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TECNICAS HISTOLOGICAS

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ÍNDICE
	ASSUNTO
	PAG.
	Métodos de exame....................................................................
	2
	Etapas de preparo dos cortes
	
	 Colheita de material .............................................................
	3
	 Fixação ................................................................................
	4
	 Fixadores simples ................................................................
	6
	 Misturas fixadoras ................................................................
	7
	 Processamento da fixação ..................................................
	11
	 Desidratação.........................................................................
	13
	 Clarificação ou diafanização ................................................
	13
	 Impregnação ........................................................................
	14
	 Microtomia ...........................................................................
	14
	Etapas da coloração .................................................................
	17
	Microscopia óptica
	
	 Histórico ............................................................................... 
	27
	 Poder de resolução ..............................................................
	29
	 Microscopia de contraste de fase ........................................
	30
	 Microscopia de polarização .................................................
	30
	 Microscopia confocal ...........................................................
	31
	 Microscopia de fluorescência ..............................................
	32
	Microscopia Eletrônica ..............................................................
	32
TÉCNICAS HISTOLOGICAS
1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS:
		A maior parte do nosso conhecimento sobre a natureza microscópica do organismo resulta da remoção de pequenas amostras representativas de tecidos ou órgãos, cortadas em fatias muito delgadas, conhecidas como “cortes histológicos”, apropriadas para o estudo ao microscópio. Os cortes devem ser suficientemente finos de modo a permitirem a passagem de feixes de luz. No microscópio óptico comum, o feixe de luz vem de baixo para cima e deve atravessar toda a espessura do corte, antes de atingir a lente objetiva, a lente ocular e, finalmente, o olho do observador. 
 O propósito fundamental da técnica histológica é obter cortes bastante finos para que não haja superposição de componentes celulares do tecido, pois do contrário, não poderiam ser visualizados como entidades separadas. Por isso os cortes são seccionados em fatias mais delgadas do que o diâmetro da maioria das células, e este trabalho de seccionamento é realizado através de um aparelho denominado micrótomo.
	Para serem examinados ao microscópio óptico, em geral os cortes são preparados pela técnica de parafina, cujas seqüências serão descritas a seguir:
2 - MÉTODOS DE EXAME OU MÉTODOS HISTOLÓGICOS 
		São procedimentos diversos que no final os fragmentos de tecidos ou órgãos tornam-se examináveis ao microscópio óptico.
		Os métodos de exame podem ser divididos em imediato e mediato.
2.1. IMEDIATO (IN VIVO)
2.1.1. Sem coloração - é o exame a fresco, sem reativos modificadores. O exame a fresco baseia-se nas diferenças de índice de refração das células ou tecidos. Por exemplo, os protozoários, larvas de insetos, hemácias, leucócitos, células descamadas são interpostas entre a lâmina e lamínula de vidro, com um “líquido indiferente” e observados ao microscópio óptico. 
 Os líquidos indiferentes são isotônicos e podem ser (soro, plasma, líquido amniótico, líquido ascítico, humor aquoso) e artificial (solução salina fisiológica a 0,9%, líquido de Ringer, líquido de Loeke e solução de Tyrode).
 2.1.2. Com coloração - Também conhecida como coloração vital que aumenta o índice de refração de algumas estruturas, realçando-as. A coloração intravital é a introdução de corante vital no animal vivo pela ingestão, inoculação do corante no sangue, linfa ou tecido subcutâneo ou imersão nos corantes (ex.: protozoários). 
 Corantes vitais - São soluções diluídas de corantes naturais ou artificiais atóxicos.
2.2. MEDIATO (EXAME POST-MORTEM)
 		Necessita de: colheita de material, fixação, obtenção de cortes histológicos e coloração. O método mediato permite a preparação de cortes histológicos permanentes.
 
 
3 - ETAPAS DE PREPARO DE CORTES 
 
COLHEITA DE MATERIAL
		Uma das condições básicas para uma boa fixação e consequentemente, preservação do material é que o fixador seja aplicado às amostras coletadas (fragmentos de tecidos ou órgãos) tão cedo quanto possível após a coleta cirúrgica ou post-mortem. Portanto, é particularmente necessário que antes do sacrifício do animal todos os instrumentos de necropsia e fixadores estejam preparados e reunidos no local de trabalho em ordem operacional. Este procedimento facilitará um trabalho rápido e produtivo, evitando alterações das estruturas celulares (autólise).
		Na colheita do material, tão logo o animal esteja anestesiado ou morto deve ser dissecado rápida e cuidadosamente a fim de evitar a autólise. Na obtenção do fragmento deve haver um mínimo de manipulação, evitando-se pensamento ou esmagamento com instrumentos inadequados. Para cortar o órgão ou fragmento de tecido devem ser usadas lâminas bem afiadas. O uso de instrumentos estragados ou cegos comprime o material e distorce a disposição estrutural das células e dos elementos tissulares. Devemos imprimir aos instrumentos cortantes um “movimento de serra” para obtenção de cortes ideais, recorrendo o menos possível à pressão.
		Como já foi salientado, o material colhido, e posteriormente processado, deve ser adequado ao estudo proposto. Assim é conveniente saber, se possível com antecedência, quais os órgãos ou tecidos que devem ser obtidos e nestes, quais as áreas mais significativas para o estudo proposto. Por exemplo, os órgãos, os tecidos ou as áreas prioritárias são aqueles onde há interesse na histologia ou evidência de lesões macroscópicas quando o interesse está voltado a histopatologia. Cortes ou pequenas fatias devem ser retiradas de várias partes normais, lesionadas, assim como das áreas de transição de acordo com o estudo em proposição.
		Quando ocorre a remoção de vários órgãos a serem fixados, cada órgão deve ser dissecado o mais rápido possível e colocado imediatamente no líquido fixador inicial (pré-fixação), tendo-se o cuidado de secciona-lo em fatias. No final da necropsia, os órgãos previamente fixados deverão ser convenientemente recortados em finas fatias e colocados nas soluções fixadoras definitivas. Se possível, as fatias não devem ultrapassar 0,5 mm de espessura; em alguns casos, fatias ainda mais finas são necessárias para que o líquido fixador possa penetrar rápido e homogeneamente.
		Se os órgãos a serem removidos são os do tubo digestivo, devem ser logo recortados e fixados, pois a membrana mucosa é bastante suscetível de sofrer autólise ou alterações post-mortem. Os intestinos são mais bem tratados através de uma irrigação com solução salina, a fim de se remover o conteúdo intestinal e, em seguida, devem ser recortados em porções e mergulhados no líquido fixador. Pode-se também afixar uma porção do órgão à superfície inferior de uma placa de cortiça posta a flutuar na solução fixadora. 
		O processo autolítico post-mortem é mais rápido nos órgãos produtores de enzimas, como a glândula salivar, o estômago, o fígado, o pâncreas e o intestino, sendo mais lento nos tecidos de sustentação, como o conjuntivo. Desse modo, aqueles órgãos suscetíveis à autólise devem ser colhidos e fixados em primeiro lugar.
		Os órgãos ocos devem, de