diretos A cultura e antibiograma é um dos métodos bacteriológicos utilizado para isolar o agente, em ágar e leva em torno de 30 dias para obter-se o resultado. Entretanto, existe um método através de automação ou semi-automação que é mais rápido, levando menos de 7 dias (CASTRO H.; GONZALES S.; PRAT M., 2005). De acordo com o grau da doença no animal, quanto maior a demora em realizar a cultura através do hemograma, mais difícil se torna a chance do resultado ser positivo, devendo ser a coleta realizada através dos linfonodos (CASTRO H.; GONZALES S.; PRAT M., 2005). Já o método ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) permite que se encontre a bactéria em diversos tecidos. O diagnóstico direto também pode ser realizado através de PCR (Proteína C Reativa) e imunoflorescencia direta (CASTRO H.; GONZALES S.; PRAT M., 2005). 7.2 Métodos indiretos Os métodos sorológicos são mais utilizados pois a dificuldade de isolar o agente nos métodos diretos faz com que os resultados nos exames sorológicos sejam mais confiáveis. Os mais utilizados, de acordo com Castro; Hugo (2005) são: Soroaglutinação Lenta em Tubo de Wright (SAT): utiliza-se o antígeno de suspensão de B. abortus 1119-3 a 4,5% e anticorpos IgM, IgG1 e IgG2. Prova de Aglutinação com e sem 2-mercaptuetanol (2-ME): emprega o tratamento prévio de 2-ME como agente redutor, que inativa os anticorpos IgM. Em seguida, realizam-se as provas de aglutinação em conjunto, com dois tubos, com e sem tratamento do soro com 2-ME. A diferença dos valores entre os dois tubos 26 indica o valor de IgM. Também detecta IgG. Reação de Huddleson, reação de aglutinação em placas: investiga-se as quantidades decrescentes do soro investigado com o antígeno, observando-se a presença ou não de aglutinação. Avalia anticorpos Igm, IgG1, IgG2 e IgA. Prova de Rosa de Bengala: é uma prova rápida em placa, onde coloca-se uma quantidade de soro com a mesma quantidade de antígenos e observa se há aglutinações. Utiliza-se um corante chamado Rosa de Bengala para ajustar o pH ácido, em suspensão de B. abortus a 8,5%. Avalia anticorpos Igm e IgG1. Antígeno Tamponado em Placa (BPA): utiliza a mesma base metodológica da anterior, na medida 8/3 de soro com antígeno, observando se há aglutinações. Avalia anticorpos IgG1 e IgM. Prova de Coombs: aglutinação feita em tubos, permitindo detectar anticorpos completos e incompletos. Avalia anticorpos aglutinantes e anti-aglutinantes do tipo IgG. Fixação de Complemento (prova específica de referência mundial): incuba- se soro, antígeno e complemento. Em seguida, agrega-se um sistema hemolítico e compara-se as hemólises em 0%, 25%, 50%, 75% E 100%. Avalia anticorpos do tipo IgG1. Imunofluorescência indireta: incubam-se diluições crescentes de soro sobre uma marca de Brucela, agregando o anticorpo com uma substância fluorescente e observando o resultado em um microscópio de fluorescência. Avalia anticorpos aglutinantes e não aglutinantes. ELISA: técnica sensível e eficaz que emprega pouca quantidade de soro e dá ótimos resultados. Há o ELISA indireto (ELISA I) e o ELISA competitivo (ELISA C). Avalia anticorpos aglutinantes e não aglutinantes. Polarização de Fluorescência (FPA): utiliza como material o sangue completo ou o leite. Os anticorpos mudam a velocidade de rotação da molécula em contato com o antígeno. Já a prova de Imunodifusão em Agar (IDAG), é uma técnica de dupla função em géis do soro a um soro-controle observando as reações. Os anticorpos detectados são IgM e IgG (CASTRO H.; GONZALES S.; PRAT M., 2005). 27 8. PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DE BRUCELOSE Foi instituído em 2001 pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), o programa Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) em todo o território nacional, com o intuito de controlar essas enfermidades, bem como de estabelecer um programa de vacinação e certificação para propriedades que estivessem livres de focos das doenças, motivando proprietários a aderirem a esse programa nacional voluntariamente, desenvolvendo estratégias de ação de controle sanitário de bovinos e bubalinos. (PNCEBT, 2006). Para garantir que o programa fosse bem desenvolvido, teve-se como objetivo a vacinação de bezerras e de animais que são destinados à reprodução, bem como o treinamento de profissionais qualificados, médicos veterinários, laboratórios, sendo necessária a padronização dos métodos de diagnostico, bem como integrar as ações do serviço de vigilância sanitária e o serviço de inspeção de produtos de origem animal, identificando que apesar do PNCEBT ser um programa federal ele se expande para um nível onde a preocupação está desde os produtores, sejam grandes ou não, toda a comunidade, a indústria, os órgãos municiais e estaduais e seus setores de fiscalização, sendo assim, esse programa visa de uma forma bem ampla agrupar toda a cadeia de produção e todos os que estão envolvidos nela com a finalidade de um bem maior, a saúde pública. (PNCEBT, 2006). 8.1 Propostas técnicas adotadas do PNCEBT Com a obrigatoriedade do cumprimento do programa, fez-se necessário estabelecer um prazo para que todos os estados aderissem à obrigatoriedade da vacinação de bezerras entre 3 e 8 meses contra a brucelose. Estipulou-se também que somente o médico veterinário poderia ser o responsável em aplicar essa vacina, sendo que o mesmo deveria se cadastrar no serviço de defesa sanitária de seu estado, e o objetivo era de que até o ano de 2010 pelo menos 80% das fêmeas tivessem sido vacinadas na idade devida, para assim poder fazer a projeção para um futuro com a erradicação da brucelose. (PNCEBT, 2006). 28 Outra medida adotada foi a certificação de propriedades que através de grande controle sanitário, bemcomo o envolvimento de órgãos de fiscalização cujas determinações são inclusive aceitas pela Organização Mundial de Saúde (OIE), voluntariamente testarão os rebanhos candidatos à certificação, sendo que para os animais reagentes positivos se aplicará o sacrifício. Esse teste ocorrerá até que três testes realizados não apresentem nenhum animal positivo, dando então seguimento ao processo da obtenção do certificado de livre da doença, sendo que todo esse processo pode durar nove meses. O proprietário após a obtenção da certificação precisará todos os anos refazer os testes para manter sua certificação. Esse controle é de extrema importância para manter a sanidade do rebanho, levando em consideração que novos animais são adquiridos, fazendo-se necessário um controle tão rígido. (PNCEBT, 2006). Além do certificado de propriedade livre de brucelose, há também a emissão de outro certificado, o de propriedades monitoradas para brucelose e tuberculose, isso se dá pelo fato que na criação extensiva de gados de corte os rebanhos são muito grandes tornando difícil o controle individual de cada animal. Sendo assim, as análises de testes diagnósticos são feitas por amostragem do rebanho e só será certificado quando não houver nenhuma amostra de resultado positivo. Porém, se houver algum animal positivo, o diagnostico deverá ser feito em todos, descartando novamente animais reagentes positivos. Isso garante principalmente aos produtores para a indústria e consumidores do mercado internacional, que seu produto tem garantia de sanidade. (PNCEBT, 2006). Durante todo o processo de controle e erradicação da brucelose, desde os protocolos de vacinação, bem como todos os testes feitos para obtenção das duas certificações, é obrigatório a participação do médico veterinário, sendo ele o responsável credenciado e treinado para realizar as atividades envolvidas. Não somente o profissional concursado dos órgãos públicos pode participar do processo, há também a participação de profissionais do setor privado que deverão também passar por treinamento oferecido pelas instituições oficiais reconhecidos pelo MAPA e somente após obter o treinamento para métodos de diagnósticos e controle de 29 brucelose e tuberculose é que poderá trabalhar nesse processo de certificação, levando em conta a importância desse profissional quanto ao cuidado do manuseio das vacinas vivas e atenuadas, sendo necessário receita emitida pelo médico que deverá estar também cadastrado junto ao serviço veterinário oficial do Estado que estiver exercendo. (PNCEBT, 2006). 30 9. DESTINO DOS ANIMAIS REAGENTES POSITIVOS 9.1 Eliminação dos animais Os animais positivos a Brucelose bovina devem ser marcados com a letra P do lado direito do rosto, afastados dos outros animais, retirados da produção leiteira e abatidos no prazo de 30 dias. Os animais positivos para Brucelose devem ser levados a abatedouros sanitários acompanhados de GTA (Guia de Trânsito Animal) e em anexo o resultado atestando positivo para Brucelose. Outra forma de abate, fora dos abatedouros sanitários, é a eutanásia realizada na fazenda onde os animais são criados (PNCEBT 2006) Os animais positivos devem ser sacrificados já dentro da cova, de forma rápida e com o mínimo de contaminação já que se trata de uma zoonose. A cova deve ser fora de área de risco de contaminação evidente, como em terrenos acidentados, perto de poços e rios ou em uma cova rasa. Os animais enterrados deverão ser cobertos com 2 metros de terra para evitar o risco de erosão ou que outros animais escavem o local em que eles estão enterrados. (PNCEBT 2006). As duas formas de abate devem ser acompanhadas pelo serviço oficial de defesa sanitária animal. (PNCEBT 2006). 31 10. MÉTODOS DE DESINFECÇÃO Os agentes da brucelose podem sobreviver durante meses em ambientes que não contenham a desinfecção necessária para sua eliminação. A eliminação dos agentes pode ser feita em currais, estábulos e em outras instalações. Existem três fatores que ajudam na sua eliminação: instalações que possuam boa incidência solar, umidade baixa e alta temperatura. Instalações que possuam cama, excesso de esterco e entre outros, devem ser totalmente limpas e esse resíduo poderá ser incinerado ou também passar por uma desinfecção com desinfetantes (PNCEBT 2006). Em caso de contaminação em instrumentos usado na necropsia e roupas dos funcionários, recomenda-se fervura por 30 minutos ou lavagem com uso de desinfetantes químicos. Veículos devem ser desinfetados através do rodolúvio. A área onde ficam os animais infectados que tiveram crias ou sofreram abortos deve ser desinfetada periodicamente com Hidróxido de cálcio (cal), realizando o espalhamento do cal pelo solo e após, revolvendo a terra para que ocorra a mistura do cal. A terra deverá ser compactada novamente para criar uma condição anaeróbica para a eliminação do agente infeccioso (PNCEBT 2006). O Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (2006), esclarece quais são os desinfetantes usados para o controle da Brucelose Bovina. 32 Tabela 1: Desinfetantes usados para controle da Brucelose Bovina. DESINFETANTES CONCENTRAÇÃO TEMPO DE EXPOSIÇÃO TEMPERATURA DE UTILIZAÇÃO USO INDICADO CAL 15% 1h Ambiente Solo CRESÓIS 5% 1h Ambiente Instalações FENOL 1% 1h 36ºC Instalações e Utensílios FORMOL 5% 1h Ambiente Instalações Utensílios Roupas HIPOCLORITO DE SÓDIO 2,5% 1h Ambiente Instalações e Utensílios HIPOCLORITO DE CÁLCIO 2,5% 1h Ambiente Instalações e Utensílios SODA CÁUSTICA 2 a 3% 3h 60ºC Instalações e Utensílios 33 11. LEGISLAÇÃO E FISCALIZAÇÃO Neste tópico iremos abordar algumas das legislações vigentes que buscam fundamentar e fiscalizar o controle e erradicação da Brucelose. 11.1 Para a Legislação Federal a) O Conselho Federal de Medicina Veterinária em sua RESOLUÇÃO CFMV Nº 714, de 20 de junho de 2002 – Dispõe sobre procedimentos e métodos de eutanásia em animais, e das providências: Art. 1 ° Instituir normas reguladoras de procedimentos relativos a eutanásia em animais. Art. 2° A eutanásia deve ser indicada quando o bem estar do animal estiver ameaçado, sendo um meio de eliminar a dor, stress ou sofrimento do animal, os quais não podem ser aliviados por meio de analgésicos , sedativos entre outros tratamentos, ou, ainda quando o animal constitui ameaça à saúde publica ou animal, ou for objeto de pesquisa b) O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento em sua INSTRUÇÃO DE SERVIÇO DDA nº 21 /01 – Comercialização e utilização da vacina contra brucelose: 1- A vacinação de bovinos e bubalinos contra brucelose obedecerá as normas estabelecidas no Regulamento Técnico do PNCEBT, devendo ser efetuada sob responsabilidade do médico veterinário cadastrado no serviço de defesa oficial da Unidade Federativa. No ato de cadastramento do médico veterinário, deverá registrar- se seu nome completo, número de registro no Conselho de Medicina Veterinária, endereço e telefone para contato. 2- A comercialização de vacina contra brucelose será feita exclusivamente por estabelecimentos comerciais devidamenteregistrados e autorizados e será fiscalizada pelo serviço de defesa oficial. I- A aquisição da vacina só será permitida mediante apresentação de receita própria, emitida por médico veterinário cadastrado no serviço de defesa oficial da Unidade Federativa. 34 II- A receita do médico veterinário ficará retida na casa comercial e deverá conter nome completo e assinatura do mesmo, registro no Conselho de Medicina Veterinária, número de cadastro no serviço de defesa oficial da Unidade Federativa, número de doses a serem adquiridas, local e data. c) O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento em sua INSTRUÇÃO NORMATIVA SDA nº 30 de 07 de junho de 2006 – Normas de habilitação de médicos veterinários para execução de atividades do PNCEBT: Art. 1o Estabelecer as normas de habilitação de médicos veterinários que atuam no setor privado, para fins de execução de atividades previstas no Regulamento Técnico do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal - PNCEBT, referentes à realização de testes diagnósticos de brucelose e tuberculose, encaminhamento de amostras para laboratórios credenciados e participação no processo de certificação de estabelecimentos de criação livres ou monitorados para brucelose e tuberculose bovina e bubalina, na forma dos Anexos a presente Instrução Normativa. Parágrafo único. E vedada à habilitação de médicos veterinários do serviço oficial de defesa sanitária animal. 11.2 Legislação Estadual a) Divisão de Defesa Sanitária Animal em sua INSTRUÇÃO DE SERVIÇO 009/2008 – DDSA -Campanha de vacinação contra a brucelose bovina. É obrigatória a comprovação da vacinação contra a brucelose bovina, com a vacina viva liofilizada, elaborada com amostra 19 de Brucella abortus (B19), de todas as fêmeas bovinas e bubalinas até 8 meses de idade, entre os dias 1º e 30 de maio e 1º e 30 de novembro; A vacinação de todas as fêmeas bovinas e bubalinas que tenham até 8 meses de idade deve ser comprovada, durante o período citado acima, pelo proprietário dos animais junto a uma Unidade Veterinária da Secretaria de Estado da Agricultura, levando uma via do “atestado de vacinação”, emitido por um Médico Veterinário cadastrado junto a Secretaria da Agriucultura e Abastecimento. 35 b) O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento em sua PORTARIA N° 11 de 26 de janeiro de 2004- Exclui o estado de santa Catarina da obrigatoriedade de vacinação das fêmeas bovinas e bubalinas contra a brucelose. Art. 1º Excluir o Estado de Santa Catarina da obrigatoriedade de vacinação das fêmeas bovinas e bubalinas contra a brucelose. Art. 2º As ações a serem desenvolvidas nas áreas em processo de erradicação deverão ser definidas em ato normativo específico do Departamento de Defesa Animal - DDA. c) INSTRUÇÃO NORMATIVA SDA n ° 33 de 24 de agosto de 2007- estabelece as condições para vacinação de fêmeas bovinas contra a brucelose, utilizando vacina não indutora da formação de anticorpos aglutinantes, amostra RB51. Art. 1º Estabelecer as condições para a vacinação de fêmeas bovinas contra brucelose, utilizando vacina não indutora da formação de anticorpos aglutinantes, amostra RB51. Art. 2º A vacinação de fêmeas bovinas utilizando a vacina contra brucelose não indutora da formação de anticorpos aglutinantes, amostra RB51, será recomendada nos seguintes casos: I - idade superior a 8 (oito) meses e que não foram vacinadas com a amostra B19 entre 3 e 8 meses de idade; II - adultas, não reagentes aos testes diagnósticos, em estabelecimentos de criação com focos de brucelose d) INSTRUÇÃO NORMATIVA N° 6,de 8 de janeiro de 2004 – Aprova o regulamento técnico do programa nacional de controle e erradicação da brucelose e tuberculose animal. Considerando a necessidade de padronizar e garantir a qualidade dos instrumentos e das ações profiláticas, de diagnóstico, de saneamento de rebanhos e de vigilância sanitária ativa, relacionadas ao combate à brucelose e à tuberculose, Considerando a necessidade de definir o papel dos órgãos públicos de defesa e inspeção sanitária animal no combate a essas enfermidades e sua integração com os pecuaristas, com instituições de ensino ou pesquisa, com médicos veterinários que atuam no setor privado e com laboratórios não pertencentes à rede do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, e o que consta do Processo 21000.012771/2003-71, resolve: Art. 1º Aprovar o Regulamento Técnico do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal. Art. 2º 36 Subdelegar ao Diretor do Departamento de Defesa Animal competência, no que couber, para baixar atos complementares a este Regulamento. 37 12. A IMPORTÂNCIA DO CONTROLE DA BRUCELOSE PARA A SAÚDE PÚBLICA A Brucelose é uma doença infecto contagiosa com impacto mundial na saúde animal gerando milhões em perdas econômicas e podendo ser transmitida ao homem, fazendo-se assim necessário o seu controle. Existem grupos de riscos que devem ser controlados através de exames periódicos bem como todo o cuidado com o rebanho para evitar a propagação da doença, que mesmo com o monitoramento de rebanhos, controle de vacinação, certificados de sanidade, continua a ser disseminada (POESTER, 2009). Há algumas profissões que devem ser consideradas de risco no que diz respeito à exposição, como o próprio médico veterinário responsável técnico de lidar com os rebanhos no controle de vacinas bem como sua atuação se necessário no momento do parto e outros profissionais como ordenhadores, os trabalhadores de matadouros, comerciantes de gado e funcionários de linha de produção de produtos oriundos de carne. (CARVALHO M. et al, 1995) 12.1 Zoonose Por se tratar de uma doença que é capaz de ser transmitida de um animal para o ser humano, é considerada uma antropozoonose e nesse caso com o agravante de ser umas das doenças mais importantes e difundidas pelo mundo todo segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). As formas mais comuns de contágio se dê não só pelo contato direto com animais contaminados, mas também pelo consumo de leite cru dos mesmos, por legumes crus que foram contaminados por fezes de animais acometidos ou através da água de poços artesanais contaminados. A Brucella pode permanecer viável por mais de um mês após o abate nas vísceras, medula espinhal e gânglios linfáticos de carnes infectadas e por mais tempo ainda se a carne for resfriada. (SOUZA; et al 1977). Apesar de a brucelose poder se disseminar de forma rápida, não é uma doença de notificação compulsória caso um humano for acometido. Se for constatado um 38 surto da doença, as causas serão investigadas e haverá notificação para um devido controle de uma possível epidemia. (SOARES; et al, 2015) 12.2 Sinais clínicos no ser humano Muitas vezes o tratamento ou mesmo o diagnostico da brucelose em humanos é de difícil observação, pois é uma enfermidade de sintomas variados, podendo ser confundida com várias outras doenças até ser fechado um diagnóstico definitivo. Pode apresentar-se na forma aguda ou latente, caracterizando-se por uma febre contínua, podendo ser também irregular. O indivíduo pode sentir-se por vezes muito cansado, com mal estar, dor de cabeça, fraqueza, sudorese, perda de peso, apatia, além de poder causar endocardite bacteriana, infertilidade eabortamento nas mulheres e infertilidade e dificuldade de ereção no homem e acometer fígado e baço. Apesar da lista de sintomas ser extensa, essa enfermidade pode apresentar-se de forma assintomática dificultando ainda mais o diagnostico, podendo assim chegar a ser uma doença crônica. (SOARES; et al, 2015). 12.3 Prevenção e Tratamento O tratamento preconizado é normalmente realizado com o uso de associações dos antibióticos doxiciclina, rifampicina e tetraciclinas pelo período médio de seis semanas. Dependendo de como se apresentar o paciente, bem como da evolução da doença, pode-se fazer necessário o uso de terapia de suporte, ou mesmo a troca dos medicamentos de protocolo por outros caso haja pacientes considerados de risco, como por exemplo, crianças, idosos e gestantes. O tratamento mais eficaz é a prevenção, controlando o aparecimento de animais positivos, seu descarte e monitorando as propriedades que já tiveram casos positivos. O controle com a alimentação também é necessário e a eficácia de controle dos órgãos de inspeção na indústria tanto de carne como de leite, certificando-se das boas práticas de manejo não só com os animais, mas do controle sanitário nos abatedouros, pasteurização do leite, descarte correto de carcaça contaminada são medidas que impedem a disseminação da doença. O manejo consciente do profissional de veterinária com relação à vacinação e de material de descarte contaminado como os anexos 39 placentários, líquidos fetais e o treinamento adequado de pessoal que lida com o gado. (PNCEBT, 2006). 40 13. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS Se tratando de uma enfermidade contagiosa, causada por uma bactéria que contamina tanto humanos quando animais, a Brucelose provoca diversos prejuízos significantes e torna-se um problema de saúde pública. Portanto, fica claro a importância da conscientização de produtores e consumidores sobre os mecanismos de transmissão, fatores de risco e controle da doença. Deve-se ainda conhecer as normas de profilaxia, diagnóstico e desencadear as medidas responsáveis cabíveis em caso de animais soro positivo e praticar as boas práticas de manejo, afim de evitar a disseminação da doença supra mencionada. 41 REFERÊNCIAS CARVALHO, M. Sousa; BARROSO, M.R.; PINHAL,F.; TAVARES F.Mota BRUCELOSE: ALGUNS ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS. Medicina Iinterna, vol.2, n. 4, 1995 CASTRO, H. A; GONZALES S. R.; PRAT M. I. Brucelosis: una revisión práctica. <http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325- 29572005000200008>. Acesso em: 26 agosto 2016. CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA. Resolução CFMV Nº 714, de 20 de junho de 2002. DIAS, R.A.; et al. Situação epidemiológica da brucelose bovina no Estado de São Paulo. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, supl. 1, p.118-125, 2009. DIVISÃO DE DEFESA SANITÁRIA ANIMAL. INSTRUÇÃO DE SERVIÇO 009/2008 MINISTÉRIO DE AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. PORTARIA N° 11 de 26 de janeiro de 2004. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer. Goiânia, v. 10, n.18; p. 686, 2014 LAGE, ANDREY P; et al. Brucelose bovina: uma atualização. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, v. 32, n.3, p. 202-212, jul./set. 2008. Disponível em <www.cbra.org.br>. Acesso em: 15 ago. 2016. MATHIAS, LUIS ANTONIO. Brucelose animal e suas implicações em saúde pública. Biológico, São Paulo, v.70, n.2, p.47-48, jul./dez., 2008 MINISTÉRIO DE AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal - PNCEBT. Brasilia, 2006. 11-114, 190 p. 42 MINISTÉRIO DE AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. INSTRUÇÃO DE SERVIÇO DDA nº 21 /01 MINISTÉRIO DE AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. INSTRUÇÃO NORMATIVA SDA nº 30 de 07 de junho de 2006 PACHECO, ALESSANDRO MENDES; FREITAS, ELAINE BERNARDINO; BÉRGAMO, MAYARA; MARIANO, RENATA SITTA. A importância da brucelose bovina na saúde pública. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária - ISSN: 1679-7353, Garça, ano VI, n. 11, periódico semestral, 2008 PAULIN, L. M. BRUCELOSE. Artigo de revisão. 2003. Disponível em:< http://www.biologico.sp.gov.br/docs/arq/V70_2/paulin.pdf> Acesso em: 2 setembro 2016. PAULIN, L.M. & FERREIRA NETO, J.S. A experiência brasileira no combate à brucelose bovina. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.69, n.2, p.105-112, abr./jun., 2002 PEREIRA, LUIS PEDRO BAPTISTA. Brucelose em pequenos ruminantes. Portugal. 2015. 44 f. Relatório final de estágio (Mestrado Integrado em Medicina Veterinária) - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, Porto, 2015. PESSEGUEIRO, P.; BARATA, C.; CORREIA, J. Brucelose: uma revisão sistematizada. Medicina Interna, vol. 10, n. 2, p. 91-100, 2003 43 POESTER, F.; et al. Estudos de prevalência da brucelose bovina no âmbito do Programa Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose: Introdução. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, supl. 1, p. 1-5, 2009 SOARES, Catharina P. O. et al. PREVALÊNCIA DA BRUCELLA spp EM HUMANOS. Rev. Latino-Am. Enfermagem. set.-out. 2015;23(5):919-26 SOLA, M. C..; et al. BRUCELOSE BOVINA: REVISÃO. 2014. Disponível em: <http://www.conhecer.org.br/enciclop/2014a/AGRARIAS/Brucelose.pdf> . Acesso em: 25 de agosto 2016. SOUZA, A. P. de et al. INVESTIGAÇÃO DA BRUCELOSE EM BOVINOS E EM CONSUMIDORES HUMANOS DO LEITE. Rev. Saúde públ., S. Paulo 11:238- 47, 1977. WORLD ORGANIZATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE). Disponível em < http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/the-world-animal-health- information-system/oie-list-of-diseases-in-force-in-2005/archives-of-world- animal- health-2003/ > acesso em 18 Novembro de 2016.
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