Biologia Molecular P2

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Biologia Molecular P2
PCR CONVENCIONAL E PCR EM TEMPO REAL (VARIANTE DA PCR)
	#PCR CONVENCIONAL	
PCR é reação em cadeia da polimerase a técnica se baseia na amplificação em vitro de uma sequência única de DNA milhões de vezes, esse DNA pode ser amplificado de qualquer material biológico - para que esta técnica funcione é necessário a reação da PCR em um tubo apropriado, neste tubo é colocado substancias como o DNA a ser amplificado, primers (sequencias de DNA sintetizadas adjacentes a sequência que será amplificada), nucleotídeos, taq DNA polimerase (enzima que auxilia na extensão da cadeia complementar).
	Para a replicação é necessário A leitura da PCR se dá na eletroforese por meio de gel de agarose ou de poliacrilamina 
DNA
Nucleotídeos 
Primers
Enzimas: taq polimerase, helicase
Termociclador
MgC12 (auxilia a taq polimerase) 
Tampão
Tubo cônico (0,2 ml)
Etapas da PCR 
Desnaturação a 95°C > onde ocorre o rompimento das pontes de hidrogênio 
Anelamento dos primers a ± 60°C > iniciadores que delimitam a região amplificada
Extensão da fita a 72°C > adiciona os nucleotídeos para a formação de novas fitas 
		Enzima DNA polimerase add nucleotídeos 5’ 3’. 
**** o ciclo dentro do termociclador demora em cerca de 1h30min 
Para a replicação do DNA na PCR é necessária uma coleta posterior da amostra a ser utilizado, para ocorrer a extração do DNA e consequentemente a PCR 
*** amostras: tecido fresco, sangue, mucosas, bulbo capilar. O EDTA conservara a amostra 
Amplificamos uma região do DNA somente para estudar uma possível variante do DNA, para estudarmos a variante é necessário conhecermos a sequência normal, e é necessário o uso da enzima de restrição. 
	#ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Enzima de restrição é uma tesoura molecular que cliva a molécula em regiões especificas, identificadas por uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida pelo a enzima que chamamos de sitio de restrição. Essas enzimas somente cortam sequencias palíndromos, ou seja, sequencia essa que são iguais em ambos os sentidos quando lindos nas duas direções da dupla fita de DNA. Essas enzimas reconhecem 4 a 6 bases, ao fazer o corte pode forma fragmentos com extremidades cegas, ou extremidades coesivas/ligantes. O que impede da fita se ligar novamente é que a enzima quebra a fita toda não somente a ligação entre os nucleotídeos. 
	*** Os fragmentos cortados são reconhecidos na eletroforese que separa partículas de acordo com a carga elétrica e o peso molecular, nesta técnica é necessário ter A revelação do gel se faz em brometo de etilio (extremamente cancerígeno) 
Uma fonte de energia 
Cuba para eletroforese 
	Esta pode ser horizontal (trabalha com gel de agarose) e vertical (trabalha com o gel de poliacrilamina) 
Tampão 
DNA
Corante 
Padrão de peso molecular
#PCR em tempo real (qPCR)
	Técnica descrita como quantitativa, pois, consegue realizar a quantificação dos ácidos nucleicos de maneira precisa e com mais produtividade, porque determina valores durante a fase exponencial da reação.
A quantificação é exata, pois é baseado na fluorescência – A emissão dos fluoróforos gera um sinal que aumenta na proporção direta da amplificação, ou seja, em cada ciclo os valores de fluorescência são gravados e representa a quantidade de produto amplificado. 
Utilizada p/ quantificar vírus 
Trabalha com fluorescência
Até 200pb para amplificar, facilitando a tarefa de quantificação da expressão genica 
Detecta fluorescência syber green (agente ligante)
Sonda hidrolise
Syber green é usado como um corante que se liga a dupla fita de DNA, a emissão de fluorescência é proporcional ao número de moléculas e ao tamanho do amplicon 
 ***Liga entre a fita dupla de DNA e com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador, emite uma fluorescência verde. As vantagens da utilização do Syber Green são: baixo custo, facilidade no uso e sensibilidade. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita dupla que surge durante a reação, incluindo os dímeros dos iniciadores e outros produtos inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento alvo. 
***a desnaturação não emite sinal 
Em resumo a qPCR identifica o DNA alvo com maior sensibilidade, uma vez que a detecção da amplificação é feita através da captação de fluorescência. Esta técnica apresenta também maior especificidade devido a utilização de uma sonda especifica para o fragmento alvo da reação. A amplificação e a detecção do DNA são realizadas em um sistema fechado, dispensando procedimentos adicionais como a corrida eletroforetica dos produtos em gel de agarose e fotodocumentação. Com eliminação dessas etapas os resultados são obtidos mais precocemente em qPCR quando comparados em PCR convencional 
#TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-PCR) 
	RT-PCR é uma reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase. Não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
	É necessária ligação ao RNA e a ligação da transcriptase reversa a uma “cadeia” de poli T, pois sempre ao final da cadeia de mRNA existe uma “cauda” de poli A.
	A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. A expressão para produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo: células cardíacas expressam proteínas diferentes de células musculares, por exemplo.	
***Essa enzima transforma o RNAm em cDNA (DNA codificante). A alteração genica produz um RNAm diferente do normal, e para estudar esse gene alterado o RNAm é transformado em cDNA para ser amplificado fois a PCR só trabalha com DNA. 
VARIABILIDADE GENETICA
Crossing over (meiose) –fonte de recombinação e variabilidade genética (cromossomos homólogos, pareamento em homologia) 
Variações no genoma (mutação) – qualquer sequência de nucleotídeos ou arranjos do DNA fora do normal 
Mutação genômica: aneuplodias/alteração no número de cromossomos 
Mutação cromossômica: são mudanças envolvendo apenas uma parte de um cromossomo, tais como duplicações, deleções, inversões e translocações, as quais podem ocorrer espontaneamente ou resultar de segregação anormal de cromossomos translocados durante a meiose.
Mutação genicas: mudança sequencias de DNA que altera apenas um único nucleotídeo ou muitos pares de bases 
***as mutações podem ser espontâneas ou induzidas por agentes físicos ou químicos, chamados mutagenos 
#Mutação de ponto ou monogênica: uma única substituição de nucleotídeos em uma sequência de DNA pode alterar o código de uma trinca de bases e causar substituição de um aminoácido por outro produto gênico. 
***a substituição pode causar ou não uma substituição de aa uma vez que o código genético é degenerado 
Mutação de transição: troca de bases de púricas por púricas (A/G) ou pirimídicas por pirimídicas (C/T)
Mutação de transversão: pirimídica por púrica 
Mutação de sentido trocado: troca somente um aa
Mutação sem sentido: esta classe é identificada quando uma mutação pontual no DNA causa, na sequência do RNAm, a substituição do códon normal por um dos três códons terminais. Como consequências da formação de um códon de parada prematuro, o RNAm carregando a mutação é frequentemente instável, e não é possível a sua tradução; e mesmo que o RNAm esteja estável o bastante para ser traduzido, a proteína gerada será truncada e normalmente tão instável que será rapidamente degradada. 
Mutação silenciosa: quando a mudança não troca o produto final. 
Mutação neutra: quando não altera o aspecto clinico, não altera a função do produto final. 
Mutação no promotor: pode diminuir a afinidade do RNA polimerase por um sitio promotor – produção reduzida de um RNAm – diminuição na produção de proteína. 
	Principaismétodos de análise do DNA e RNA 
Qualitativos: detecta a presença ou ausência de material nucleico de um microrganismo ou de determinada mutação ou sequencia genica 
Quantitativos: número de microrganismo é quantificado em um volume definido da amostra biológica 
SEQUENCIAMENTO DO DNA
	Sequenciamento manual – método – capacidade de replicar o fragmento com a utilização do DNA polimerase e primer com marcação radioativa de ddNTPs
	***marcação com P32 (radioativo) na porção inicial ou terminal da região a ser sequenciado. Realizar a reação com 4 tubos diferentes 
Método de sequenciamento: 
	#MÉTODO MANUAL 
	Frederick sanger (década de 70) fez a utilização de nucleotídeos modificados. É baseado na incorporação de desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) a uma cadeia de DNA em crescimento, tendo como molde o DNA de interesse. Quando os ddNTPs são adicionados, a extensão da cadeia é interrompida pois esses didesoxinucleotídeos não apresentam um grupo hidroxila (OH) 3’ necessário para a ligação do próximo desoxinucleotídeo (dNTP). Como esses ddNTPs são marcados, podem ser detectados e a sequência dos nucleotídeos identificada. 
	Para isso são preparados 4 tubos de reação, cada um contendo o DNA molde, a DNA polimerase e um primer. Cada tubo recebe uma pequena quantidade de ddNTP (dATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP) junto com um dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP ou dGTP) marcados com fósforo radioativo (P32). Em qualquer um dos 4 tubos serão produzidos vários comprimentos de cadeia, cada um correspondente ao ponto no qual o respectivo ddNTP desse tubo foi incorporado e ocasionando o término do crescimento da cadeia.
	***esse procedimento é lido através do gel de poliacrilamina que consegue diferenciar base por base na corrida eletroforetica. 
	#METODO AUTOMATICO 
	O sequenciamento automático utiliza sequenciadores com eletroforese vertical em placa ou eletroforese em capilar onde os próprios ddNTPs possuem marcação com fluorescência, ao contrário do método manual, em que estes apresentam marcação radioativa.
	Após a reação de sequenciamento, os produtos são purificados para a remoção dos nucleotídeos não incorporados e demais reagentes, para não interferir na leitura quando submetidos ao sequenciador automático. Logo após a purificação os produtos são submetidos ao sequenciador automático, cujo princípio é o da eletroforese. Os fragmentos marcados com fluorescência migram ordenadamente no interior dos capilares e à medida que são excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda que são detectados por um fotomultiplicador. Em seguida essa informação é transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida, os dados possam ser recuperados em formato de eletroferograma (gráfico) ou de texto, seguindo-se da análise de bioinformática.
	#FISH
	Técnica bastante utilizada para detectar rearranjos subteloméricos é a de FISH, na qual sondas fluorescentes específicas são hibridizadas ao cromossomo-alvo. Com essa técnica é possível a identificação dos segmentos pela homologia entre as sequências do DNA e não mais pela similaridade das bandas visíveis na análise convencional. Assim, podem ser observados rearranjos cromossômicos e deleções submicroscópicas menores do que 2 – 3 Mb, não visíveis em técnicas de bandamento convencionais.
	 Utilizando essa técnica, as deleções podem ser detectadas pela ausência de sinal e as trissomias pela presença de três sinais nas porções finais dos cromossomos. A localização dos sinais é evidente a partir da caracterização citogenética, de modo que translocações balanceadas e não balanceadas podem ser identificadas
	#MLPA (Multiplex ligation – dependent probe amplication) 
		Triagem genômica quantitativa alvo-especifico 
	Objetivo consiste em detectar alterações no número de cópias ao nível genômica (ganhos e perdas) em comparação com amostras controlo. 
É preciso saber a clínica do paciente para fazer a MLPA por a mesmo ser especifica
Trabalha em +- 40 regiões genômicas 
PCR multiplex 
Técnica de MLPA trabalha com 
Genotipagem 
N° de copias 
Metilação 
Expressão 
Deleção de 40 – 50 sequências genômicas 
Pequenos rearranjos (BRCA1 e 2, MSH2)
Rearranjos maiores (síndrome de genes contíguos)
Alteração no n° dos cromossomos
É indicada quando há
Malformação congênita 
Doenças raras 
Câncer 
Deficiência intelectual 
Deficiência reprodutiva 
Perfil de metilação ***
***Ex. Sindrome de prader willi ou síndrome angelman 
Ambas têm a mesma região alterada, porém se a alteração for de origem paterna sera a prader wili e se for materna angelman. 
A alteração se encontra no cromossomo 15 
Região de impriting (relacionada com a origem parental)
Essas síndromes podem ocorrer por 
Deleção 
Metilação (gene se encontra com a expressão inibida)
UDP (dissomia uniparenteral aparece quando um indivíduo herda duas cópias de um par de cromossomos de um progenitor e nenhuma cópia do outro)
		Técnica 
Ocorre em mais de 1 região DNA do paciente não será amplificado. É usado somente como molde para as sondas
Depende da ligação de uma sonda 
	 Essa técnica é constituída por 4 fases: 
Desnaturação do DNA 
Sonda se liga ao DNA (hibridização)
Fase de ligação 
PCR (amplificação)
	Nas duas primeiras fases o DNA é desnaturado e depois hibridizado a uma mistura de sondas. A sonda MLPA consiste em dois oligonucleotideos os iniciadores primers marcados com fluoróforos e uma sequência Stuffer. Quando a uma sequência alvo na amostra as duas sondas de hibridizam, são unidos pela enzima ligase depende da temperatura (fase de ligação) dessa forma, como resultado da reação de ligação, são obtidos fragmentos únicos. Após a ligação, inicia-se a fase de amplificação, na qual os fragmentos formados pelas duas sondas, agora unidas, são amplificados por PCR. Em seguida, os fragmentos são analisados por eletroforese capilar 
***Cada sonda possui uma sequência Stuffer diferente 60-450pb para diferenciar os fragmentos amplificados, os primers são os mesmo em todos os kits MLPA
	#ARRAY 
		Triagem genômica completa (varia conforme resolução da lamina) 
	A técnica de Array-CGH (Hibridização Genômica Comparativa), assim como a de FISH, é capaz de detectar perdas e ganhos cromossômicos, e diferentemente da análise citogenética convencional, dispensa a cultura celular para a obtenção de preparações metafásicas do indivíduo a ser examinado, utilizando, para tanto, o seu DNA. Além disso, não há desvio para a análise de uma região cromossômica específica, ou seja, todo o genoma é analisado. Por quê sequenciar os exons?
85% das mutações se encontra nos exons que representa 1-3% do genoma 
	Outras técnicas array. 
SNP-ARRAY 
BEAD-ARRAY 
	#NGS (sequenciamento de nova geração)
		Sequenciamento de diferentes genes e regiões em um único experimento. 
	#TRANSCRIPTOMA 
		Analise dos transcritos 
	#SOUTHERN BLOTTING 
	Método empregado para análise de sequencias de DNA aderidos a filtros ou membrana, o DNA após extraído das células ou tecidos, após digestão com enzima de restrição é submetido a eletroforese em gel para separação dos fragmentos, segue-se a desnaturação das moleculas e transferidas para membranas por capilaridade. A transferência segue-se as etapas de hibridação, a marcação pode ser feita por radioisótopos ou pela adição química de grupos reativos ou enzimáticos. 
***No geral a tecnica de Southern blotting é uma sonda radioativa de DNA hibridizada com o DNA na membrana. Detecta polimorfismo (diferenças na sequência de bases sem consequências patológicas diretas) de DNA ou mutação. 
	Aplicação
Alteração em um único cromossomo, deleção, inserção, deleções e rearranjos, ordenamento de fragmentos de DNA em um mapa físico. 
	#NORTHEN BLOTTING 
	Funciona como o Southern blotting a diferença é que o Northen trabalha com RNA em quanto o Southern trabalha com DNA 
Investiga expressão genica 
Sensibilidade a RNAses 
Transferência para membrana por capilaridade 
#WESTERN BLOTTING 
	Utilizado para imunodetecçãode proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana. Esta técnica permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em determinada amostra. A transferência para membrana ocorre por força elétrica e a revelação do sistema com anticorpos secundários fluorescentes ou radioativos
Corrida proteica em gel de poliacrilamina 
Usa-se em investigação de HIV (forma clássica)
Trabalha com anticorpos mono ou policlonais